Name: Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Impara la coltura cellulare su membrane di nitruro di silicio e la criopreparazione per l'analisi elementare con fluorescenza a raggi X di sincrotrone. Questo metodo preserva la struttura cellulare per la mappatura del potassio, zolfo e zinco.

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Gli esperimenti sulla nano-imaging trave ID16A sono stati eseguiti nel quadro delle proposte ESRF LS2430, LS2303 e LS2765.

<ol><li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage%2Fgenotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li>
<li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angwendte+Chemie%22%5BJournal%5D)">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li>
<li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJanssens%2C+K+%22Microscopic+X-Ray+Fluorescence+Analysis%22">Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis</a>. , Wiley. Chichester, UK. (2000).</li>
<li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity%2C+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions%2C+and+down+regulation+of+MAO-B%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li>
<li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li>
<li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li>
<li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).</li>
<li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).</li>
<li>Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li>
<li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).</li>
<li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography%3A+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li>
<li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy%3A+the+cool+combination+in+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li>
<li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li>
<li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MISTRAL%3A+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li>
<li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarzaniga%2C+R+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 124, Academic Press. 151-175 (2014).</li>
<li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Atomic+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li>
<li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li>
<li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368(2015).</li>
<li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li>
<li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li>
<li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Synchrotron+Radiation+News%22%5BJournal%5D)">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li>
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<li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li>
<li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li>
<li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li>
<li>Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Techniques%22%5BJournal%5D)">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

La microscopia crioelettronica (crio-EM) ha vinto il Premio Nobel per la chimica 2017 e come tale lo sviluppo di J. Dubochet sulla vetrificazione del materiale biologico per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle biomolecole nella soluzione25. Come riportato da Dubochet nella sua lezione di Nobel "Sapere come vinificare una goccia d'acqua è una cosa, preparare un campione biologico per l'osservazione biologica è un altro"25. I passaggi di criopreparazione sono ora considerati la tecnica standard per mitigare i danni alla dose di radiazioni e studiare le cellule vicine al loro stato nativo. La preparazione rimane però noiosa. Questo perché la microscopia elettronica, a causa della sua risoluzione spaziale insuperabile, è sensibile a qualsiasi artefatto ultrastrutturale che si verifica durante la preparazione del campione. Le crionde di sincrotrone si stanno ora avvicinando a difficoltà simili che si stanno abgiusto per raggiungere risoluzioni spaziali a partire da 13 nm nell'intervallo a raggi X ad alta energia26. La microscopia a raggi X duro è in grado di analizzare intere cellule, mentre la microscopia elettronica soffre della scarsa profondità di penetrazione degli elettroni, consentendo di osservare solo fette cellulari molto sottili.
I monostrati delle cellule sono abbastanza sottili da raggiungere il congelamento dei mmeriti nell'etano liquido. In teoria, sono possibili velocità di raffreddamento fino a 108 K/s utilizzando il congelamento ad alta pressione27 che consente la vetrificazione di campioni troppo spessi per il congelamento dei mmeriti. Una velocità di raffreddamento di 105 K/s, necessaria per consentire la vetrificazione completa del campione a pressione ambientale28, viene raggiunta riproducibilmente utilizzando la macchina di congelamento automatica del tuffo e i parametri qui presentati. Ciò consente a un ricercatore di vinificare campioni biologici sottili (<10 m) come un monostrato di cellule12,13,14,15,29,30 mediante il congelamento dei guasti liquidi in etano liquido.
Una sfida importante con questo protocollo è anche quello di preservare il più possibile l'integrità chimica del contenuto intracellulare per fornire distribuzioni elementali affidabili all'interno della cellula in 2D o 3D. Come pubblicato altrove2,16,17,31, nel caso dell'imaging elementare a livello subcellulare, l'analisi delle cellule idratate congelate dovrebbe essere considerata. In caso contrario, la combinazione di congelamento del guasto e congelamento delle cellule può essere utilizzata per l'analisi della temperatura ambiente. Per quest'ultimo, il ghiaccio amorfo viene rimosso attraverso il processo di sublimazione, mentre le molecole d'acqua rilegate vengono rimosse attraverso il processo di desorpazione. Questo processo può essere tutt'altro che ideale rispetto ai campioni idratati congelati a causa della possibile alterazione delle membrane cellulari e della morfologia di alcune strutture subcellulari32. Inoltre, per gli studi di speciazione, l'estrazione dell'acqua può portare a manufatti di speciazione metallici. Tuttavia, ha avuto successo e la migliore alternativa ai campioni idratati congelati per l'imaging elementare a sotto-100 nm livelli2,16 ,17,18,20,33,34,35,36.
Come è stato riportato37, la qualità dei preparati cellulari crioconservati può essere valutata attraverso il rapporto potassio-sodio K/Na. Purtroppo, non è ancora possibile determinare con la nanosonda a raggi X dura utilizzata qui, a causa del taglio a bassa energia del rilevatore di deriva di silicio utilizzato per rilevare i fotoni a fluorescenza a raggi X degli elementi (E - 1,3 keV magnesio). Infatti, un alto rapporto K/Na (>10) che può essere misurato utilizzando TOF-SIMS, EPMA, o microprobe nucleare PIXE16,37 è indicativo dell'integrità chimica conservata della cellula rispetto al K/Na previsto di 25 in una cellula vivente37. Questo può essere supportato da un concomitante basso rapporto Cl/K38. Tuttavia, la vetrificazione imperfetta, in particolare se la velocità di raffreddamento del campione è troppo bassa, può portare alla formazione di grandi cristalli di ghiaccio che possono danneggiare le membrane cellulari e gli organelli, alterando di conseguenza la distribuzione di elementi chimici. Anche se non esiste una procedura di routine per monitorare questo potenziale danno e impatto sulla distribuzione intracellulare, i rapporti elementali di cui sopra e la possibilità di immagine della cellula ad alta risoluzione utilizzando il contrasto di fase a raggi X o la microscopia a raggi X crio-morbida possono essere i migliori approcci per supportare una buona conservazione dei compartimenti intracellulari con la conservazione concomitante dell'integrità elementare. La combinazione di queste tecniche e l'uso di microscopi ottici a fluorescenza criofrontelita di recente sviluppo aiuteranno a valutare in che misura si verifica questo danno e colpisce la distribuzione elementale intracellulare.
Nel complesso, viene presentato un protocollo dettagliato e completo per preparare campioni cellulari per la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X del sincrotrone. È un buon punto di partenza per la comunità di ricerca, aiutando a risolvere il difficile problema di come preparare campioni cellulari appropriati per l'imaging elementare 2D e 3D a (crio) nanoprobe a raggi X duri. Questi approcci possono essere uniti a fluorescenza ottica e capacità di microscopia elettronica per l'imaging chimico e strutturale correlatoale approfondito delle cellule.

