Name: Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite limaging tridimensionale del cuore autorizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato. Questo metodo consente di tracciare le cellule durante lo sviluppo e la rigenerazione cardiaca.

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I finanziamenti per questo progetto sono stati forniti dalla UW School of Medicine and Public Health dal Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), e da un American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per l'uso e la cura degli animali da laboratorio e in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee presso la School of Medicine and Public Health dell'Università del Wisconsin-Madison. Tutti i metodi sono stati eseguiti su wild tipo C57BL/6J (B6) e linee di mouse transgenici ottenute da Jackson Laboratories.
1. Occlusione coronaria Arteria (Infarzione miocardiale) Indotta tramite la legatura dell'Arteria Discendente Anteriore Sinistra (LAD) in Topi Neonatale di 1 giorno6
<ol><li>Separare i cuccioli neonatale di 1 giorno dalla madre mettendoli in una gabbia pulita insieme ad alcuni dei materiali di nidificazione originali.</li>
	<li>Posizionare metà della gabbia su un pad di riscaldamento impostato a fuoco medio. I cuccioli devono rimanere sul lato non riscaldato della gabbia, essendo collocati solo sul lato riscaldato dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Creare un'area chirurgica sterile al microscopio operativo. Raccogliere apparecchiature chirurgiche sterilizzate (Tabella 1).</li>
	<li>Anestesizzare il cucciolo tramite ipotermia: avvolgere il cucciolo in garza per evitare il contatto diretto della pelle con il ghiaccio e seppellirlo in un letto di ghiaccio per circa 3-4 min. Controllare periodicamente l'ipotermia dei topi eseguendo un pizzico di punta. I neonati tollerano bene l'ipotermia, tuttavia, l'esposizione prolungata all'ipotermia può provocare congelamento e mortalità successiva.</li>
	<li>Una volta anetizzato, posizionare il mouse sull'area chirurgica in posizione supina, fissando le braccia e le gambe con del nastro adesivo. Sterilizzare l'area chirurgica del topo con una soluzione antisettica.</li>
	<li>Individuare la regione inferiore del torace e fare un'incisione trasversale nella pelle con piccole forbici dissettive. Per allargare la vista chirurgica delle costole, separare la pelle dal muscolo sollevando delicatamente la pelle con un paio di pinze spogliatoie e premere delicatamente contro i muscoli intercostali con le piccole forbici in posizione chiusa.</li>
	<li>Individuare il quarto spazio intercostale (Figura 1A) e fare una piccola puntura superficiale utilizzando pinze affilate, facendo attenzione a non forare gli organi interni. Eseguire una dissezione smussata allargando l'area tra i muscoli intercostali con le pinze di vestire. Un corretto posizionamento anatomico dell'incisione è essenziale per un adeguato accesso al cuore.</li>
	<li>Guidare delicatamente il cuore dalla cavità toracica posizionando un dito e applicando una pressione crescente sul lato sinistro dell'addome tenendo lo spazio intercostale aperto con pinze da spogliatoio (Figura 1B). Una volta che il cuore è fuori dal petto, rimuovere le pressioni medicazione, alleviare la pressione, e lasciare riposare il cuore sui muscoli intercostali.</li>
	<li>Individuare il LAD come l'area del cuore che ha meno sangue raggruppato ed è nella posizione anatomica corretta (Figura 1C). Il LAD può essere visto solo al microscopio se il cuore è accessibile entro pochi minuti dall'inizio dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Eseguire la legatura LAD suturando il LAD con una sutura 6-0 (Figura 1D). Legare due volte un nodo quadrato per indurre l'infarto miocardico (Figura 1E). La profondità della sutura nel miocardio può variare, tuttavia, il corretto posizionamento anatomico della legatura LAD è fondamentale per la riproducibilità. Quando si lega il LAD, la sutura deve essere tirata con attenzione ma con attenzione in modo da non recidere il LAD. Sbiancamento all'apice del cuore sarà visto immediatamente (Figura 1E)</li>
	<li>Lasciare che il cuore scivoli di nuovo nella cavità toracica; questo processo può essere facilitato delicatamente con pinze di medicazione. Suturare le costole insieme a un nodo del chirurgo seguito da un nodo quadrato, utilizzando pinze smussate per sollevare l'insieme superiore delle costole mentre si passa una sutura 6-0 attraverso la parte superiore e inferiore di costole.</li>
	<li>Rimuovere il nastro che è stato utilizzato per fissare le zampe posteriori del cucciolo.</li>
	<li>Aderire la pelle insieme mettendo una piccola quantità di colla della pelle sull'addome superiore. Quindi, afferrare la pelle dell'addome inferiore con pinze sottili e coprire la regione del torace esposta. Limitare la quantità di colla in eccesso che rimane sui cuccioli, in quanto questo può aumentare la probabilità di rigetto e cannibalismo da parte della madre.</li>
