Name: Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Impara a coltivare, manipolare geneticamente e trapiantare ortotopicamente organoidi tumorali della vescica del topo. Questo protocollo dettagliato consente di studiare la biologia del cancro vescicale in vivo.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni della National Research Foundation of Korea a K.S: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economic Leading Technology Development Programme (SF317001A) la BK21 Plus Research Fellowship.

Tutte le procedure sono state approvate e condotte secondo le linee guida del Institutional Animal Care and Use Committee presso POSTECH (Numero IACUC: POSTECH-2019-0055).
1. Cultura in vitro degli organoidi tumorali della vescica
<ol><li>Stabilire gli organoidi tumorali della vescica dal tumore della vescica murina (Figura 1Un). NOTA: La procedura per la generazione di tumori della vescica del topo indotti da BBN è descritta in Shin et al.17.<ol><li>Fornire 0.1% acqua contenente BBN in una bottiglia scura per mouse ad libitum per 6 mesi. Cambiare l'acqua contenente BBN 2 volte a settimana. NOTA: È stato utilizzato un topo maschio C57BL/6 con un peso corporeo di circa 25 g a 8-10 settimane di età. L'acqua contenente BBN può essere somministrata a un massimo di cinque topi in un'unica gabbia.</li>
		<li>Dopo 6 mesi, eutanasia il topo utilizzando l'inalazione di anidride carbonica e isolare l'intero tumore della vescica. Trasferirlo in un piatto Petri da 90 mm.</li>
		<li>Rimuovere le parti non cancerose e le regioni necrotiche utilizzando forbici chirurgiche sterili e lavare i frammenti tumorali della vescica 2-3 volte con la salina (DPBS) tampone di fosfato freddo 1x Dulbecco. Raccogliere i frammenti e trasferirli in un nuovo piatto Petri da 90 mm.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL del mezzo minimo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM) con 10 mM 4-(2-idxyethyl)-1-piperazineethaneilfonic acid (HEPES).</li>
		<li>Mito il tessuto tumorale in pezzi il più piccoli possibile (0,5-1 mm3)utilizzando una lama sterilizzata.</li>
		<li>Aggiungere 9 mL di DMEM con 10 m/HEPES, 250 g/mL di tipo collagenase I, 250 g/mL di tipo collagenase II e 250 termolisina U/mL. Incubare il tessuto tumorale macinato per 1,5-2 h su uno shaker orbitale in un'incubatrice (37 , 5% CO2) per dissociare i frammenti nella sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL. NOTA: Se la dimensione del tumore raccolto dal topo è superiore a 1 cm3, trattarlo con 2 volte la quantità di termolisina o aumentare il tempo di incubazione.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet utilizzando 5 mL di clouro-potassio-potassio (ACK) lysing buffer per liizzare eventuali globuli rossi. Incubare il tubo per 3-5 min a temperatura ambiente (RT) fino alla lis completa dei globuli rossi. NOTA: Se i globuli rossi non sono osservati, omettere il processo di liscivia.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL di DMEM nel tubo. Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet con 1 mL di 0,25% Trypsin-EDTA e 10 dihydrochlride (Y-27632) per dissociare il pellet in singole celle. Incubare il tubo per 5 min in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. NOTA: Osservare il tumore al microscopio per confermare la completa dissociazione in singole cellule. Se blocchi di cellule persistono, pipette ulteriormente la sospensione.</li>
		<li>Neutralizzare la trypsin utilizzando 10 mL di DMEM con il 10% di siero bovino fetale (FBS). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare di 100 m su un nuovo tubo da 50 mL per rimuovere i detriti non digeriti.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Rivestire un pozzo in una piastra di 24 pozze utilizzando 150 -L di fattore di crescita del freddo ghiaccio ridotto matrice della membrana seminterrato (Tabella dei materiali) e posizionare la piastra 24 pozzo in un'incubatrice (37 c, 5% CO2) per 30 min per solidificare la matrice della membrana seminterrato. NOTA: Scongelare e mantenere la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi centigradi per evitare la solidificazione prima dell'uso.</li>
		<li>Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di DMEM e contare le celle utilizzando un emocitometro. Trasferire 3-4 x 104 cellule tumorali in un microtubo da 1,5 mL sul ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare il microtubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e scartare con cura il supernatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule con 500 o luna di mezzo organoide preriscaldato (Tabella 1) e 10 -M Y-27632 e trasferirle nel pozzo rivestito. Mettere la piastra 24 in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).</li>
		<li>Le cellule tumorali extra della vescica possono essere rifornite con 1 mL di DMEM contenenti 10% FBS, 1% penicillina /streptomicina e 10% di anidride dimetilico (DMSO) in crioviali 1,5 mL. Mettetele in un contenitore di congelamento crioviale e trasferite il contenitore in un congelatore a -80 gradi centigradi. Dopo lo stoccaggio nel congelatore durante la notte, trasferire i crioviali in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.</li>
		<li>Modificare il mezzo ogni 2 giorni utilizzando 500 l di mezzo organoide preriscaldato (Figura 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>organoidi tumorali della vescica della sottocoltura. NOTA: Si raccomanda il passaggio degli organoidi tumorali della vescica quando raggiungono i 100-150 m di diametro.<ol>
<li>Aggiungere 500 -L L di collagenano/dispasi al mezzo organoide nella piastra di 24 po' con organoidi tumorali. Pipetta su e giù per la matrice della membrana seminterrato e il mezzo. Incubare per 20 min a 37 s e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL. NOTA: Esaminare gli organoidi isolati dalla matrice della membrana del seminterrato al microscopio. Se gli organoidi non sono staccati dalla matrice della membrana del seminterrato, aumentare il tempo di incubazione o pipette più volte.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di DMEM preriscaldato, centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi, e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di trypsin-EDTA preriscaldato 0,25% e 10 -M Y-27632. Incubare per 5 min in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Pipette vigorosamente le cellule su e giù e neutralizzare la trypsin utilizzando 5 mL di DMEM con 10% FBS.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di mezzo organoide preriscaldato e contare il numero di singole cellule tumorali.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.1.14-1.1.18.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Manipolazione genetica degli organiidi tumorali della vescica utilizzando la trasduzione mediata dal lentivirus (Figura 2A)
<ol><li>Produrre le particelle lentivirali che esprimono GFP.<ol>
<li>Il giorno 0, piastra HEK 293T cellule ad una densità di 5–6 x 106 celle per 10 cm piastra di coltura cellulare nel mezzo di coltura della linea cellulare (cioè, DMEM con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina).</li>
		<li>Il primo giorno, preparare la soluzione di trasfezione del DNA, compreso il plasmide di trasferimento contenente GFP (8 g), il plasmide di imballaggio lentivirale (10 g di pCMVR 8,74 e 3 g di pMD2.G) e 1 mL di supporto siero ridotto(Tabella dei materiali).</li>
		<li>Aggiungere 3 -L di reagente di trasfezione (Tabella dei materiali) per 1 g di plasmide totale secondo le istruzioni del produttore e mescolare delicatamente pipettando. Incubare per 20 min a RT e aggiungere 9 mL di DMEM con 10% FBS.</li>
		<li>Aspirare il mezzo di coltura nella piastra di coltura cellulare con cellule HEK 293T. Trasferire con attenzione 10 mL della soluzione di trasfezione del DNA sulle cellule HEK 293T e incubare in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Il terzo giorno, osservare le cellule al microscopio a fluorescenza (eccitazione a 488 nm ed emissione a 512 nm) per determinare l'efficienza della trasfezione. Quasi il 90%–100% delle cellule dell'intera popolazione cellulare dovrebbe esprimere GFP.</li>
		<li>Raccogliere il supernatante (contenente il virus) e filtrare il supernatante con un filtro di poliethersulfone (PES) di 0,45 m. NOTA: Utilizzare un filtro a basso legame proteico, ad esempio un filtro PES.</li>
		<li>Per concentrare il virus, centrifugare il supernatante del virus a 98.768 x g in un'ultracentrifuga per 2 h a 4 gradi centigradi in un rotore a benna oscillante (Tabella dei materiali) e scartare con cura il supernatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 2,5 mL di mezzo organoide freddo.</li>
		<li>Per lo stoccaggio a lungo termine, aliquote di 250 gradi di mezzo lentivirale in fiale criogeniche e bloccarle a scatto usando azoto liquido. Conservare le scorte virali congelate in un congelatore a -80 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la trasduzione mediata da lentivirus degli organoidi tumorali della vescica.<ol>
<li>Il giorno 2, dividere gli organoidi tumorali come descritto sopra (passaggio 1.2) 12 h prima della trasduzione mediata dal lentivirus.</li>
		<li>Il giorno 3, scongelare rapidamente un virus (passo 2.1.9) contenente un virus in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e aggiungere i 250 gradi di mezzo organoide con 10 SM Y-27632 e 8 bromdie di esadimethrina.</li>
		<li>Sostituire il mezzo organoide nella piastra di 24 pozze con organoidi tumorali di 500 - L di mezzo contenente virus e incubare per 12–16 h in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2).</li>
		<li>Il giorno 4, cambiare il mezzo con 500 litri di mezzo organoide fresco. NOTA: Dopo 12-16 h di incubazione, il mezzo deve essere cambiato, perché il mezzo contenente lentivirus e bromuro di esadimettosina è citotossico.</li>