Le nanosonda a raggi X a raggi X (SR-XRF) di nuova progettazione consentono la visualizzazione della distribuzione subcellulare degli elementi in modo completamente quantitativo. Ad esempio, questa capacità analitica consente di esaminare l'assorbimento di nanoparticelle1 o molecole organometallici come i complessi a base di osmio2,fornendo informazioni sull'assorbimento intracellulare di molecole a base metallica con potenti proprietà anticancro. Come tecnica multielemento, SR-XRF3 con una nanosonda fornisce un modo per quantificare e localizzare simultaneamente elementi intracellulari più biologicamente importanti, tra cui fosforo, zolfo, potassio, calcio, ferro, rame e zinco. Infatti, l'uso di raggi X duri fornisce una grande profondità di penetrazione per l'immagine di intere cellule idratate congelate in modo privo di etichette. Inoltre, fornendo l'accesso al bordo K della maggior parte degli elementi di interesse, la fluorescenza a raggi X è eccitata in modo più efficiente. L'uso di approcci criogenici consente la riduzione dei danni da radiazioni e l'ottimizzazione della conservazione della struttura cellulare e della distribuzione elementale.
La maggior parte delle tecniche analitiche a risoluzione spaziale disponibili per studiare i metalli nelle cellule sono tecniche di superficie che richiedono sezioni di cellule molto sottili e piatte da produrre. Ciò comprende principalmente la microscopia elettronica a trasmissione a scansione con analisi a raggi X dispersiva di energia (STEM-EDX), la microscopia elettronica a trasmissione filtrata dall'energia (EF-TEM) e la spettrometria di massa iografica secondaria su nanoscala (nanoSIMS). Quest'ultimo non può essere eseguito su sezioni cellulari congelate e idratate, mentre la crio-analisi può essere fatta con microscopia elettronica con risoluzione spaziale insuperabile ma scarsa sensibilità elementare. L'emissione di raggi X indotta dalle particelle (PIXE) ha permesso lo studio delle distribuzioni elementali in celle intere. Ha il vantaggio di essere completamente quantitativo con una giusta sensibilità elementale su scala micron e anche con risoluzione submicron4, ma soffre di danni da radiazioni e mancanza di capacità criogeniche per studiare le cellule idratate congelate. Tutte queste tecniche analitiche si completano a vicenda nell'imaging elementare delle cellule, ma per tutte le tecniche la procedura di preparazione del campione è un passo cruciale. Per ottenere risultati significativi, è consigliabile limitare la possibile contaminazione e la ridistribuzione elementare e/o le perdite. Come dimostrato nella microscopia elettronica, un flusso di lavoro criogenico, compreso crio-immobilizzazione della cellula e criotrasferimento a una fase di crioscansione, consente una conservazione elementare ottimale a livelli subcellulari il più vicino possibile allo stato nativo5,6,7,8,9,10. Questa comprensione è stata implementata con successo nello sviluppo della microscopia a raggi X crio-morbida del synchrotron (ad esempio, microscopi a campo completo e microscopi a scansione) per produrre immagini ultrastrutturali di intere cellule idratate congelate in 2D o 3D. Vari flussi di lavoro criogenici sono stati sviluppati11 per microscopi a raggi X morbidi a Beamline 2.1 (XM-2) dell'Advanced Light Source presso il Lawrence Berkeley National Laboratory12, beamline U41-XM presso l'anello di stoccaggio degli elettroni BESSY II (Germania)13, fascio MISTRAL della sorgente luminosa ALBA (Spagna)14, e a Beamline B24 della fonte di luce15. Un flusso di lavoro simile è stato recentemente dimostrato di essere il metodo di preparazione e conservazione più affidabile per l'analisi elementale intracellulare utilizzando microsonde a raggi X16,17.
Anche se le tecniche di nanosonda a raggi X stanno iniziando ad essere ampiamente utilizzate per l'analisi degli elementali cellulari, in particolare con l'avvento delle capacità criogeniche SR-XRF, nessun protocollo graduale è stato diffuso finora alla comunità di ricerca. Qui viene fornita una procedura dettagliata per preparare cellule aderenti criofisse coltivate come monostrati su membrane di nitrato di silicio da analizzare in condizioni criogeniche. Viene fornita anche una fase di congelamento dell'essiccazione dopo il protocollo nel caso in cui l'analisi a raggi X debba essere eseguita a temperatura ambiente. Mentre il protocollo proposto è stato utilizzato con successo con le cellule di cancro al seno umano MD-MB-2312 e l'essiccazione congelato è stata dimostrata tra gli altri su neuroni del topo18,20,21, può essere facilmente esteso a vari tipi di cellule umane o animali.