	<li>Facilitare immediatamente il recupero dall'anestesia posizionando il cucciolo su un pad di riscaldamento impostato a calore medio. Periodicamente cambiare il posizionamento dei neonati per riscaldare uniformemente tutte le parti del corpo.</li>
	<li>Lasciare che il neonato rimanga direttamente sul pad di riscaldamento per 10-15 min. In genere, il movimento viene riacquistato entro 5 minuti dall'essere messo a fuoco.</li>
	<li>Pulire il sangue residuo e incollare con una salvietta alcolica.</li>
	<li>Coprire i profumi stranieri sui neonati strofinando l'intero corpo con biancheria da letto dalla gabbia originale. Posizionare il cucciolo nella gabbia sul lato riscaldato mentre vengono eseguiti altri interventi chirurgici.</li>
	<li>Una volta completati tutti gli interventi chirurgici e i cuccioli sono caldi e mobili, trasferisci la lettiera insieme al materiale di nidificazione originale nella gabbia della madre.</li>
	<li>Monitorare i topi per 30-60 min dopo l'intervento chirurgico e guardare per l'accettazione della madre dei cuccioli da nidificazione e/o toelettatura.</li>
	<li>Controllare i topi la mattina dopo l'intervento chirurgico. Se la madre è in difficoltà e non ha annidato i cuccioli, prendere in considerazione una madre affidataria per i cuccioli.</li>
</ol>2. Cancellazione del cuore del mouse con CLARITY passivo21,22,23
<ol><li>Anestesizzare il topo con isoflurane. Eseguire un pizzico di punta per assicurarsi che il mouse sia completamente sedato.</li>
	<li>Posizionare il mouse su un'area pulita e chirurgica in posizione supina, fissando le braccia e le gambe con del nastro adesivo.</li>
	<li>Mantenere la sedazione isoflurano sul mouse utilizzando un cono naso fino a quando il cuore viene estratto.</li>
	<li>Aprire il torace inferiore tenendo la pelliccia appena sotto il processo xifoide con pinze tissutali e fare un'incisione che si estende la larghezza della gabbia toracica utilizzando le grandi forbici dissettive.</li>
	<li>Tagliare a fianco delle porzioni distale della gabbia toracica con forbici chirurgiche.</li>
	<li>Esporre il muscolo del diaframma afferrando il processo xifoide con pinze tissutali. Staccare il diaframma utilizzando pinze curve.</li>
	<li>Pur mantenendo una presa del processo xifoideo, tirare il tessuto cranicamente fino a quando il cuore pulsante è accessibile.</li>
	<li>Afferra il cuore alla base con pinze curve e seziona il cuore dalla cavità toracica tagliando l'aorta e la vena cava superiore con forbici iridectomia.</li>
	<li>Mentre il cuore batte ancora, posiziona il cuore in un piatto Petri pieno di PBS in modo che il cuore pompa il sangue all'interno mentre continua a battere. L'infarto miocardico può essere confermato controllando che il posizionamento della sutura sia nella giusta posizione anatomica per la legatura LAD.</li>
	<li>Stringere delicatamente il cuore con le pinze per consentire al cuore di espellere il sangue residuo.</li>
	<li>Trasferire il cuore del mouse in una fiala di vetro usa e getta da 2,5 mL con 2 mL di PBS. Lavare via il sangue residuo incubando il cuore su uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) più volte. Modificare la soluzione PBS ogni volta fino a quando PBS rimane chiaro.</li>
	<li>Scartare il PBS e riempire la fiala con 2 mL di freddo 4% paraformaldeide (PFA). Incubare per 4 ore a RT (Figura 2A).</li>
	<li>Dopo l'incubazione, scartare il PFA e la fiala con 2 mL di PBS. Lavare il cuore su uno shaker per 10 minuti a RT. Ripetere due volte il passaggio di lavaggio, drenando e riempiendo la fiala con nuova PBS ogni volta per lavare completamente via l'eccesso di PFA.</li>
	<li>Scartare PBS e riempire la fiala con 2 mL del 4% acrilammide e 0,5% della soluzione VA-044. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Il giorno successivo, eseguire la polimerizzazione trasferendo la fiala in un blocco di calore fissato a 37 gradi centigradi per 3 ore.</li>
	<li>Trasferire il cuore in una nuova fiala di guscio di vetro e ripetere il passaggio 2.12 (ciclo di lavaggio PBS).</li>
	<li>Scartare PBS e riempire la fiala con 2 mL di Soluzione di compensazione (Tabella 2). Incubare a 37 gradi centigradi fino a quando il cuore non viene eliminato. Cambia la soluzione e ricaricala con una soluzione di compensazione fresca ogni 2-3 giorni. Il processo di cancellazione potrebbe richiedere diverse settimane (Figura 2B-C). NOTA: i cuori P1 in genere richiedono circa 3-5 giorni, mentre i cuori P21 possono richiedere quasi un mese prima che l'incubazione della soluzione di compensazione sia completa.</li>
	<li>Scartare PBS e riempire la fiala con 2 mL di PBS e ripetere il passaggio 2.12 (ciclo di lavaggio PBS). Riempire la fiala con PBS fresco e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Se verrà eseguita l'immunostaining, saltare i passaggi 2.21–2.22 e passare alla Sezione 3 per l'immunostaining. Se si basa esclusivamente sulla fluorescenza endogena, procedere con i passaggi 2.21–2.22 e saltare la Sezione 3.</li>