		<li>Il giorno 6, monitorare il segnale GFP dagli organoidi tumorali 3 giorni dopo la trasduzione al microscopio a fluorescenza (Figura 2B).</li>
		<li>Il giorno 10, passare e immagazzinare gli organoidi 7 giorni dopo la trasduzione come descritto al punto 1.2, per mantenere le linee organotumidi geneticamente modificate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Trapianto ortotopico di organiide della vescica(Figura 3A)
<ol><li>Preparare gli organoidi tumorali della vescica per il trapianto ortotopico.<ol>
<li>Prima del trapianto, coltura degli organoidi tumorali della vescica per 5-7 giorni, come descritto sopra (passaggio 1.2).</li>
		<li>Aggiungere 500 -L l di collagenano/dispasi al mezzo organoide in una piastra di 24 pozze con gli organoidi tumorali. Pipetta su e giù per la matrice di membrana seminterrato e mezzo. Incubare per 20 min a 37 s e raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di DMEM preriscaldato, centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi, e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet con 1 mL di DMEM e trasferire la soluzione in una parabola Petri da 90 mm.</li>
		<li>Al microscopio, raccogliere gli organoidi tumorali 10-100 utilizzando una micropipetta p200 e raccoglierli in un microtubo sul ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 gradi centigradi e scartare con cura il supernatante.</li>
		<li>Mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio fino a quando i topi sono pronti per l'intervento chirurgico.</li>
	</ol></li>
	<li>Trapianto di parete della vescica submucosale NOTA: questa procedura viene modificata dal protocollo pubblicato da Fu et al18.<ol>
<li>Prepara un topo nudo maschile da 8 a 10 settimane (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) almeno 1 settimana prima dell'esperimento per permettergli di acclimatarsi a un nuovo ambiente. Iniettare enrofloxacin (5 mg/kg) sottocutaneamente 24 h prima dell'intervento chirurgico.</li>
		<li>Pulire la superficie del panca con acqua e sapone. Autoclave gli strumenti chirurgici prima della procedura chirurgica ed eseguire la chirurgia utilizzando strumenti sterili.</li>
		<li>Mantenere la siringa di insulina 29 G, punte pipette, e matrice di membrana seminterrato sul ghiaccio. Somministrare il chetoprofene (5 mg/kg) sottocutaneamente prima della somministrazione di anestesia.</li>
		<li>Anestesizzare il topo con 4% isoflurane in una camera di induzione. Una volta ottenuta l'anestesia generale, posare il topo in una posizione supina e mantenere l'anestesia per inalazione di maschera del 2% di isoflurane vaporizzato. NOTA: Se il tempo di anestesizzazione è superiore a 30 min, applicare l'unguento degli occhi a entrambi gli occhi utilizzando un tampone di cotone per evitare l'essiccazione corneale.</li>
		<li>Applicare povidone-iodio con una garza sterile e pulirlo con 70% di etanolo. Ripetere 3x con una nuova garza o un tampone di cotone ogni volta.</li>
		<li>Coprire l'ano e il campo chirurgico utilizzando tende chirurgiche usa e getta e sterili.</li>
		<li>Utilizzando un microscopio dissettivo per l'ingrandimento, fare una piccola incisione trasversale (più piccola di 1,5 cm) nella pelle e parete muscolare dell'addome della linea mediana inferiore con forbici chirurgiche sterili. Esporre la vescica dalla cavità addominale e sostenerla con tamponi di cotone imbevuti di salina. NOTA: Se la vescica è piena di urina, premere delicatamente la vescica per decomprimerla leggermente.</li>
		<li>Risospendere i pellet organoidi (passaggio 3.1.7) in 80 gradi di mezzo organoide contenente il 50% di matrice di membrana basement ad alta concentrazione (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Iniettare la sospensione organoide nell'aspetto anteriore della cupola della vescica utilizzando la siringa insulinica 29 G al microscopio dissetante.</li>
		<li>Chiudere lo strato interno della parete addominale con sutura antibatterica assorbibile e quindi chiudere lo strato esterno con sutura in nylon 4-0. Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e 70% di etanolo.</li>
		<li>Permettere al topo di recuperare sotto un irradiatore infrarosso 10-15 min. Monitorare il topo fino a quando non riacquista coscienza e motilità.</li>
		<li>Un giorno dopo l'intervento chirurgico, controllare le condizioni generali del topo e perdite anatomotiche. Somministrare il ketoprofene (5 mg/kg) una volta al giorno per 3 giorni post-operatori e trattare l'enrofloxacina (5 mg/kg) una volta al giorno per 10 giorni post-operatori.</li>
		<li>Quando il sito di incisione è guarito (10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico), rimuovere le suture. Monitorare la crescita del tumore della vescica del topo per 2–3 settimane dopo l'iniezione di organoide tumorale.</li>
		<li>Se si osserva la crescita del tumore della vescica, eutanasia il topo utilizzando l'inalazione di anidride carbonica, e raccogliere l'intero tumore della vescica. Lavarlo con DPBS freddo (Figura 3B)16.</li>
		<li>Per analizzare l'istologia del tumore della vescica, macchiare la sezione incorporata in paraffina del tessuto utilizzando ematossina e eosina (H ed E) colorazione (Figura 3B)16.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive le procedure sperimentali per coltura e mantenere gli organoidi tumorali della vescica derivati dai tumori della vescica murina indotta da cancerogeni.
In questo protocollo, esistono diversi passaggi sperimentali in cui le procedure potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi. In primo luogo, il numero di cellule tumorali che sono inizialmente semiate è un fattore critico perché un basso numero di cellule tumorali in coltura (<2 x 104 cellule) porta principalmente alla morte delle cellule a causa della mancanza di interazioni tra le cellule tumorali. Al contrario, iniziare con troppe cellule (>5 x 104 cellule) al semina porta a organoidi sovraffollati, con conseguente difficoltà nella manipolazione di colture con scarsa crescita di ogni organoide. È fortemente suggerito che più piastre con diversi numeri di cellule siano stabilite all'inizio per ottimizzare le condizioni sperimentali. Identificare il giusto numero di cellule tumorali iniziali è fondamentale per ottenere la massima vitalità cellulare e per stabilire organoidi tumorali della vescica di successo. Inoltre, nella coltura a lungo termine di oltre 2 settimane senza passare, la maggior parte degli organoidi tumorali smette di crescere, potenzialmente a causa dell'insufficiente apporto di nutrienti al centro degli organoidi e dell'esaurimento del fattore di crescita nella matrice della membrana seminterrato. Pertanto, la sottocultura degli organoidi in modo tempestivo è un passo fondamentale per mantenere la coltura degli organoidi tumorali.
In secondo luogo, la produzione di particelle lentivirali ad alto titro è fondamentale per l'efficiente manipolazione genetica degli organoidi tumorali. Per risolvere i problemi legati al titro dei virus, si suggerisce vivamente che i titer del virus siano determinati prima della trasduzione virale ogni volta perché i costrutti lentivirali tendono a produrre particelle virali con efficienza variabile. Se gli organoidi tumorali presentano una bassa vitalità a seguito di infezione virale, è probabile che i titer virali siano potenzialmente troppo alti. Si consiglia vivamente di utilizzare una minore quantità di virus in questo caso. In terzo luogo, durante il trapianto ortotopico di organoidi tumorali della vescica indotta da BBN, è fondamentale per mantenere l'integrità della parete della vescica. Nel caso in cui l'iniezione raggiunga il lume della vescica penetrando nello strato della parete della vescica, l'esperimento deve essere terminato e scartato. Se possibile, si raccomanda il monitoraggio della crescita del tumore della vescica utilizzando un sistema di imaging a ultrasuoni.
Una limitazione delle tecniche attuali è l'assenza del microambiente tumorale o stroma in questi organoidi. Per superare questo problema, è fortemente suggerito che il trapianto ortotopico di organoidi tumorali usi un sistema in vivo per imitare il microambiente tumorale nativo. In futuro, sarà necessario sviluppare sistemi organoidi in vitro 3D composti da organoidi tumorali con altri componenti dello stroma tumorale.
Una delle principali implicazioni della nostra tecnica è che, nel trapianto ortotopico degli organoidi tumorali, solo 10 organoidi tumorali della vescica possono indurre la crescita del tumore nella vescica. Rispetto ai tradizionali esperimenti di trapianto di tumore che richiedono 5 x 105–1 x 106 cellule tumorali della vescica singola, i nostri metodi sono molto più efficienti e robusti. Un'altra differenza significativa è che gli organoidi possono essere manipolati in modo diverso utilizzando vari vettori lentivirali, come costrutti lentivirali contenenti RNA a pelo corto, sistema CRISPR-Cas9 o geni di interesse. Questi sarebbero potenti strumenti da aggiungere all'attuale tecnologia organoide. Nel complesso, gli approcci sperimentali qui presentati possono facilitare la creazione di modelli di tumore in vitro che possono migliorare la nostra comprensione della patogenesi del cancro della vescica piuttosto che utilizzare linee cellulari del cancro della vescica 2D.
Questo metodo è stato in grado di stabilire gli organoidi tumorali della vescica derivati da un tumore della vescica murina indotta da cancerogeni. L'articolo fornisce una descrizione delle procedure sperimentali mediate dal lentivirus attraverso le quali vengono introdotte le modifiche genetiche e mantenute stabilmente negli organoidi tumorali della vescica. Inoltre, è inclusa una procedura per il trapianto ortotopico di organoidi tumorali. In combinazione con i modelli di cancro in vivo attuali, questa tecnica sarà uno strumento utile per studiare la base molecolare della tumorigenesi della vescica.

