Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari
15 novembre 2019
Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB.
Quello che presentiamo qui è un metodo robusto e semplice per analizzare la dinamica dei microtubuli utilizzando l'imaging confocale del disco rotante a cellule vive nelle cellule sincronizzate in prometafase, e le immagini vengono successivamente analizzate su una piattaforma basata su MATLAB. L'uso di proteine fluorescenti spostate verso il rosso in combinazione con la microscopia a disco rotante riduce la fototossicità. Pertanto, un numero maggiore di celle può essere immaginato all'interno della stessa preparazione.
La dinamicità dei microtubuli è alterata in un gran numero di condizioni patologiche. Pertanto, comprendere la regolazione e il comportamento delle dinamiche dei microtubuli in tali processi può aiutarci a comprendere il meccanismo della malattia e, infine, sviluppare terapie per compensarle. E il metodo è anche di lusso, quindi potrebbe potenzialmente essere applicato in uno sforzo di scoperta di farmaci.
Il metodo può essere modificato modificando il protocollo di desincronizzazione della fluorescenza e ottenendo cellule da diverse fasi del ciclo cellulare. Questo può essere utile quando si vagliano i farmaci contro i microtubuli e si identificano i difetti sulle cellule divisorie e non divisorie. È necessario ottimizzare il protocollo di trasfezione e la densità di semina per ogni tipo di cella.
Il livello di espressione di EB3 dovrebbe essere basso, al fine di rilevare singoli microtubuli in crescita. Iniziare risciacquando le cellule HeLa in crescita asincrona in DPBS, quindi incubarle con tripside-EDTA per cinque minuti, a 37 gradi Celsius. Interrompere la tripsininazione aggiungendo il mezzo RPMI-1640 integrato con FCS inattivato al calore del 10% con un rapporto tre a uno, il trypsin-EDTA aggiunto.
Calcola la concentrazione delle cellule secondo le indicazioni manoscritte e semina 50.000 cellule in ogni pozzo di un coverslip preparato e camerato. Restituire il coverslip all'incubatore e far crescere le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere le cellule dall'incubatrice e aggiungere 100 microlitri di miscela di trasfezione in ogni pozzo.
Riportare le cellule nell'incubatrice e dopo quattro ore di incubazione integrare le cellule con mezzo fresco e incubare ulteriormente per 20 ore. Preparare una soluzione micromolare da 2,5 di dimetilnatrone, o DME, in DMEM privo di fenolo rosso, integrata con 10%FCS e due l-glutammina millimolare. Sostituire il mezzo di crescita nel coverslip camerato con il mezzo di crescita DME e riportare le cellule nell'incubatore.
Dopo 3,5 ore di incubazione, trasferire le cellule al microscopio montando il coverslip camerato in una camera ambientale impostata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, con pannelli scuri per l'imaging. Quindi continuare l'incubazione per un totale di quattro ore. Eseguire l'imaging time lapse su un microscopio invertito con un'apertura numerica 100X, 1.49, obiettivo di immersione dell'olio, un sistema confocale a doppio disco e un affidabile sistema di messa a fuoco automatica.
Definire i parametri di imaging come descritto nel manoscritto testuale. Trovare una cellula in propase e mettere a fuoco nel piano Z corrispondente al centro del mandrino mitotico monopolare. Quindi acquisire immagini ogni 5 secondi, per un totale di un minuto, senza binning e senza illuminazione tra le esposizioni.
Inizia caricando il software di analisi numerica e aggiungendo la cartella U-track V2.2.0 nel percorso di ricerca software, chiamato GUI del selettore di film, dalla finestra di comando. Quindi importare i file non elaborati generati dal software di acquisizione delle immagini. Immettere manualmente l'apertura numerica dell'obiettivo e l'intervallo di tempo utilizzato per l'imaging.
Una volta caricate tutte le immagini, salvate la serie time lapse immessa come filmato selezionando Salva come elenco di film e l'opzione traccia u sul lato destro della finestra di dialogo. Selezionate i plus-end dei microtubuli dal menu a comparsa, quindi fate clic su ok, che apre una nuova finestra di dialogo per determinare i parametri dei tre passaggi dell'analisi. Per il primo passaggio, fare clic su Impostazioni e selezionare rilevamento comete dal menu a discesa.