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di acetato di ammonio, BioUltra, per biologia molecolare, ~5M in H2O</td><td>SIGMA</td><td>09691-250mL</td><td>Si può preparare la soluzione richiesta da polvere di acetato di ammonio di alta qualità e acqua ultrapura, il pH e l'osmolarità devono essere regolati comunque.</td></tr><tr><td>Integratore di B27, 50x</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>per la coltura dei neuroni dell'ippocampo</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>DMEM con rosso fenolo/Glutamax I (modifica ATCC media)</td><td>GIBCO</td><td>21885025</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>31966-02</td><td>per la coltura dei neuroni ippocampali</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5, diritte autochiudenti, punte 0,05x0,01 mm, Biology</td><td>World Precision Instrument</td><td>501202</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore EM raffreddato a Peltier Emitech K750X</td><td>Quorum Technology</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>Etano N45</td><td>Aria Liquido</td><td>p0505s05r0a001</td><td>C2H6 > 99,995 % </td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, Performance Plus, formato One Shot certificato, origine USA</td><td>GIBCO</td><td>A31604-02</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>per coltura di neuroni ippocampali</td></tr><tr><td>Leica GP pinza a sgancio rapido Leica 16706435</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare MDA-MB-231, un adenocarcinoma epiteliale umano</td><td>ATCC</td><td>ATCC Coltura cellulare HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>per la coltura di neuroni ippocampali</td></tr><tr><td>Nunc 4-Well Plate</td><td>Thermo Fisher</td><td>176740</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Osmo1 Micro-osmometro a campione singolo</td><td>Strumenti avanzati</td><td>Osmo1</td><td>Alternative può essere trovato presso Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&reg; </td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>È possibile utilizzare un altro tipo di rivestimento che dipende dal tipo di cellula da coltivare sulla membrana, altri fattori di adesione come fibronectina, collagene, poliornitina possono essere testati di conseguenza. La cellula può essere coltivata direttamente sulla membrana in nitruro di silicio, ma quest'ultima è leggermente idrofoba e si raccomandano fattori di adesione a meno che la membrana non venga trattata per essere idrofila (scarica di plasma glow</td></tr>).<tr><td>Robot di congelamento a tuffo Leica EM GP unità principale</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>Le alternative allo stantuffo automatizzato sono il Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). È possibile utilizzare un sistema manuale fatto in casa, ma una camera a controllo ambientale è un vantaggio per il congelamento a tuffo.</td></tr><tr><td>Membrana in nitruro di silicio (Si3N4)</td><td>Silson Ltd.</td><td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td><td>Il tipo di membrana in nitruro di silicio proposto è ottimizzato per l'analisi presso la nanosonda a raggi X ID16A ESRF, lo spessore di 500 nm della membrana è stato scelto per essere più robusto per la manipolazione cellulare e la criofissazione dettagliate all'interno di questo protocollo. La membrana con spessore di 200 nm o inferiore può essere utilizzata anche se piuttosto fragile, e altri design di membrane in nitruro di silicio possono essere acquistati (ad esempio membrana compatibile TEM...) da Sislon o da altre aziende come Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano 0,4%</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>colture cellulari</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,05%</td><td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td>coltura cellulare</td></tr><tr><td>Grado di analisi elementare Ultratrace, acqua ultrapura L'acqua</td><td>Fisher Chemicals</td><td>W9-1</td><td>MilliQ può essere utilizzata, ma deve essere testata per il livello di contaminazione degli oligoelementi utilizzando, ad esempio, l'analisi ICP-MS.</td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman n. 1 con foro pretagliato</td><td>Leica</td><td>16706440</td><td>È possibile utilizzare carta da filtro alternativa e deve avere un diametro esterno di 55 mm, è possibile utilizzare il Punch per il sistema di carta da filtro di Leica (rif.16706443).</td></tr></tbody></table>

coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi x del sincrotrone nano-analisi

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Si sa molto poco sulla distribuzione di ioni metallici a livello subcellulare. Tuttavia, tali elementi chimici hanno funzioni normative essenziali e la loro omeostasi disturbata è coinvolta in varie malattie. Le nanosonda a fluorescenza a raggi X del sincrotrone all'avanguardia forniscono la sensibilità e la risoluzione spaziale necessarie per chiarire la distribuzione e la concentrazione bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) di metalli all'interno di intere cellule livello di organello. Questo apre nuovi interessanti campi scientifici di indagine sul ruolo dei metalli nella fisiopatologia della cellula. La preparazione cellulare è una procedura chiave e spesso complessa, in particolare per l'analisi di base. Sebbene le tecniche di fluorescenza a raggi X siano ormai diffuse e siano stati utilizzati vari metodi di preparazione, pochissimi studi hanno studiato la conservazione del contenuto elementare delle cellule nella migliore delle due opzioni e nessun protocollo dettagliato graduale per la criopreparazione finora sono state rilasciate cellule aderenti alle nanosonda a fluorescenza a raggi X. Questa è una descrizione di un protocollo che fornisce la preparazione cellulare graduale per la criofissia rapida per consentire la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X del sincrotrone delle cellule in uno stato idratato congelato quando è disponibile un ambiente criogenico e un trasferimento. Nel caso in cui la nanoanalisi debba essere eseguita a temperatura ambiente, viene fornita una procedura aggiuntiva per l'essiccazione congelata della preparazione cellulare dell'aderente criofissa. I protocolli proposti sono stati utilizzati con successo in lavori precedenti, più recentemente nello studio della distribuzione intracellulare 2D e 3D di un composto organometallico nelle cellule del cancro al seno.

