Utilizzo degli embrioni di pesce zebra Tg(Vtg1:mcherry) per testare gli effetti estrogenici dei composti interferenti endocrini

C'è un alto numero di sostanze chimiche EDC nel nostro ambiente, principalmente sostanze estrogeniche. La diversità chimica delle sostanze appartenenti al gruppo rende difficili i loro test, in quanto sono necessari diversi metodi per la loro individuazione. Sulla base della struttura chimica, è davvero difficile determinare se una sostanza è effettivamente in grado di funzionare come estrogeno.

Inoltre, queste sostanze non sono mai presenti in forma pura nell'ambiente, quindi i loro effetti possono essere influenzati anche da altri composti. Questo problema è risolto con metodi di dialettica degli effetti come l'uso di biomonitor, organismi bioindicatori che mostrano l'effetto estrogeno. È noto che alcuni geni reagiscono in modo sensibile agli estrogeni negli organismi viventi.

L'individuazione di prodotti genetici con metodi molecolari è possibile anche a livello proteico o di mRNA, ma di solito comporta sacrifici animali. Le leggi sulla protezione degli animali si sono inasprite e vi è una crescente domanda di sistemi di test alternativi. Le tecnologie cross-genetiche rappresentano la possibilità con questo sviluppo e con la scoperta di proteine fluorescenti, è stata spianata la strada alla creazione di biomarcatori.

Con l'aiuto di tale attivazione di geni sensibili agli estrogeni può essere testato in vivo. In questo video, viene mostrato un possibile metodo per l'uso di embrioni di zebrafish transgene vtg:1mCherry per il test di sostanze estrogeniche con l'aiuto di due composti. Il protocollo può servire come sfondo per lo studio dell'effetto estrogeno di diversi campioni chimici o ambientali su embrioni di biomarcatore.

La linea zebrafish utilizzata nei nostri esperimenti è una linea transgenica zebrafish reporter vitellogenin. La linea è stata creata utilizzando il sistema Tol2 Transposon. Il costrutto transgene utilizzato per lo sviluppo ha portato la lunga sequenza naturale di promotori vitellogenin-1, con un alto numero di lati ERI.

L'espressione del segnale fluorescente nella femmina sessualmente matura è continua. Tuttavia, nei maschi negli embrioni, appare solo dall'azione o dalla presenza di sostanze estrogeniche, quindi queste ultime sono più adatte per il test. La sensibilità e l'usabilità degli embrioni della linea sono state testate su diversi composti estrogenici e su campioni ambientali.

Tutti gli esperimenti sugli animali vivi sono stati eseguiti secondo la legge ungherese sul benessere degli animali e tutti gli studi sono stati completati prima che gli animali raggiungesse la fase di alimentazione gratuita. Riempire i serbatoi di accoppiamento con acqua di sistema e impostare il pesce per l'accoppiamento prima di raccogliere le uova. Posizionare pesci maschi e femmine nel serbatoio e separarli con l'aiuto di un divisore.

Rimuovere il divisore dai serbatoi mentre la luce si accende la mattina successiva. Controllare i serbatoi di accoppiamento per le uova ogni 15-20 minuti. Raccogli tutti gli embrioni usando un colino per il tè, o una rete fine densamente tessuta, e combinali in un'unica grande piastra di Petri con tampone E3 o acqua di sistema limpida.

Posizionare gli embrioni negli incubatori impostati a 25,5 gradi Celsius. Da una a un'ora e mezza dopo, rimuovere e scartare le uova non fecondate o non adeguatamente divise con una pipetta di trasferimento di plastica al microscopio sezionato. Posizionare gli embrioni selezionati nei recipienti di trattamento, ad esempio nelle piastre di Petri o nelle piastre di coltura tissutale, che sono già state etichettate e riempite con diverse concentrazioni della sostanza in esame.

Incubare gli embrioni a 25,5 gradi Celsius fino alla fine dell'esperimento. Aggiornare la soluzione di prova se necessario per mantenere la concentrazione del trattamento. Fare attenzione quando si cambia la soluzione di prova, al fine di evitare di danneggiare gli embrioni.

Preparare il 4% di methoseladose con ms 222 in anticipo. Posizionare le larve di cinque giorni in una piastra di Petri di cinque centimetri per gruppo di trattamento con una pipetta di plastica. Rimuovere la soluzione di trattamento dalle larve con una pipetta di plastica, quindi riempire la piastra di Petri con due millilitri dello 0,02% ms 222 soluzione anestetica.

Riempire ogni quadrato di una piastra di Petri di 10 centimetri appositamente progettata con il quattro per cento methoseladose ms 222. Trasferire le larve anestetizzate in methoseladose con un po 'd'acqua in uno dei due quadrati. Dal primo quadrato, trasferire le larve nel secondo quadrato.

Nel secondo quadrato, ruotare e orientare le larve sul lato sinistro e premerle delicatamente verso il basso del con una punta della pipetta del microloader tagliata fino a due centimetri. Al fine di valutare il segnale del reporter espresso, immagini gli embrioni nella stessa vista e nelle stesse impostazioni. Posizionare la piastra di Petri sul palco del microscopio.