Il cancro della vescica è il cancro del tratto urinario più diffuso, con circa 165.000 pazienti che muoiono ogni anno1. Tra i vari tipi di cancro della vescica, il carcinoma uroteliale muscolo-invasivo presenta un fenotipo aggressivo, e il suo tasso di sopravvivenza a 5 anni è inferiore al 50%2. Nuove opzioni terapeutiche per i tumori uroliali invasivi non sono state ampliate negli ultimi decenni1.
Le linee cellulari del cancro sono state ampiamente utilizzate per lo screeningfarmacologico 3. Anche se risultati favorevoli sono stati osservati in numerosi farmaci candidati nelle linee cellulari del cancro, scarsi risultati sono segnalati negli studi clinici4. Dopo un maggiore adattamento agli ambienti di coltura bidimensionale in vitro (2D), è diventato sempre più difficile ricapitolare i tumori nativi nelle linee cellulari. Modelli di cancro animale o xenogratrapi tumorali derivati dal paziente possono essere utilizzati per affrontare le limitazioni osservate nelle linee cellulari del cancro della vescica. Tuttavia, i modelli di cancro degli animali richiedono un uso intensivo di tempo e risorse. Pertanto, i modelli di malattia migliorati sono stati richiesti per anni e un nuovo sistema modello, organoidi, è stato sviluppato per superare le carenze dei modelli esistenti5.
Un organoide è un costrutto 3D multicellulare che può riassumere in vitro le caratteristiche fisiologiche del corrispondente organo in vivo. Gli organoidi normale e tumorale possono essere derivati da cellule staminali pluripotenti o adulte e cellule tumorali primarie, rispettivamente5,6. Nel corso degli ultimi anni, gli organoidi tumorali sono stati stabiliti da un gran numero di tessuti tumorali diversi7, tra cui il colon8,9, vescica10, pancreas11,12, prostata13, fegato14, e seno15 tessuti tumorali. Tali organoidi tumorali imitano i loro tumori originali fenotipicamente e geneticamente. A causa della loro somiglianza con i tessuti tumorali in vivo e delle loro numerose applicazioni pratiche, i ricercatori li hanno adottati come nuovi modelli di malattia nello studio della patogenesi tumorale.
Qui, le procedure per la creazione di organoidi tumorali da un tumore urino invasivo indotto da cancerogeni16 sono disposte. N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN) viene utilizzato come cancerogeno per indurre carcinoma uroteliali invasivo nei topi17 e gli organoidi tumorali, che presentano le caratteristiche patologiche dei tumori della vescica muscolo-invasiva del topo, sono stabiliti dal cancro della vescica murina indotta da BBN16. Il metodo per manipolare geneticamente gli organoidi tumorali è illustrato utilizzando la trasduzione mediata da lentivirus per sviluppare un sistema modello per studiare la base molecolare dello sviluppo del cancro della vescica. Inoltre, viene descritto un metodo per il trapianto di organoidi ortotopicamente in una vescica per studiare il ruolo dell'ambiente nativo della vescica nel cancro della vescica.