	<li>Eliminare PBS e modificare la soluzione in Refractive Index Matching Solution (RIMS)(Tabella 3). Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, il tessuto sgomberato può essere conservato nella soluzione RIMS a RT. Tessuto può sembrare bianco e opaco al centro quando viene trasferito per la prima volta in RIMS; tessuto dovrebbe diventare trasparente dopo essere stato incubato in RIMS a temperatura ambiente per diverse settimane(Figura 2D).</li>
</ol>3. Facoltativo: Colorazione immunostochimica del cuore del topo di tutto il monte
<ol><li>Rimuovere il cuore eliminato dalla soluzione RIMS e mettere in una fiala di vetro pulita da 2,5 mL con 2 mL di PBST (PBS con 0,1% Triton-X 100)</li>
	<li>Lavare il cuore in PBST 3 volte su un rotatore orbitale con 30 incubazioni min a RT.</li>
	<li>Bloccare il legame anticorpale non specifico immergendo il cuore in 2 mL del buffer di blocco del 20% (diluito in PBST) e incubare con rotazione per 3 ore a 0R. Trasferire a 4 gradi centigradi per macchiare con rotazione durante la notte. NOTA: il buffer di blocco è costituito da un siero normale corrispondente alle specie in cui è stato allevato l'anticorpo secondario.</li>
	<li>Lavare il cuore in PBST 3 volte con rotazione per 5 incubazioni min a RT.</li>
	<li>Immergere il cuore nell'anticorpo primario (diluito nel buffer di blocco del 2% con PBST) e prevenire l'esposizione alla luce avvolgendo la fiala di vetro in un foglio di alluminio. Incubare con rotazione durante la notte a RT. NOTA: Da questo punto in avanti, la lamina di alluminio deve essere continuamente utilizzata per proteggere il secondario dall'esposizione alla luce ambientale.</li>
	<li>Incubare per altre 24 ore con rotazione a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Dopo la colorazione primaria, ripetere il passaggio 3.2 (lungo ciclo di lavaggio PBST) per rimuovere l'anticorpo primario non associato dal tessuto. Estendere il lavaggio con un'incubazione notturna con rotazione a RT.</li>
	<li>Lavorando in un'area con illuminazione limitata per prevenire l'esposizione alla luce dell'anticorpo secondario, immergere il cuore in anticorpi secondari (diluiti nel buffer di blocco del 2% con PBST) e incubare con rotazione per 3 ore a RT. Trasferire a 4 gradi centigradi per macchiare con rotazione durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, ripetere il passaggio 3.2 (ciclo di lavaggio PBST lungo) per rimuovere l'anticorpo secondario non associato.</li>
	<li>Sostituire la soluzione con buffer di blocco del 2% (diluito in PBST). Rimuovere l'anticorpo residuo non legato lavando si è durante la notte con la rotazione a RT.</li>
	<li>Il giorno successivo, controllare che l'anticorpo secondario in eccesso sia stato rimosso utilizzando la microscopia confocale. Estendere il lavaggio in base alle esigenze, sostituendo la soluzione di buffer di blocco del 2% ogni giorno. Procedere una volta poco o nessun secondario non specifico è presente.</li>
	<li>Conservare il cuore immunocolorato in PBS a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Direttamente prima della microscopia a montaggio completo, incubare il cuore nella soluzione RIMS durante la notte a 37 gradi centigradi. Estendere l'incubazione di altre 24 ore se il tessuto non è ancora completamente eliminato.</li>
	<li>Conservare il cuore completamente eliminato e immunostained in RIMS presso RT.</li>
</ol>4. Visualizzazione delle popolazioni non miocite in 3D con l'imaging di microscopia confocale monofotonico del cuore del topo eliminato
NOTA: Se i cuori dei topi vengono raccolti embrionalmente, continuare con la sezione 4.1. Per i cuori di topo raccolti postnatally, continuare con la sezione 4.2.
<ol><li>Imaging del cuore del topo embrionale cancellato<ol>
<li>Riempire il vetrino di depressione del microscopio con la soluzione PBS.</li>
		<li>Raccogliere con attenzione il cuore sgomberato con pinze curve e posizionare il tessuto sul vetrino.</li>
		<li>Montare lo scivolo con una vetrina di vetro. Il tessuto può ora essere immaginato al microscopio confocale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immaginare il cuore del topo postnatale cancellato<ol>
<li>Riempire metà della camera dello scivolo depressione con soluzione PBS. Al fine di creare una camera abbastanza grande da adattarsi a un cuore di topo adulto, una diapositiva di depressione in polipropilene stampata in 3D è stata realizzata su misura (Figura 4).</li>
		<li>Raccogliere con attenzione il cuore sgomberato con pinze curve e posizionare il tessuto nella camera. Riempire il volume rimanente della camera con PBS.</li>
		<li>Riempire la camera con PBS in modo che la superficie del liquido formi una cupola sopra la parte superiore della camera. Montare lo scivolo di copertura. Il tessuto può ora essere immaginato al microscopio confocale verticale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le interazioni cellule-cellule tra cardiomiociti e popolazioni non miociti sono un fattore determinante se il cuore subirà fibrosi o riparazione a seguito di lesioni. Sono state fatte scoperte dimostrando che una varietà di tipi di cellule, tra cui nervi14, cellule epicardiche24, macrofagi peritoneali25, arterioles 12,13, e cellule endoteliali linfatiche26, tutti svolg...