Definire i parametri per la differenza tra il filtro gaussiano e la segmentazione dello spartiacque, come descritto nel manoscritto. Quindi selezionare Applica impostazioni a tutti i filmati e fare clic su Applica. Per il secondo passaggio, selezionare la dinamica plus-end del microtubulo e utilizzare le opzioni di impostazione per definire i valori per il collegamento, la chiusura dello spazio, l'unione e la divisione e le funzioni del filtro di Kalman, in base al manoscritto di testo.
Per problemi di dimensionalità, scegliete due dal menu a discesa e usate cinque fotogrammi per la chiusura dello spazio massimo e tre fotogrammi per la lunghezza minima dei segmenti di traccia fin dal primo passo. Come in precedenza, selezionare Applica impostazioni a tutti i filmati e fare clic su Applica. Per il terzo passaggio, scegliete la classificazione delle dinamiche dei microtubuli come metodo di analisi della traccia e definite i parametri tramite il pulsante di impostazione.
Selezionare le caselle per rimuovere le tracce all'inizio e alla fine del filmato ed effettuare istogrammi statistici. Nell'elenco a discesa, selezionate l'utilizzo di due o tre fotogrammi prima dello spazio in avanti e del 95° percentile della distribuzione della velocità dello spazio avanti, rispettivamente per la riclassificazione avanti e indietro. Una volta definiti tutti i parametri, selezionare applica controllo/deseleziona a tutti i filmati ed eseguire tutte le caselle dei filmati dalla finestra u-track dei riquadri di controllo, quindi premere Esegui.
Un messaggio viene visualizzato una volta completata l'elaborazione del filmato. Il pEB3-tdTomato plasmide è stato transiently espresso nelle cellule HeLa. Le cellule sono state sincronizzate con il trattamento DME.
Sono stati analizzati i filmati time lapse della crescita dei microtubuli e sono state tracciate la velocità di crescita e la dinamicità risultanti. I parametri descritti per influenzare l'analisi, ad esempio la lunghezza massima dello spazio e il fattore di restringimento massimo, sono stati modificati per lo stesso set di filmati time lapse. Sono stati calcolati i corrispondenti valori di velocità e dinamicità della crescita.
Sebbene la velocità di crescita risultante non sia stata influenzata in modo significativo, la dinamicità era diversa quando è stata modificata la lunghezza massima dello spazio. In tutti e tre i casi, il rilevamento di sottotracciati di microtubuli era simile, ma la ricostruzione delle traiettorie mt complete è stata influenzata principalmente quando la lunghezza massima dello spazio è stata impostata su 15. Al fine di valutare se le condizioni di imaging interferivano con il comportamento dei microtubuli, la prima e la seconda metà della serie time lapse sono state analizzate separatamente e la corrispondente velocità di crescita e dinamicità sono state confrontate.
Come previsto, non sono state rilevate differenze significative. È importante tenere a mente che poiché le cellule sono sincronizzate in prometafase, la densità del microtubulo è molto alta. Pertanto, è necessario impostare i parametri dell'analisi con molta attenzione, non identificare erroneamente diversi microtubuli.
La misurazione della dinamica dei microtubuli con questo metodo può essere confrontata con studi su altri bersagli biologici direttamente, indirettamente, regolando i microtubuli.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo solido per analizzare la dinamica dei microtubuli in cellule sincronizzate in prometafase, utilizzando la microscopia confocale a disco rotante su cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB. La tecnica permette una ridotta fototossicità, consentendo l'acquisizione di immagini di un numero maggiore di cellule e contribuendo alla comprensione della dinamica dei microtubuli sia in condizioni normali che patologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Dinamica dei microtubuli
- Sincronizzazione cellulare
- Immagini in tempo reale su cellule vive
Sfondo
- La dinamica dei microtubuli è fondamentale per la divisione cellulare ed è alterata in molte malattie.
- Comprendere il loro controllo può contribuire a chiarire i meccanismi delle malattie.
- Il metodo può inoltre essere adattato per applicazioni nella scoperta di farmaci.
Metodi Utilizzati
- Microscopia confocale a disco rotante per cellule vive
- Cellule HeLa sincronizzate in prometafase
- Acquisizione sincronizzata di immagini con proteine fluorescenti a spostamento verso il rosso
Risultati principali
- Un'analisi completa della dinamica delle estremità più dei microtubuli.
- I dati hanno indicato un impatto minimo delle impostazioni di acquisizione sull' velocità di crescita, ma effetti significativi sulla dinamicità.
