Name: Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri un modello 3D di coltura ECM-adipocita umano per studiare il metabolismo del tessuto adiposo. Questo metodo consente di esaminare l'interazione tra matrice extracellulare e adipociti nel contesto del diabete di tipo 2.

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Ringraziamo Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss per l'assistenza con il coordinamento dello studio. SEM è stata eseguita dalla University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot e Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Amministrazione veterani VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia elettronica a scansione eseguita dall'Università del Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figura 4 di questo manoscritto è stata originariamente pubblicata in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, ed è stato riprodotto su autorizzazione della Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Per il permesso di riutilizzare questo materiale, si prega di visitare http://global.oup.com/academic/rights.

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Gli autori non dichiarano interessi contrastanti.

Il modello di coltura ECM-adipocyte fornisce uno strumento prezioso per sezionare i singoli ruoli dell'ECM e delle cellule nella dettatura del fenotipo tissutale finale. Il protocollo di isolamento ECM è abbastanza riproducibile, ma si può osservare la variabilità nel processo di decellularizzazione. La fase di delipidazione del Giorno 3 è un punto critico del protocollo. Al termine dell'estrazione notturna, la deilpidazione della matrice dovrebbe essere evidenziata dalla Polar Solvent Solution che diventa gialla, mentre...

La matrice extracellulare (ECM) non solo fornisce uno scaffold meccanico per i tessuti, ma si impegna anche in complesse interazioni incrociate con cellule che risiedono al suo interno, regolando i diversi processi necessari per l'omeostasi dei tessuti, compresa la proliferazione cellulare, differenziazione, segnalazione e metabolismo1. Mentre l'ECM sano svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della normale funzione tissutale, l'ECM disfunzionale è stato implicato in più malattie2.
Il tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella patogenesi della malattia metabolica. L'obesità è associata a ipertrofia eccessiva adipocite e ipossidi cellulare, difetti nel metabolismo cellulare adipocitico, e reticolato endoplasmico del tessuto adiposo e stress ossidativo e infiammazione. Anche se poco compresi, questi processi complessi cospirano per compromettere la capacità di tamponamento dei nutrienti del tessuto adiposo, portando a overflow dei nutrienti dal tessuto adiposo, tossicità nei tessuti multipli e malattia metabolica sistemica3,4 ,5. La sequenza di eventi e meccanismi specifici che sono alla base dell'insufficienza del tessuto adiposo sono poco conosciuti, ma sono state implicate alterazioni nel tessuto adiposo ECM. La composizione ECM è alterata all'interno del tessuto adiposo nell'obesità umana e murina, con una maggiore deposizione di proteine ECM insieme a differenze biochimiche e strutturali qualitative nel tessuto adiposo associato alla malattia metabolica umana, tra cui diabete di tipo 2 e iperlipidemia6,7,8,9,10,11.
Nonostante queste osservazioni, il ruolo del tessuto adiposo ECM nella mediazione della disfunzione del tessuto adiposo non è ben definito. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di modelli sperimentali trattabili che consentono la dissezione dei ruoli specifici dell'ECM e degli adipociti nella regolazione della funzione adiposa finale dei tessuti. La coltura ECM-adipocite simula meglio l'ambiente in vivo del tessuto nativo adiposo in almeno due aspetti. In primo luogo, la coltura ECM fornisce un ambiente molecolare simile al tessuto adiposo nativo, tra cui collageni nativi, elastine e altre proteine matriciali assenti nella coltura 2D standard. In secondo luogo, la coltura sulla plastica 2D ha dimostrato di alterare il metabolismo degli adipociti attraverso effetti meccanici a causa della diminuzione dell'elasticità del substratoplastico 12, che ECM-cultura elimina.
I metodi per progettare scaffold biologici isolando l'ECM dall'adiposi decellularizzato e da altri tessuti sono stati studiati nel contesto della medicina rigenerativa e ricostruttiva e dell'ingegneria tissutale13,14, 15,16,17,18. Abbiamo precedentemente pubblicato una metodologia in cui abbiamo adattato questi metodi per sviluppare un modello in vitro 3D di coltura umana ECM-adipocyte, utilizzando ECM e cellule staminali adipocite (preadipociti) derivate da tessuti adipose viscerali umani11. Nel presente articolo vengono descritti questi metodi in dettaglio. La procedura di decellularizzazione per il tessuto adiposo umano è un processo di quattro giorni che prevede trattamenti meccanici ed enzimatici per rimuovere cellule e lipidi, lasciando uno scaffold biologico che mantiene le caratteristiche del tessuto da cui è derivato. L'ECM decellularizzato supporta la differenziazione adipogenica dei preadipociti umani e, se ricostituita con adipociti, mantiene la microarchitettura e le caratteristiche biochimiche e specifiche della malattia del tessuto adiposo intatto e si impegna in funzioni caratteristiche del tessuto adiposo nativo. Questa matrice può essere studiata da sola o reseeded con le cellule, permettendo lo studio delle interazioni e crosstalk tra i componenti cellulari ed extracellulari del tessuto adiposo.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL provetta crioviale</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponata neutra</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m filtro a rete in nylon</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deossi-D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#B4639</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deossi-D-glucosio, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I da pancreas bovino, tipo II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D4513</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP231</td><td>Infiammabile, caustico</td></tr><tr><td>Disodio EDTA</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>Acido D-pantotenico sale emicalcico</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modificato: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td><td>Vetrini per</td></tr><tr><td>il conteggio delle cellule EVE infiammabili, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#G5882</td><td></td></tr><tr><td>Esametildisalizane</td> caustico <td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#440191</td> Soluzione di insulina umana <td>infiammabile e caustica</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A415</td><td>Isoproterenolo infiammabile</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#I5627</td><td>Infiammabile</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lipasi da pancreas suino, tipo VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>Taglio ottimale composto di temperatura (OCT)</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Regno Unito</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#201030</td><td>Caustico</td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#93482</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato caustico (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi A dal pancreas bovino, tipo III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEsito tessuto fibroso MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Germania</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>Fluido a scintillazione</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>Forbici contatore</td><td></td><td></td><td></td>a scintillazione</tr><tr><td>, pinze,</td> tampone fosfato sterile <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di Sorensen</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di coltura T-150</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale a temperatura controllata Omogeneizzatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissutale, Omogeneizzatore per microprovette</td><td>BeadBug Benchmark Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td> Kit per la determinazione dei trigliceridi <td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione blu di tripano, 0,4%</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman Reeve Angel, grado 201, 150 mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Gatto # WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti, impegnandosi in crosstalk con le cellule e regolando molteplici aspetti della funzione cellulare. L'ECM svolge un ruolo particolarmente importante nella funzione adiposa del tessuto nell'obesità e le alterazioni nella deposizione e nella composizione eM del tessuto adiposo sono associate alla malattia metabolica nei topi e negli esseri umani. I modelli in vitro trattabili che consentono la dissezione dei ruoli dell'ECM e delle cellule nel contribuire al fenotipo dei tessuti globali sono scarsi. Descriviamo un nuovo modello 3D in vitro della coltura umana ECM-adipocite che permette di studiare i ruoli specifici dell'ECM e gli adipociti nella regolazione del fenotipo metabolico del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo umano viene decellularizzato per isolare l'ECM, che viene successivamente ripopolato con precari che vengono poi differenziati all'interno dell'ECM in adipociti maturi. Questo metodo crea costrutti ECM-adipocite che sono metabolicamente attivi e mantengono le caratteristiche dei tessuti e dei pazienti da cui derivano. Abbiamo usato questo sistema per dimostrare il crosstalk ECM-adipocite specifico della malattia nel tessuto adiposo umano. Questo modello di coltura fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo globale e permette di studiare il ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti adisposti.