Il cuore è stato a lungo considerato un organo post-mitotico, ma prove recenti dimostrano che il rinnovamento cardiomiocito si verifica nel cuore umano adulto a circa 1% all'anno1. Tuttavia, questi bassi tassi di avvicendamento cardiomiocito sono insufficienti per ricostituire la massiccia perdita di tessuto che si verifica dopo lesioni. Un cuore che ha subito un infarto miocardico perderà circa un miliardo di cardiomiociti, spesso servendo come preludio all'insufficienza cardiaca e morte cardiaca improvvisa2,3. Con oltre 26 milioni di persone affette da insufficienza cardiaca in tutto il mondo, c'è un bisogno insoddisfatto di terapie che possono invertire i danni inflitti da malattie cardiache4.
Al fine di colmare questa lacuna nelle terapie, gli scienziati hanno iniziato a studiare meccanismi evolutivamente conservati che sono alla base della rigenerazione endogena a seguito di lesioni. Un modello per studiare la rigenerazione cardiaca dei mammiferi è il topo neoooatale. Entro la settimana successiva alla nascita, i topi neonatali hanno una robusta risposta rigenerativa in seguito a danni cardiaci5. Abbiamo dimostrato in precedenza che i topi neotossici possono rigenerare il loro cuore attraverso la proliferazione cardiomiocite a seguito di una resezione apicale5. Anche se questa tecnica può evocare la rigenerazione cardiaca nei neonati, l'intervento chirurgico manca di rilevanza clinica per le lesioni cardiache umane. Al fine di imitare una lesione umana nel modello murino neonatale, abbiamo sviluppato una tecnica per indurre un infarto miocardico attraverso un'occlusione coronaria6. Questa tecnica richiede la legatura chirurgica dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), che è responsabile della consegna 40-50% del sangue al miocardico ventricolare sinistro6,7. Così, l'intervento chirurgico si traduce in un infarto che colpisce una parte significativa della parete ventricolare sinistra. Questo danno al miocardio stimolerà la proliferazione cardiomiocita e la rigenerazione del cuore nei neonati5.
La chirurgia dell'occlusione coronaria fornisce un metodo altamente riproducibile e direttamente traslazionale per scoprire il funzionamento interno della rigenerazione cardiaca. La chirurgia neonatale parallela all'aterosclerosi coronaria nel cuore umano, dove l'accumulo di placca all'interno delle pareti interne delle arterie può causare un'occlusione e la successiva infarto miocardico8. A causa di un vuoto nei trattamenti terapeutici per i pazienti con insufficienza cardiaca, un'occlusione nel LAD è associata a tassi di mortalità che raggiungono fino al 26% entro un anno dopo la lesione9, e di conseguenza è stato definito il "fabbricante di vedove". I progressi nelle terapie richiedono un modello che rifletta con precisione i complessi effetti fisiologici e patologici delle lesioni cardiache. Il nostro protocollo chirurgico per lesioni cardiache del topo neooatale fornisce una piattaforma che consente ai ricercatori di studiare gli spunti molecolari e cellulari che segnalano la rigenerazione cardiaca dei mammiferi dopo l'infortunio.
Recenti ricerche evidenziano la relazione dinamica tra l'ambiente extracellulare e i cardiomiociti che proliferano. Ad esempio, la finestra rigenerativa postnatale può essere estesa diminuendo la rigidità della matrice extracellulare che circonda il cuore10. I biomateriali della matrice extracellulare neooooordinata possono anche promuovere la rigenerazione del cuore nei cuori dei mammiferi adulti dopo lesioni cardiache11. Anche la proliferazione cardiomiocite di accompagnamento è una risposta angiogenica12,13; formazione arteria collaterale unica per il cuore rigenerante del topo neonatale ha dimostrato di essere essenziale per stimolare la rigenerazione cardiaca12. Inoltre, il nostro laboratorio ha dimostrato che la segnalazione del nervo regola la proliferazione cardiomiocita e la rigenerazione del cuore attraverso la modulazione dei livelli dei fattori di crescita, così come la risposta infiammatoria a seguito di lesioni14. Questi risultati sottolineano la necessità di tracciare le popolazioni di cellule non miocite in risposta a lesioni cardiache. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sfruttato il sistema di ricombinazione Cre-lox in linee di topi transgenici per incorporare l'espressione coniugale o condizionale di proteine reporterfluescenti per la tracciatura del lignaggio. Inoltre, possiamo usare metodi avanzati per determinare il pattern di espansione clonale con la linea del mouse Arcobaleno, che si basa sull'espressione stocastica dei reporter fluorescenti multicolore dipendenti da Cre per determinare l'espansione clonale delle popolazioni di cellule mirate15. L'utilizzo del tracciamento del lignaggio con la chirurgia occlusione coronaria neonatale è un potente strumento per sezionare gli intricati meccanismi cellulari della rigenerazione cardiaca.
Monitorare il lignaggio delle cellule etichettate fluorescentmente con immagini di organi interi tridimensionali (3D) è difficile da ottenere utilizzando la tecnica tradizionale di sezionamento e ricostruzione, soprattutto quando le popolazioni di cellule sono fragili, come le fibre nervose o i vasi sanguigni. Mentre l'imaging diretto dell'intero montaggio dell'organo mediante sezionamento ottico può catturare le popolazioni di cellule superficiali, le strutture che risiedono in profondità all'interno del tessuto rimangono inaccessibili. Per aggirare queste barriere, sono state sviluppate tecniche di compensazione dei tessuti per ridurre l'opacità di interi tessuti dell'organo. Recentemente, sono stati fatti progressi significativi per i metodi basati su acdovesione compatibile con Acrylamide- Rigid Imaging compatibile Con Privo HYdrogel (CLARITY), che cancellano il tessuto fisso tramite estrazione lipidica16. Vengono inoltre adottate misure per omogeneizzare l'indice di rifrazione e successivamente ridurre la dispersione della luce durante l'imaging17. Uno di questi metodi è CLARITY attivo, che accelera la decomposizione dei lipidi utilizzando l'elettroforesi per penetrare il detersivo in tutto il tessuto18. Anche se efficace, questo metodo di compensazione dei tessuti richiede attrezzature costose e può causare danni ai tessuti, rendendo l'approccio incompatibile con le popolazioni cellulari fragili come i nervi cardiaci19. Così, impieghiamo l'approccio passivo CLARITY, che si basa sul calore per facilitare delicatamente la penetrazione del detergente, aiutando quindi nella conservazione di strutture cellulari intricate20,21.
Il CLARITY passivo è tipicamente pensato per essere meno efficiente di QUELLO attivo CLARITY18, in quanto la tecnica è spesso accompagnata da due ostacoli principali: l'incapacità di cancellare l'intera profondità dell'organo e l'ampia quantità di tempo necessaria per cancellare i tessuti adulti. Il nostro approccio passivo CLARITY supera entrambe queste barriere con un processo di compensazione accelerato che è in grado di eliminare completamente il tessuto cardiaco neooatale e adulto. La nostra tecnica passiva di compensazione dei tessuti CLARITY ha raggiunto un'efficienza che permette la visualizzazione di una varietà di popolazioni di cellule cardiache, tra cui popolazioni rare distribuite in tutto il cuore adulto. Quando il cuore sgomberato è immaginato con microscopia confocale, l'architettura di patterning specifici delle cellule durante lo sviluppo, la malattia e la rigenerazione può essere illuminata.