Una tipica vista al microscopio video ottico delle cellule MDA-MB-231 congelate idratate che sono state sub-coltivate su un supporto a membrana Si3N4 rivestito in poli-L è mostrato nella Figura 7A. La vista ottica del campione nella camera a vuoto è stata ottenuta in modalità di riflessione utilizzando il microscopio video online dedicato della trave ID16A dell'ESRF22. Mentre la microscopia a raggi X o a raggi X morbida richiede che lo strato di ghiaccio che incorpora la cellula sia il più sottile possibile (tipicamente &lt;0,5 m), i raggi X duri (&gt;10 keV) hanno il vantaggio di una profondità di penetrazione molto più elevata e di una deposizione della dose più bassa. Lo spessore del ghiaccio può quindi essere maggiore, in genere &lt;10 m compresa la cella, in modo che il ghiaccio che incorpora la cella sia di pochi metri di spessore. Questo può essere stimato attraverso l'intensità dei raggi X misurata nella trasmissione rispetto all'intensità senza il campione, tenendo conto dell'assorbimento della membrana Si3N4 spessa 500 nm. Questo spessore di ghiaccio può essere raggiunto attraverso il gonfiore manuale come descritto nel presente protocollo. Nella regione degli anelli di Newton, lo spessore del ghiaccio può essere ancora più sottile (non misurato).
La mappatura elementare a fluorescenza a raggi X della cellula idratata congelata è illustrata nella Figura 7B con le distribuzioni rappresentative di elementi fisiologici come il potassio (K), lo zolfo (S) e lo zinco. Queste mappe rappresentano la massa elementare elementare dell'atale (cioè la massa proiettata elementale). Anche se non vengono eseguite nel caso di specie, tali mappe possono essere normalizzate attraverso l'imaging a contrasto di fase basato sulla propagazione dei raggi X che fornisce la stima della massa proiettata del campione23. Come riportato da molti studi, il ione K altamente diffusibile nelle cellule conservate nel loro stato quasi nativo è stato supposto per essere distribuito omogeneamente in tutta l'intera cella23,24,16. Come mostrato nelle immagini elementali della fluorescenza a raggi X 2D nella Figura 7B, l'elemento strettamente legato S è stato distribuito uniformemente all'interno della cella, in modo simile a K, e rappresenta una buona stima del profilo di massa cellulare. La distribuzione di Nn aveva un segnale più alto nel nucleo che nel citosol e delineava chiaramente il nucleo. Si può notare che le piccole regioni arricchite con n possono essere rilevate alla risoluzione spaziale (50 nm) nella regione nucleare.
Le nanosonda a raggi X esistenti o quelle da costruire non sono necessariamente in grado di contenere capacità criogeniche. In questo caso, la migliore alternativa per ottenere immagini a fluorescenza a raggi X di cellule a risoluzioni spaziali di sotto i 100 nm consiste nell'eseguire una procedura di essiccazione con gelo descritta in questo protocollo dopo il congelamento della cellula. Figura 8A mostra una tipica visione microscopia a campo luminoso dei neuroni ippocampali del topo primario liofilizzati risultanti direttamente coltivati sulla membrana Si3N4. In questo caso, se conservati in una camera pulita, i campioni possono essere preparati con 1/2 settimane di anticipo ed essere osservati con un normale microscopio ottico verticale per la registrazione delle regioni di interesse. Occorre prestare attenzione a prevenire l'esposizione all'umidità ambiente in quanto può essere catturata dal campione liofilizzato e causare danni sotto il nanofascio a raggi X. Questa procedura è stata applicata con successo alle cellule molto sensibili (cioè le cellule neuronali) e sono stati ottenuti risultati ancora migliori con altri tipi più robusti di cellule, come le cellule tumorali. Per quanto riguarda le cellule congelate a tuffo, le immagini a fluorescenza a raggi X di K, S e n sull'intero display a celle liofillate sono simili a quelle sopra descritte. Essi sono rappresentativi delle distribuzioni elementali che si trovano in vari tipi di cellule liofiliate a risoluzione spaziale di 50-100 nm. Mentre l'essiccazione a freddo intere cellule è un'alternativa per preservare l'integrità elementare, è a scapito di una perfetta conservazione della morfologia cellulare16, in particolare le membrane cellulari.