<table><tbody><tr><td>0,45 & micro; m filtro per siringa (membrana PES)</td><td>Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>piastra di coltura da 10 cm</td><td>Eppendorf</td><td>0030-702-115</td><td></td></tr><tr><td>piastra di Petri da 90 mm</td><td>SPL</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>100 &; Filtro cellulare m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 29 G 1/2</td><td>SHINA</td><td>B299473538</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>Norm-ject</td><td>N7. A03</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Concentrazione di riserva: 25 mM</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Daejung</td><td>4023-2304</td><td></td></tr><tr><td>Sutura assorbibile</td><td>Henry Schein</td><td>039010</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Thermo</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) tampone</td><td>Thermo</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>concentrazione di riserva: 50X</td></tr><tr><td>BBN(N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamina)</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>Nylon blu 5/0-13mm</td><td>AILEE</td><td>NB521</td><td></td></tr><tr><td>C57BL Mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (topo nudo)</td><td>Charles River</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo I</td><td>Thermo</td><td>17100017</td><td>Concentrazione stock: 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Thermo</td><td>17100015</td><td>Concentrazione stock: 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenasi/dispasi</td><td>Sigma</td><td>10269638001</td><td>Concentrazione stock: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Cyrovial</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(Terreni minimi essenziali modificati di Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetilsolfossido)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)</td><td>Welgene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina (Baytril)</td><td>Bayer Healthcare</td><td>DIN: 02169428</td><td></td></tr><tr><td>FBS(Siero fetale bovino)</td><td>Millipore</td><td>ES009B-KC</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato acido)</td><td>Welgene</td><td>BB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Hana Pharm Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofene (Anafen)</td><td>Merial</td><td>DIN: 02150999</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita Matrigel ridotto (GFR) Fattore di crescita ridotto (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>uso per la coltura di organoidi in piastra</td></tr><tr><td>Matrigel ad alta concentrazione (HC)</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>uso per il trapianto di organoidi</td></tr><tr><td>Microprovetta da 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>murino EGF(fattore di crescita epidermico)</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>concentrazione madre: 100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>concentrazione stock: 200 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>concentrazione stock: 1M</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCMV.R 8.74</td><td>Addgene</td><td>22036</td><td>Confezione plasmide</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Inviluppo</td></tr><tr><td>plasmide Polibrene (esadim etrina bromuro)</td> <td>Sigma</td><td>H9286</td><td>concentrazione di riserva: 2 & micro; g/mL</td></tr><tr><td>pSiCoR</td><td>Addgene</td><td>11579</td><td>Plasmide lentivirale</td></tr><tr><td>Lama di</td><td></td><td></td><td></td>rasoio</tr><tr><td>Tampone salino</td><td>JW Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti rotore a secchiello oscillante</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termolisina, Bacillus thermoproteolyticus</td><td>Millipore</td><td>58656-2500KUCN</td><td>Concentrazione di base: 250 KU/mL</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifugazione</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>Concentrazione madre: 10 mM</td></tr></tbody></table>

cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Lo sviluppo di modelli tumorali avanzati è stato a lungo incoraggiato perché gli attuali modelli tumorali hanno mostrato limitazioni come la mancanza di architettura tumorale tridimensionale (3D) e bassa rilevanza per il cancro umano. I ricercatori hanno recentemente sviluppato un modello di cancro in vitro 3D indicato come organoidi tumorali che possono imitare le caratteristiche di un tumore nativo in un piatto di coltura. Qui, le procedure sperimentali sono descritte in dettaglio per la creazione di organoidi tumorali della vescica da un tumore della vescica murina indotta da cancerogeni, compresa la coltura, il passaggio e il mantenimento degli organoidi tumorali 3D risultanti in vitro. Inoltre, vengono descritti i protocolli per manipolare le linee organoide del tumore della vescica stabilite per l'ingegneria genetica utilizzando la trasduzione mediata dal lentivirus, comprese le condizioni ottimizzate per l'introduzione efficiente di nuovi elementi genetici nel tumore organoidi. Infine, viene predisposta la procedura per il trapianto ortotopico degli organoidi tumorali della vescica nella parete della vescica murina per ulteriori analisi. I metodi descritti in questo articolo possono facilitare la creazione di un modello in vitro per il cancro della vescica per lo sviluppo di migliori opzioni terapeutiche.