<table><tbody><tr><td>1-tioglicerolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture in prolene</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>Suture in polipropilene</td></tr><tr><td>acrilammide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acido</td><td></td><td></td><td></td>borico</tr><tr><td>Pinze curve</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>semicurve, seghettate, 4 in</td></tr><tr><td>pinze per medicazione</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>Fiala da dissezione, 4,5 pollici in</td></tr><tr><td>vetro</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>Fiala da 12 x 35 mm con tappo</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Forbici per iridectomia con gradiente di densità media</td></tr><tr><td></td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione grandi</td> da 2 mm <td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>Dritte, porta</td></tr><tr><td>aghi</td> da 6 pollici <td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6 in</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sharp Forceps</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>Punta fine, Dritto, 4.25 in</td></tr><tr><td>Small Dissecting Forbice</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30 mm Tagliente</td></tr><tr><td>Sodio Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti Excelta</td><td></td><td>16050133</td><td>Tessuto medio, 1X2 denti</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals Iniziatore</td><td></td><td>azoico solubile in acqua</td></tr></tbody></table>

catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

La malattia cardiovascolare supera tutte le altre cause di morte ed è responsabile di uno sconcertante 31% dei mortali in tutto il mondo. Questa malattia si manifesta in lesioni cardiache, principalmente sotto forma di un infarto miocardico acuto. Con poca resilienza dopo un infortunio, il tessuto cardiaco una volta sano sarà sostituito da tessuto cicatriziale fibroso e non contrattuale e spesso sarà un preludio all'insufficienza cardiaca. Per identificare nuove opzioni di trattamento nella medicina rigenerativa, la ricerca si è concentrata sui vertebrati con capacità rigenerative innate. Uno di questi organismi modello è il topo neonato, che risponde alle lesioni cardiache con robusta rigenerazione miocardiale. Al fine di indurre una lesione nel topo neonatale che è clinicamente rilevante, abbiamo sviluppato un intervento chirurgico per occludono l'arteria discendente anteriore sinistra (LAD), rispecchiando un'infarzione miocardiale innescata dall'aterosclerosi nel cuore umano. Se abbinato alla tecnologia per monitorare i cambiamenti sia all'interno di cardiomiociti che di popolazioni non miociti, questo modello ci fornisce una piattaforma per identificare i meccanismi che guidano la rigenerazione del cuore. Ottenere informazioni sui cambiamenti nelle popolazioni di cellule cardiache a seguito di lesioni una volta si è basato pesantemente su metodi come il sezionamento dei tessuti e l'esame istologico, che sono limitati all'analisi bidimensionale e spesso danneggiano il tessuto nel processo. Inoltre, questi metodi non sono in grado di tracciare i cambiamenti nei lignaggi cellulari, fornendo invece semplicemente un'istantanea della risposta alle lesioni. Qui, descriviamo come i metodi tecnologicamente avanzati nei modelli di tracciamento del lignaggio, nella cancellazione di organi interi e nella microscopia tridimensionale (3D) a montaggio intero possono essere utilizzati per chiarire i meccanismi di riparazione cardiaca. Con il nostro protocollo per la chirurgia dell'infarto miocardico del topo neocardico, la compensazione dei tessuti e l'imaging dell'intero organo 3D, i percorsi complessi che inducono la proliferazione cardiomiocita possono essere svelati, rivelando nuovi obiettivi terapeutici per la rigenerazione cardiaca.

Spesso i due passi più impegnativi sono guidare il cuore fuori dalla cavità toracica e legare il LAD. Per risolvere questi passaggi, possono essere effettuate regolazioni nel posizionamento della puntura iniziale tra i quattro muscoli intercostali; se la puntura e la dissezione contundente sono troppo vicine in prossimità dello sterno, il cuore potrebbe non essere in grado di uscire dalla cavità toracica (Figura 1A).
Inoltre, potrebbe essere neces...

La proliferazione cardiomiocite a seguito di lesioni è un processo dinamico che richiede una sinfonia di segnali extracellulari da popolazioni di cellule non miociti. Utilizzando il tracciamento del lignaggio, il CLARITY passivo e le tecniche di microscopia confocale a cavalcatura integrale tridimensionale, possiamo analizzare l'influenza di una varietà di tipi di cellule sulla riparazione e rigenerazione cardiaca.

Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

La rigenerazione endogena del cuore è un processo dinamico che coinvolge più tipi di cellule che lavorano insieme di concerto per montare una robusta risposta rigenerativa. Scrutare il tessuto rigenerante attraverso l'imaging 3D del cuore sgombrato in risposta alle lesioni può aiutare nella ricostruzione della dinamica cellulare che guida questa risposta rigenerativa cardiaca. Il nostro protocollo è specificamente progettato per tracciare le cellule durante lo sviluppo e la rigenerazione.Non prevediamo alcuna limitazione nell'applicazione ampia delle nostre tecniche di compensazione, colorazione e imaging ad altri tipi di organi. Per l'occlusione coronarica indotta da LAD, sterilizzare prima l'area chirurgica di un cucciolo neonatale anestetizzato di un giorno con soluzione antisettica. Fai un'incisione cutanea trasversale nella regione toracica.Per separare la pelle dal muscolo, utilizzare un paio di forcep di medicazione per sollevare la pelle con attenzione mentre si premono delicatamente le forbici contro i muscoli intercostali in posizione chiusa. Individuare il quarto spazio intercostale e utilizzare piccole pini per fare una piccola puntura superficiale facendo attenzione ad evitare gli organi interni. Usando la dissezione smussata e le forcep di medicazione, allargare l'area tra i muscoli intercostali fino a quando un dito può essere applicato sul lato sinistro dell'addome tenendo aperto lo spazio intercostale con le forcep di medicazione per guidare delicatamente il cuore fuori dalla cavità toracica.Una volta estratto il cuore, lasciare riposare il cuore sui muscoli intercostali e localizzare il LAD come regione del cuore con meno sangue in pool. Per indurre l'infarto del miocardio, utilizzare una sutura 6-0 per legare saldamente un nodo quadrato intorno al vaso due volte senza recidere l'arteria. Lo sbiancamento all'apice deve essere osservato immediatamente.È importante rimanere coerenti sul posizionamento della sutura lungo il LAD per una dimensione infarct simile. Questo si ottiene al meglio accedendo rapidamente al cuore mentre il sangue scorre ancora attraverso le arterie. Quando la sutura è stata posizionata, lasciare che il cuore scivoli di nuovo nella cavità toracica.Suturare le costole insieme a un chirurgo e un nodo quadrato usando forcep smussate per sollevare il set superiore di costole mentre si passa una sutura 6-0 attraverso il set superiore e inferiore di costole. Applicare un piccolo volume di colla cutanea sull'addome superiore e utilizzare forcep fini per posizionare la pelle dell'addome inferiore sulla regione toracica esposta. Quindi posizionare il cucciolo su una pastiglia riscaldante ed eseguire la legatura sull'animale successivo.Una volta eseguiti tutti gli interventi chirurgici, riportare i cuccioli caldi e mobili nella gabbia di casa della madre. Per la chiarezza passiva del tessuto cardiaco raccolto, 21 giorni di postchirurgia dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, posizionare il mouse su un'area chirurgica pulita in posizione supina e fissare gli arti con nastro adesivo. Usando le forcelle tissutali, afferrare la pelliccia appena sotto il processo xifoide e fare un'incisione che copre la larghezza della gabbia toracica.Tagliare insieme alle porzioni distali della gabbia toracica e utilizzare le forcep per sollevare il processo xifoide per esporre il diaframma. Staccare il diaframma con forcelle curve e tirare il tessuto cranicamente fino a quando il cuore pulsante non è accessibile. Usa le forcep curve per afferrare il cuore alla base e usa le forbici iridectomia per tagliare l'aorta e la vena cava superiore.Posizionare il cuore pulsante in una piastra di Petri di PBS in modo che il cuore pompa il sangue trattenuto. L'infarto miocardico può essere confermato da un corretto posizionamento anatomico della legazione LAD. Quando il cuore smette di battere, spremere delicatamente l'organo con le forcep per espellere il sangue residuo e trasferire il campione in una fiala monouso in vetro da 2,5 millilitri contenente due millilitri di PBS.Posizionare il flaconcino su uno shaker per almeno 30 minuti a temperatura ambiente cambiando la soluzione PBS ogni 10 minuti fino a quando la soluzione rimane libera dal sangue. Quando il PBS è chiaro, sostituire il PBS con due millilitri di paraformaldeide fredda al 4% per un'incubazione di quattro ore a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi di 10 minuti sullo shaker con due millilitri di PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, riempire il flaconcino con due millilitri di acrilammide al 4% integrati con soluzione 0,5%VA-044 per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.Il giorno dopo, posizionare la fiala in un blocco di calore di 37 gradi Celsius per tre ore. Al termine della polimerizzazione, trasferire il cuore in una nuova fiala di vetro e lavare il