Concentrati sul fegato dell'embrione e cattura un'immagine di campo brillante utilizzando il software associato. Passare il microscopio al filtro mCherry e scattare un'immagine fluorescente del fegato sotto la luce fluorescente utilizzando il software associato. Ripetere i due passaggi precedenti fino a quando non sono stati acquisiti tutti gli embrioni nell'esperimento.

Apri ImageJ, quindi carica l'immagine fluorescente da analizzare trascinando e rilasciando l'immagine o facendo clic su Apri file. Fare clic su Immagine, Colore, Dividi canali per dividere l'immagine realizzata dal filtro florescente in base al grafico a colori RGB. Lavorare con lo spettro dell'immagine del canale rosso.

Chiudere gli altri canali. Designare un'area ellittica di dimensioni simili nell'immagine, in modo che i segnali completi non interferiscano con la valutazione. Utilizzando gli strumenti ovali disegnare un'ellisse sull'area epatica evidenziata nel modo più accurato possibile.

Se il segnale è debole, utilizzare immagini microspice leggere, la coppia di campi luminosi dell'immagine fluorescente, per determinare la posizione del fegato. Fare clic su Analizza, Misura, per determinare la potenza del segnale e la dimensione dell'area effettuata. Il valore di densità integrato viene calcolato automaticamente dalla colonna software del grafico.

Continuare l'analisi ripetendo i passaggi precedenti fino ad analizzare tutte le immagini di fluorescenza di tutti gli embrioni nel gruppo di trattamento. Salvare i dati e quindi analizzare i valori di densità integrati. Nell'esperimento, gli embrioni sensibili agli estrogeni della linea di zebrafish biomarcatore sono stati trattati con concentrazioni di 0,5 e otto micromoli di alfa e beta-zearalenolo, o ZOL, per la fecondazione fino all'età di cinque giorni.

Abbiamo studiato se i segnali florescenti appaiono nel fegato del pesce entro la fine dell'esperimento a causa di sostanze e se ci sono differenze nella estrogenicità delle due sostanze. I risultati sono stati valutati sulla base di immagini fluorescenti e valori di densità integrati. Nel caso dell'alfa-ZOL, alla massima concentrazione di test, tutti gli individui sono morti.

Quindi in questo caso il segnale fluorescente non poteva essere esaminato. A concentrazioni più basse, un forte segnale fluorescente può essere osservato nel fegato dell'embrione. Senza alcuna differenza significativa nella forza del segnale fluorescente e nelle dimensioni delle aree illuminate.

Inoltre, non vi è stata alcuna differenza significativa tra i valori di densità integrati e i trattamenti. Non c'era mortalità durante il trattamento con beta-ZOL. L'attività transgena indotta dalla sostanza in tutte le concentrazioni di trattamento.

L'aumento dell'intensità del segnale fluorescente e la dimensione dell'area illuminata possono essere osservati nelle immagini a fluorescenza all'aumentare della concentrazione. Esaminando i valori integrati di beta-ZOL, questa modifica può anche essere scoperta. Il valore medio di densità integrata quasi raddoppia tra le concentrazioni di trattamento più basse e più elevate.

Tuttavia, nel caso del beta-ZOL, non abbiamo trovato una differenza significativa tra i valori di densità integrati delle singole concentrazioni. Esaminando i valori di densità integrati ottenuti dalle stesse concentrazioni di trattamento delle due sostanze, si può dire che alpha-ZOL ha dato medie di densità integrate più elevate in ogni caso rispetto al beta-ZOL, che è coerente con le differenze tra la potenza del segnale osservata nelle immagini fluorescenti. Queste differenze con significative a tutte le concentrazioni.

L'uso di bioindicatori per gli effetti estrogeni si è diffuso in studi tossicologici. Diverse linee transgeniche che mostrano effetti estrogenici sono state prodotte anche da zebrafish, di cui vtg:1mCherry è stato utilizzato nei nostri studi. Il metodo qui descritto illustra un possibile protocollo per il test di embrioni di questa linea, al fine di consentire il rilevamento in vivo dell'attività estrogena in caso di agenti puri.

È importante ricordare che nel caso degli embrioni, l'espressione del transgene, analogamente alla produzione di vitellogenina endogena, mostra una grande dispersione e le differenze di sensibilità individuale dovrebbero essere prese in considerazione nella progettazione di esperimenti. Un aspetto importante nel determinare le concentrazioni di trattamento è che le cellule degli embrioni, comprese le cellule del fegato, possono essere danneggiate da concentrazioni più elevate di sostanze altamente tossiche, che possono portare a un declino dell'induzione di vitellogenina. Pertanto le prove devono essere eseguite a concentrazioni inferiori a L-C 10.

Questo protocollo può essere modificato in molti punti in base agli endpoint di test pianificati e ai campioni che verranno testati. Può essere completato con altri metodi di prova, ad esempio metodi molecolari. Pertanto, speriamo che l'uso della linea vtg:1mCherry apparirà come un modello di test di estrogenicità e potrebbe anche essere un modello per metodi di test standardizzati.