Cultura in vitro degli organoidi tumorali della vescica del topo Il numero di cellule tumorali dissociate da un tumore indotto da 1 cm3 BBN è di almeno 4 x 105 cellule. Quando le cellule sono inizialmente semiate nella matrice della membrana seminterrato, possono essere osservate cellule e detriti non cancerosi. I detriti sono stati gradualmente diluiti continuando la sottocultura. Figura 1B Mostra le immagini degli organoidi coltivati in punti temporali diversi. Se le cellule tumorali non formano organoidi tumorali, le cellule sono potenzialmente morte durante la fase di dissociazione. In tal caso, le procedure di dissociazione, compreso il tempo di incubazione con l'enzima, devono essere regolate per aumentare la vitalità cellulare.
Espressione di GFP negli organoidi tumorali della vescica utilizzando la manipolazione genetica mediata dal lentivirus Gli organoidi tumorali della vescica hanno mostrato forti segnali GFP con infezione lentivirale di successo (Figura 2B). Dopo la concentrazione, un totale di 250 l di supporti contenenti virus è stato sufficiente per infettare 3 x 104 cellule tumorali singole sulla matrice della membrana seminterrato, mantenendo il 90%-100% di efficienza dell'infezione. I segnali GFP potrebbero essere rilevati dagli organoidi tumorali della vescica 3 giorni dopo la trasduzione lentivirale. Se i segnali di fluorescenza sono bassi, l'efficienza dell'infezione virale è potenzialmente bassa. Ciò può essere dovuto a numerosi fattori, come il basso titro virale, e le procedure devono essere regolate di conseguenza.
Trapianto ortotopico di organoidi tumorali della vescica Un allotrapianto tumorale della vescica ottenuto da organoidi tumorali della vescica indotta da BBN è presentato nella Figura 3B16. Gli allotrapianti tumorali della vescica sono stati raccolti 3 settimane dopo il trapianto ortotopico. L'istologia del tumore della vescica trapiantato è stata analizzata utilizzando la colorazione H ed E. I trapianti ortotopici di organoidi tumorali possono crescere come tumori della vescica per 2-3 settimane.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig01.jpg"> Figura 1: Cultura in vitro degli organoidi tumorali della vescica del topo. (A) Diagramma schematico per la creazione di organoidi tumorali della vescica del topo. (B) Immagini rappresentative per la coltura degli organoidi tumorali della vescica in diversi punti temporali. Gli organoidi tumorali della vescica del topo sono stati stabiliti e coltivati in 9 giorni. Barra di scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig02.jpg"> Figura 2: Espressione di GFP negli organoidi tumorali della vescica utilizzando la manipolazione genetica mediata dal lentivirus. (A) Schematico della trafezione lentivirale e trasduzione degli organoidi tumorali della vescica. (B) Immagini rappresentative degli organoidi tumorali della vescica che esprimono GFP. Barre di scala : 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig03.jpg"> Figura 3: Trapianto ortotopico di organoidi tumorali della vescica. (A) Diagramma schematico del trapianto ortotopico di organoidi della vescica a un topo nudo. (B) Immagini rappresentative di vesciche e sezioni colorate H ed E da topi ortotopicamente trapiantati con organoidi tumorali della vescica. Le viste ingrandite delle regioni inscatolate nei pannelli centrali sono mostrate nei pannelli a sinistra. Barra della scala: 500 m. Questa cifra è stata riprodotta dal Supplemento Figura 1, Kim et al.16, pubblicato in base alla Creative Commons Attribution 4.0 International Public License (CC BY 4.0; https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Organoidi tumorali della vescica del mouse</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avanzato DMEM/F-12 (mezzo di base)</td>
			<td>10 m HEPES (pH 7.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mM di nicotina</td>
			<td>0.5x Supplemento senza siero</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM Dipeptide L-alanyl-L-glutamina</td>
			<td>1% Penicillina/Streptomicina</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>50 ng/mL Fattore di crescita epidermica murine</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 -M A 83-01</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Composizione del mezzo organoide tumorale della vescica.