tessuto cardiaco in due millilitri di PBS fresco 10 minuti alla volta rinfrescando il PBS alla fine di ogni incubazione. Quando il PBS è chiaro, sostituire il tampone di lavaggio con due millilitri di soluzione di compensazione.Incubare il campione a 37 gradi Celsius per diverse settimane fino a quando il cuore non è limpido, rinfrescando la soluzione di compensazione ogni due o tre giorni. Quando l'organo è chiaro, lavare il campione con PBS sullo shaker come dimostrato prima di riempire il flaconcino con PBS fresco per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il PBS con RIMS per un'incubazione 24 ore su 24 a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, il tessuto è completamente eliminato. Il tessuto dovrebbe diventare trasparente dopo diverse settimane. Per l'imaging del cuore del topo postnatale cancellato dopo l'induzione dell'infarto del miocardio, riempire metà di una camera di uno scivolo depressionario su misura con PBS e utilizzare forcep curve per trasferire con cura il cuore ripulito nella camera.Riempire il volume rimanente della camera con PBS. Quindi riempire la camera con PBS fino a quando la superficie del liquido forma una cupola sopra la parte superiore della camera e montare lo scivolo di copertura prima di immaginare il tessuto mediante microscopia confocale secondo protocolli di imaging standard. Se la puntura e la dissezione smussata sono troppo vicine in prossimità dello sterno, il cuore potrebbe non essere in grado di uscire dalla cavità toracica.Se il cuore non esce facilmente dalla cavità, applicare pressione sull'addome sinistro per facilitare il processo. Possono verificarsi complicazioni dal riposo del cuore sui muscoli intercostali. Pertanto, è importante mantenere la dissezione smussata a una dimensione minima in un orientamento orizzontale per consentire una visualizzazione chiara e l'accessibilità del LAD.Si noti che una legatura superficiale avrà meno spazio per la regolazione nel posizionamento finale della sutura e che la sutura che lega intorno al LAD deve essere eseguita con movimenti costanti controllati. Entro la fine del passaggio di compensazione, l'intero cuore dovrebbe essere costantemente opaco senza scolorimento al centro. Dopo alcuni giorni in soluzione RIMS a temperatura ambiente, il cuore deve essere completamente eliminato e può essere osservata una certa espansione dei tessuti.Come osservato dall'espressione proteica tdTomato reporter, i nervi cardiaci sono principalmente superficiali con alcune popolazioni residenti nello strato epicardiale. È importante sottolineare che la conferma dell'espressione proteica del reporter viene preservata dopo aver subito il protocollo di chiarezza come dimostrato. La pulizia e l'imaging del cuore 3D fornisce una prospettiva nella posizione e nella morfologia delle popolazioni di cellule cardiache.Questo ci permette di identificare nuovi aspetti nella creazione di modelli cellulari e nelle interazioni cellula-cellula.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per il confronto 3D del tessuto miocardico con tutto il cuore con la risonanza magnetica. Questo è progettato per la valutazione accurata di iniezioni intramiocardici nella zona infartuata confine di un modello suino cronica di infarto miocardico.

3D Whole-cuore Analisi tessuto miocardico

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Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Un metodo raffinato di compensazione dei tessuti è stato sviluppato e applicato al cuore adulto del topo. Questo metodo è stato progettato per cancellare il tessuto cardiaco denso e autofluorescente, pur mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettata attribuita a una strategia genetica reporter.

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.

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Analisi 3D simultanea del danno cardiaco e della risposta immunitaria nell'infarto miocardico acuto riperfuso mediante microscopia a fluorescenza a foglio di luce

L'attuale saggio 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) introduce un protocollo di colorazione TTC affinato che consente l'analisi della lesione miocardica a risoluzione microscopica, producendo immagini di alta qualità che consentono una valutazione accurata e affidabile della dimensione dell'infarto e della vitalità dei cardiomiociti a livello cellulare.

Un saggio microscopico sul cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio per un'analisi accurata e affidabile della lesione miocardica

Scopri la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato. Questo metodo consente di tracciare le cellule durante lo sviluppo e la rigenerazione cardiaca.

Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite limaging tridimensionale del cuore autorizzato (Video) | JoVE Journal

Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

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