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg"> Figura 1: supporto tipico del campione per la nanoanalisi della fluorescenza a raggi X. Un supporto a membrana Si3N4 nella sua capsula protettiva. Questo tipo di substrato può essere utilizzato sia per l'analisi della temperatura ambiente (preparazione cellulare con congelamento del tuffo seguita da bassa temperatura e basso processo di congelamento sottovuoto) sia per l'analisi criogenica della fluorescenza a raggi X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg"> Figura 2: Vista schematica delle finestre di nitrato di silicio dopo la semina delle cellule. Le cellule vengono coltivate direttamente sulla superficie piatta rivestita poli-L-lisina del supporto della membrana Si3N4. A volte le bolle d'aria possono essere intrappolate nella cavità posteriore del supporto della membrana Si3N4 e devono essere rimosse come descritto nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg"> Figura 3: Crio-box stampato in 3D sviluppato internamente per la conservazione a lungo termine di immersione congelati Si3N4 supporti a membrana in azoto liquido Dewar. (A) Cryo-box smontato con il contenitore e i tappi (parte inferiore) e (B) la crio-box assemblata con tappi bloccati. I tappi possono essere manipolati con le pinzette, aprendo o bloccando per rotazione. Un piano dettagliato per la stampa 3D è disponibile su richiesta da ESRF ID16A. Il design è stato realizzato per ospitare griglie TEM a nitrato di silicio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg"> Figura 4: Gonfiore delle cellule coltivate su Si3N4. Prima di congelare il mostrato cellulare coltivato su una membrana Si3N4 deve essere sciacquato in soluzione di acetato di ammonio (A) e accuratamente cancellata con carta da filtro (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg"> Figura 5: Macchina EM-GP con congelamento automatico delle tuffi. (A) Il congelatore automatico a tuffo. (B) Camera ambientale con le pinzette rinchiuse. (C) La tazza di etano coperta dal liquef Leica collegata a una bottiglia di etano. (D) Il recinto con gelido che mostra la tazza nera piena di etano liqueficato e il crio-box per un ulteriore stoccaggio in LN2 delle membrane Si3N4 vetrificate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg"> Figura 6: Esempio di assemblaggio criotrasferimento per la procedura di congelamento. (A) Il primo recipiente in ottone per le membrane Si3N4 è montato sopra il supporto di trasferimento del campione fornito dal fornitore dell'essiccatore di congelamento. (B) e (C) mostrano che il secondo disco in ottone piatto viene utilizzato come copertura e funge da involucro di trappola a freddo da inserire nell'involucro sottovuoto dell'asciugatrice congelante. (D) L'assemblaggio completo con l'asta di trasferimento caricata a molla. (E) Il supporto del campione che trasporta la preparazione cellulare vetrificata coltivata sulla membrana Si3N4 deve essere ulteriormente inserito nell'essiccatore congelo raffreddato LN2. Tutti i passaggi per il montaggio dell'assieme vengono eseguiti in LN2 in una scatola di polistirolo. Per chiarezza, tutte le immagini sono state prodotte in assenza di LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg"> Figura 7: Immagini a fluorescenza a raggi EX crio-X di una cellula idratata congelata utilizzando la nanosonda a raggi X. (A) Visione online tipica in modalità riflessione utilizzando il microscopio video ottico dedicato della linea del fascio ESRF ID16A. Dopo l'umidità manuale, è stato raggiunto uno spessore totale del ghiaccio di circa 5,10 m che consente una visione chiara delle cellule idratate congelate. Una regione con l'anello di Newton è indicativa anche di molto ghiaccio più sottile è evidente. (B) Rappresentante crio-X fluorescenza fluorescenza distribuzioni cellulari di elementi fisiologici potassio (K), zolfo (S), e zinco . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg"> Figura 8: Immagini a fluorescenza a raggi X di una cellula neuronale liofilizzata utilizzando la nanosonda a raggi X dura. (A) Visione tipica della microscopia a campo luminoso delle cellule neuronali corticali primarie congelato risultanti direttamente coltivate sulla membrana Si3N4. Barra della scala - 200 m (B) Immagini a fluorescenza a raggi X rappresentative della temperatura ambiente di un singolo neurone ippocampale liofilizzato che mostra la distribuzione di elementi fisiologici di potassio (K), zolfo (S) e zinco. Barra di scala : 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentato qui è un protocollo per la coltura cellulare sulle membrane di nitrato di silicio e il congelamento del tuffo prima dell'imaging a fluorescenza a raggi X con una nanosonda a raggi X criogenica sincrotrone. Quando viene fornita solo una nano-analisi a temperatura ambiente, i campioni congelati possono essere ulteriormente liofilizzati. Questi sono i passaggi critici per ottenere informazioni sulla composizione elementale intracellulare.

Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Le nano-sonde a fluorescenza a raggi X di sincrotrone di nuova progettate consentono la visualizzazione della distribuzione elementale di un campione. L'uso di approcci criogenici è obbligatorio per rallentare i danni causati dalle radiazioni a raggi X. Pertanto, una rapida criofissazione è essenziale per ottenere cellule idratate congelate per ottimizzare la conservazione della struttura cellulare e la sua integrità chimica.La specificità dei preparati cellulari per gli studi sul sincrotrone porta all'ottimizzazione di questo protocollo per l'acquisizione di monostrati di cellule idratate congelate. La dimostrazione visiva è importante per comprendere come manipolare i campioni di monostrato cellulare per ottenere cellule riproducibilmente criofisse incorporate all'interno di un sottile strato di ghiaccio. Per preparare un supporto a membrana in nitruro di silicio, aprire la capsula contenente il supporto della membrana e spremere delicatamente la capsula per allentare leggermente il supporto.Utilizzare pinzette sottili per afferrare un angolo del telaio in silicio facendo attenzione a non toccare la membrana in nitruro di silicio al centro del telaio e posizionare il telaio in una piastra di Petri scoperta in un armadio a flusso laminare. Quindi i raggi UV sterilizzano la membrana per 25-30 minuti. Al termine della sterilizzazione, aggiungere 10 microlitri di fattore di attacco come la poli-L-lisina.Incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con umidità. Quindi riempire i pozzi di una piastra sterile da 48 porri con da 200 a 250 microlitri da 0,22 micrometri filtrati ultra pura e ultra traccia acqua per pozzo. Utilizzare pinzette fini per immergere accuratamente la membrana verticalmente con tre risciacqui successivi di 10 secondi in un pozzo d'acqua.Dopo il risciacquo, posizionare la membrana verticalmente in un pozzo vuoto di una piastra sterile da 96 po 'sotto il cappuccio di flusso laminare e lasciarla durante la notte fino a quando non è asciutta. Per la semina delle cellule di interesse, posizionare la membrana rivestita con il lato piatto rivolto verso l'alto in un pozzo di una piastra sterile a quattro pozzi. Aggiungere cinque volte 10 alle quattro cellule in 10 microlitri di un mezzo di coltura appropriato alla superficie della membrana di nitruro di silicio senza toccare la membrana.La goccia dovrebbe coprire l'intera membrana. Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità. Quando le cellule hanno iniziato ad attaccarsi al substrato, aggiungere lentamente un millilitro di mezzo di coltura completo lungo la parete di ogni pozzo che copre ogni membrana.Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità. Per la crioimmobilitazione della preparazione cellulare, prima accendere un congelatore automatico e riempire il numero appropriato di pozzi in una piastra di plastica da 12 po 'con tampone di acetato di ammonio Celsius di 37 gradi Celsius. Immediatamente prima di risciacquare e immergere congelando la membrana, rimuovere il campione dall'incubatrice e utilizzare l'anello di morsetto nero di un paio di pinzette a sganciamento rapido per sbloccare le pinzette.Utilizzare le pinzette sbloccate per afferrare il supporto della membrana e immergere la membrana verticalmente all'interno della soluzione tampone di acetato di ammonio per circa cinque secondi. Per rimuovere qualsiasi tampone in eccesso, premere il fondo del supporto della membrana sulla carta da filtro e asciugare ogni lato del telaio sulla carta da filtro senza consentire alla membrana di toccare la carta. Quando il tampone in eccesso è stato rimosso, aprire la porta della camera ambientale, far scorrere rapidamente le pinzette nell'interblocco delle pinze e chiudere la porta della camera.Premere macchia Un tuffo. Le pinzette che tengono la membrana del nitruro di silicio verranno rapidamente immerse nel criogeno. Dopo il congelamento del tuffo, rimuovere il coperchio del contenitore di trasferimento con forceli prerispesiti e trasferimento della pressa.La membrana in nitruro di silicio verrà spostata leggermente sopra il criogeno. In un rapido movimento singolo, far scorrere e inclinare leggermente le pinzette fuori dall'interblocco delle pinze per portare le pinzette direttamente in uno slot vuoto della criobox nel contenitore di trasferimento riempito con liquido azoto. Quindi rilasciare l'anello del morsetto nero per liberare la membrana.Per la liofilizzazione delle celle congelate, utilizzare l'interruttore rocker situato sul pannello posteriore dello strumento di liofilizzazione per accendere lo strumento. Il display mostrerà premere INVIO quando è pronto per caricare l'esempio. Montare il supporto in ottone a membrana in nitruro di silicio sopra il portacampioni fornito dal fornitore nel contenitore di stoccaggio in polistirolo mantenendo il livello di azoto liquido a circa uno o due millimetri sotto il bordo superiore del primo pezzo di ottone.Posizionare la membrana con il lato del campione di cella rivolto verso l'alto nella cavità numerata del supporto in ottone e pre-raffreddare l'asta di trasferimento in una scatola di schiuma di polistirolo riempita di azoto liquido. Utilizzare l'asta per bloccare l'assemblaggio completo, premere INVIO per rompere il vuoto per rilasciare il coperchio della camera dell'essiccatore, trasferire immediatamente il campione nella camera dell'essiccatore e chiudere il coperchio della camera dell'essiccatore. Quindi premere immediatamente iniziare a continuare con il ciclo di liofilizzazione.Al termine del ciclo di liofilizzazione, premere stop per sfiato la camera e rimuovere l'assemblaggio completo per accedere ai campioni liofilizzato. Qui viene mostrata una tipica vista videoscopica ottica delle cellule congelate della linea cellulare del cancro al seno idrato sottoculturate su un supporto di membrana in nitruro di silicio rivestito in poli-L-lisina come dimostrato. La mappatura elementale a fluorescenza a raggi X delle cellule idratate congelate rivela la distribuzione di elementi fisiologici come potassio, zolfo e zinco.In questo esempio rappresentativo, l'elemento zolfo strettamente legato è stato distribuito uniformemente all'interno della cellula in un modello simile a quello osservato per il potassio e rappresenta una buona stima del profilo di massa cellulare. La distribuzione dello zinco, tuttavia, presentava un segnale più alto all'interno del nucleo che nel citosolo con una separazione chiaramente definita del segnale tra il citosolo e il nucleo. In questa tipica vista microscopia di Brightfield dei neuroni ippocampali del topo primario liofilizzato direttamente coltivati su una membrana di nitruro di silicio come dimostrato, le cellule mostrano una morfologia neurale tipica che non è influenzata dalla loro coltura o metodo di conservazione.L'imaging a fluorescenza a raggi X di cellule congelate rivela anche le tipiche distribuzioni elementali esposte da queste cellule liofilizzato rappresentative con una risoluzione spaziale da 50 a 100 nanometri. Tracciare la finestra del nitruro di silicio è fondamentale per ottenere lo strato di ghiaccio più sottile possibile delle cellule dopo il congelamento del tuffo. Preservare l'integrità chimica delle cellule a livello subcellulare permette di esplorare il metallome delle cellule con nano-sonde di sincrotrone e con altre tecniche microanalitiche.Poiché non tutte le analisi della nano-sonda del sincrotrone possono essere eseguite a temperatura criogenica, le cellule idratate congelate possono essere ulteriormente liofilizzato per facilitarne l'analisi a temperatura ambiente. Ricordarsi di utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale quando si lavora con azoto liquido e di utilizzare sempre gas etano in una cappa aspirante lontano dalle fiamme.