Questo protocollo fornisce passaggi sperimentali dettagliati per stabilire una coltura tridimensionale in vitro degli organoidi tumorali della vescica derivati dal cancro della miscite della vescica indotta da cancerogeni cancero. Sono descritti metodi di coltura tra cui passaggio, ingegneria genetica e trapianto ortotopico di organoidi tumorali.

Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Gli organoidi tumorali sono stati ampiamente utilizzati come modello di cancro in vitro per studiare la biologia tumorale. Il nostro protocollo fornisce una procedura dettagliata per isolare, coltura e manipolare geneticamente gli organoidi tumorali della vescica che fungono da strumento critico per studiare vari aspetti della biologia del cancro. Usando il nostro protocollo, possiamo manipolare geneticamente gli organoidi del tumore della vescica per esprimere o eliminare il gene di nostro interesse.Inoltre, con il nostro metodo di trapianto ortotopico, possiamo creare un organoidi tumorali del microambiente tumorale intatto. A dimostrare la procedura sarà Yubin Kim, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Inizia stabilendo organoidi del tumore della vescica dal tumore della vescica murina.Aggiungere un millilitro di HEPES millimolare in DMEM ai frammenti tumorali e tritare il tessuto con una lama di rasoio sterilizzata. Per dissociare i frammenti in sospensione cellulare, aggiungere nove millilitri di DMEM con HEPES, collagenasi di tipo uno e due e termolisina ai pezzi tumorali e incubarli per 1,5-due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri.Centrifugare il tubo a 400 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante. Rimescolare il pellet in cinque millilitri di tampone di liscivie ACK e incubare il tubo a temperatura ambiente per tre o cinque minuti per lisciviare eventuali globuli rossi. Nel frattempo, rivestire un pozzo in una piastra da 24 po 'con 150 microlitri di fattore di crescita freddo ghiacciato ridotto matrice di membrana seminterrata e posizionare la piastra in un'incubatrice per 30 minuti.Aggiungere 20 millilitri di DMEM nel tubo con le cellule e ripetere la centrifugazione. Aspirare il supernatante e resospeso il pellet in un millilitro dello 0,25% di tripside EDTA e 10 micromolare Y-27632 diidrocloruro. Incubare il tubo per cinque minuti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Quindi neutralizzare la tripside aggiungendo 10 millilitri di DMEM con 10%FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri su un nuovo tubo da 50 millilitri per rimuovere i detriti non digeriti. Centrifugare il tubo a 400 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante.Quindi rimescolare il pellet con un millilitro di DMEM e contare le cellule con un emocitometro. Trasferire da tre a quattro volte 10 alle quattro cellule tumorali su un microtubo da 1,5 millilitri sul ghiaccio e centrifugarlo a 400 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare le cellule in 500 microlitri di mezzo organoide prebellico e 10 micromolare Y-27632.Trasferire la sospensione cellulare nella matrice di membrana precedentemente preparata rivestita bene e riposizionare la piastra di 24 pozzi nell'incubatore. Sostituire il mezzo ogni due giorni con 500 microlitri di mezzo organoide prebellico. Dividere gli organoidi tumorali 12 ore prima della trasduzione mediata dal Lentivirus.Il giorno successivo, scongelare rapidamente un virus contenente aliquota in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Aggiungere il virus scongelato a 250 microlitri di mezzo organoide con 10 micromolare Y-27632 e otto microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina. Sostituire il mezzo organoide nella piastra a 24 pozzi con 500 microlitri del virus contenenti mezzo e incubare la piastra per 12-16 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Per preparare gli organoidi tumorali della vescica per il trapianto ortotopico, aggiungere 500 microlitri di collagenasi dispasi al mezzo organoide nella piastra di 24 po '. Pipettare la matrice della membrana basale e il mezzo su e giù, quindi incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di DMEM prebellica.Quindi centrifugare il tubo a 400 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il supernatante. Risospendare il pellet con un millilitro di DMEM e trasferire la soluzione in una piastra di Petri da 90 millimetri. Al microscopio, raccogliere da 10 a 100 organoidi tumorali con una pipetta P200 e raccoglierli in un microtubo sul ghiaccio.Centrifugare il microtubo e rimuovere con cura il supernatante. Quindi mantenere il pellet sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'intervento chirurgico. Prima del trapianto di parete della vescica submucosa, tenere le siringhe, le punte delle pipette e la matrice della membrana basale sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'uso.Dopo che il mouse è stato anestetizzato, posarlo in posizione supina e mantenere l'anestesia per inalazione maschera del 2% di isoflurane vaporizzato. Applicare lo iodio di povidone con una garza sterile e pulirlo con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione trasversale nella pelle e nella parete muscolare dell'addome medioline inferiore con forbici chirurgiche sterili.Esporre la vescica dalla cavità addominale e sostenerla con un batuffolo di cotone imbevuto salino. Rimescolare i pellet organoidi in 80 microlitri di mezzo organoide contenente la matrice della membrana basale ad alta concentrazione del 50% e iniettare la sospensione nell'aspetto anteriore della cupola della vescica utilizzando la siringa per insulina. Chiudere l'incisione con una sutura di nylon 4-0 e disinfettare il sito chirurgico con iodio di povidone e 70% di etanolo.Lasciare che il mouse si riprenda sotto un irradiatore a infrarossi per 10-15 minuti. Quindi monitorare di nuovo il mouse fino a quando non riprende conoscenza. Gli organoidi tumorali della vescica del topo sono stati stabiliti e coltivati per nove giorni.Se le cellule tumorali non formano organoidi tumorali, sono state potenzialmente uccise durante la fase di dissociazione e potrebbe essere necessario regolare il tempo di digestione enzimatica. Gli organoidi tumorali della vescica mostravano forti segnali GFP con infezione lentivirale di successo. Dopo la concentrazione, un totale di 250 microlitri di virus contenenti media è stato sufficiente per infettare 30.000 singole cellule tumorali nella matrice della membrana basale e mantenere un'efficienza di infezione dal 90 al 100%.Le allografie tumorali della vescica sono state raccolte tre settimane dopo il trapianto ortotopico e l'istologia del tumore è stata analizzata utilizzando la colorazione H&E. I trapianti ortotopici di organoidi tumorali possono crescere come tumori della vescica per due o tre settimane. Seguendo questa procedura, i ricercatori possono eseguire l'immunoistochimica degli organoidi tumorali risultanti o effettuare una RT-PCR quantitativa per i geni di interesse.Questi esperimenti possono caratterizzare ulteriormente gli organoidi tumorali. Il nostro protocollo ci permette di manipolare facilmente i geni nelle cellule tumorali rispetto al modello del topo pur mantenendo le caratteristiche in vivo dei tumori al fine di studiare le funzioni specifiche di vari geni coinvolti nella tumorigenesi del cancro alla vescica.