- Raggiunta una tracciatura robusta e una caratterizzazione del comportamento dei microtubuli durante la divisione cellulare.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo dettagliato per l'analisi della dinamica dei microtubuli, applicabile nella ricerca clinica e nello sviluppo di farmaci.
- Questo lavoro migliora la comprensione del comportamento dei microtubuli nelle cellule e identifica potenziali bersagli terapeutici per malattie correlate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la dinamica dei microtubuli è fondamentale per la validazione degli obiettivi nei programmi di oncologia e di malattie neurodegenerative, in cui la disregolazione del citoscheletro determina la patologia. Questo metodo consente un'analisi quantitativa ad alto contenuto informativo del comportamento dei microtubuli in cellule mitotiche sincronizzate, supportando la riduzione del rischio meccanicistico di composti che bersagliano la tubulina o i regolatori associati. Riducendo la fototossicità e permettendo un'acquisizione di immagini su larga scala, migliora la robustezza dei dati e la fiducia traslazionale nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della dinamica delle estremità più dei microtubuli come lettura funzionale dell'interazione con il bersaglio nelle vie mitotiche.
- Valore operativo: Utilizza EB3-tdTomato e microscopia a disco rotante per rilevare singoli microtubuli in crescita con bassa fototossicità, favorendo misurazioni riproducibili.
- Valore predittivo: Fornisce metriche di dinamicità che si correlano con gli effetti del composto sulla fedeltà mitotica, agevolando l'identificazione e la priorizzazione di composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output quantitativi della velocità di crescita e della dinamicità mediante il software U-Track, consentendo uno screening standardizzato di agenti che modulano i microtubuli.
- Scalabilità: Permette l'acquisizione di immagini di popolazioni cellulari più ampie in condizioni di coltura standard, aumentando la produttività per il profilo dei composti.
- Riproducibilità: Un'analisi automatica supervisionata garantisce robustezza statistica tra i replicati, favorendo la trasferibilità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Misura direttamente la dinamica dei microtubuli alterata in condizioni patologiche, collegando i risultati ottenuti in vitro ai meccanismi delle malattie.
- Continuità traslazionale: Favorisce il passaggio dalla validazione del bersaglio ai modelli preclinici fornendo fenotipi citoscheletrici conservati e quantificabili.
- Contenimento del rischio: Permette la rilevazione precoce di effetti collaterali sui microtubuli, riducendo l'abbandono in fasi avanzate dovuto a citotossicità o instabilità genomica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in particolare per i flussi di lavoro incentrati su inibitori mitotici, stabilizzatori o destabilizzatori dei microtubuli.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui regolatori dei microtubuli quantificando la cinetica di crescita e riduzione in cellule sincronizzate.
- Screening: Fornisce letture quantitative pronte per saggi (velocità di crescita, dinamicità) adatte per campagne di screening ad alto contenuto informativo.
- Analisi: Utilizza U-Track per l'analisi automatizzata delle traiettorie, consentendo il confronto statistico tra condizioni trattate con composti e condizioni di controllo.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi del citoscheletro agli esiti preclinici misurando la dinamica in contesti mitotici rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging e analisi riutilizzabile in diversi programmi mirati alla tubulina.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica riguardo ai composti diretti ai microtubuli.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione della dinamica dei microtubuli mediante cellule sincronizzate, riduzione della fototossicità e tracciamento automatizzato.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo segnali precoci e quantitativi di sicurezza ed efficacia citoscheletrica.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento proporzionato al rischio identificando composti con profili favorevoli di modulazione dei microtubuli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagineggiamento di cellule vive, nell'ottimizzazione della trasfezione e nella biologia dei microtubuli.
- È dipendente dalla microscopia confocale a disco rotante, dal controllo della camera ambientale e dall'uso di obiettivi ad alta apertura numerica con immersione in olio.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di trasfezione, della densità di semina e dei tempi di sincronizzazione tra diversi tipi cellulari.
- Richiede l'adattamento dei parametri di U-Track (ad esempio, lunghezza del gap, fattore di riduzione) per evitare identificazioni errate in ambienti con elevata densità di microtubuli.
- È limitato dalla necessità di una bassa espressione di EB3 per risolvere i singoli estremi positivi dei microtubuli, richiedendo una titolazione specifica per ogni linea cellulare.