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Thin Film composito silicone elastomeri per colture cellulari e applicazioni della pelle: produzione e caratterizzazione

Un protocollo per la fabbricazione di magnetico micro - e nanostrutture con configurazioni di spin formando vortici magnetici adatti per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e gli studi di trasmissione magnetica raggi x microscopia (MTXM) è presentato.

Fabbricazione di nanostrutture magnetiche sulle membrane di nitruro di silicio per studi di vortice magnetico utilizzando tecniche di microscopia di trasmissione

Questo protocollo presenta una procedura dettagliata per preparare criocampioni biologici per esperimenti di spettroscopia di assorbimento dei raggi X basati su sincrotrone. Descriviamo tutti i passaggi necessari per ottimizzare la preparazione del campione e la crioconservazione con esempi del protocollo con cellule tumorali e fitoplancton. Questo metodo fornisce uno standard universale di crio-preparazione del campione.

Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

Qui è presentato un protocollo per etichettare le proteine della membrana nelle cellule dei mammiferi e rivestire il campione con grafene per la microscopia elettronica a trasmissione a scansione in fase liquida. La stabilità dei campioni contro i danni causati dalle radiazioni può anche essere studiata con questo protocollo.

Involucro di grafene di cellule di mammiferi fissate chimicamente per la microscopia elettronica a fase liquida

Presentiamo un protocollo per la preparazione lamellare di campioni biologici surgelati a tuffo mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato per studi strutturali ad alta risoluzione di macromolecole in situ con tomografia crioeletnico. Il protocollo presentato fornisce linee guida per la preparazione di lamelle di alta qualità ad alta riproducibilità per la caratterizzazione strutturale di macromolecole all'interno del Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Qui, presentiamo un protocollo che mostra un substrato otticamente trasparente e piatto per la cattura e l'analisi semplificate delle particelle contaminanti nell'acqua potabile. Qui viene presentata la Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): una pipeline flessibile per la cattura, la quantificazione e l'identificazione di particelle in mezzi liquidi.

Analisi multimodale delle microplastiche nell'acqua potabile utilizzando una tubazione di analisi della nanomembrana di silicio

Impara la coltura cellulare su membrane di nitruro di silicio e la criopreparazione per l'analisi elementare con fluorescenza a raggi X di sincrotrone. Questo metodo preserva la struttura cellulare per la mappatura del potassio, zolfo e zinco.

Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi (Video) | JoVE Journal

Coltura cellulare sulle membrane di nitride di silicio e criopreparazione per la fluorescenza a raggi X del sincrotrone Nano-analisi

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