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Cancer Research

Ricerca sul cancro

Vescica iniezione del mouse muro è un approccio utile per lo studio delle cellule staminali ortotopicamente della vescica e della biologia del cancro. Questo metodo microchirurgico delicato può essere padroneggiato con tecnica attenta e pratica.

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Tumori della vescica sono stabiliti in topi femmina in modo minimamente invasivo con il cateterismo, cauterizzazione locali, e l'adesione successiva delle cellule di carcinoma ai siti bruciare.

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Stabilire un modello di tumore della vescica ortotopica per valutare gli effetti antitumorali di sarna via endovescicale consegnate e monitoraggio della crescita tumorale con l'ecografia e imaging bioluminescente.

Un modello ortotopico tumore della vescica e la valutazione del trattamento intravescicale sarna

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Modellazione del tumore ortotopico della vescica in un modello murino: una procedura per la somministrazione intravescicale di cellule tumorali nella vescica murina

Impianto di cellule tumorali nell'organo di origine può servire come un modello preclinico utile per valutare nuove terapie. Cellule di carcinoma della vescica MB49 possono essere coltivate all'interno della vescica seguente instillazione intravescicale. Questo protocollo dimostra cateterizzazione della vescica topo a scopo di impianto tumorale e consegna adenovirale.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Un metodo semplice per determinare primario murino organoide tumore colon è descritto. Questo metodo utilizza la funzione che le cellule tumorali del colon sopravvivere e crescere in organoidi in terreni contenenti fattori di crescita limitate, mentre colon normale epiteliale non lo fanno.

In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.

Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono un potente strumento nella ricerca traslazionale sul cancro, che riflette sia l'eterogeneità genetica che fenotipica della malattia e la risposta alle terapie antitumorali personalizzate. Qui, viene dettagliato un protocollo consolidato per generare DOP di carcinoma della vescica primario umano in preparazione per la valutazione delle analisi fenotipiche e delle risposte ai farmaci.

Coltura di organoidi del cancro della vescica come strumenti di medicina di precisione

Questo protocollo descrive il processo di generazione e caratterizzazione di organoidi uroteliali di topo che ospitano delezioni in geni di interesse. I metodi includono la raccolta di cellule uroteliali di topo, la trasduzione ex vivo con adenovirus che guida l'espressione di Cre con un promotore CMV e la caratterizzazione in vitro e in vivo .

Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Impara a coltivare, manipolare geneticamente e trapiantare ortotopicamente organoidi tumorali della vescica del topo. Questo protocollo dettagliato consente di studiare la biologia del cancro vescicale in vivo.

Cultura, manipolazione e trapianto ortotopico di organidi tumorali della vescica del topo

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