Preparazione del tessuto adiposo, semina con preadipociti e differenziazione in vitro in adipociti maturi provocano chiari cambiamenti morfologici sequenziali nel tessuto che consente la valutazione visiva del progresso in tutto il protocollo (Figura 1) . I preadipociti utilizzati per il seeding dell'ECM sono isolati utilizzando la digestione del collagene e da campioni separati di IVA (Figura 2). La microscopia elettronica a sca...

Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Il nostro protocollo dimostra che l'ECM può promuovere la differenziazione adipogenica in assenza di classici mediatori adipogenici ed è il primo a dimostrare una regolazione specifica della malattia del metabolismo cellulare da parte dell'ECM. La nostra tecnica fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel metabolismo dei tessuti adiposi e consente lo studio del ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi del tessuto adiposo. Rispetto alla coltura cellulare 2D standard, il nostro modello 3D consente un esame e una dissezione più robusti del cross-talk tra adipociti e ECM del tessuto adiposo nel contesto del diabete di tipo 2.Si consiglia di iniziare con campioni più piccoli per valutare quanto bene è cellularizzato. Tieni presente che c'è variabilità interpaziale nel modo in cui le cellule crescono e in che bene il tessuto decellularizza. È importante osservare il tessuto prima e dopo ogni passaggio per garantire che il tessuto stia diventando decellularizzato e per comprendere le potenziali differenze tra i campioni.Dopo aver ottenuto il tessuto adiposo viscerale o l'IVA dall'intervento chirurgico, prepararlo per la conservazione aggiungendo 5-10

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Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Gli adipociti maturi possono rappresentare un'abbondante fonte di cellule staminali attraverso la dedifferenziazione, che porta a una popolazione omogenea di cellule simili a fibroblasti. La digestione della collagenasi viene utilizzata per isolare gli adipociti maturi dal grasso umano. L'obiettivo del nostro protocollo è quello di ottenere cellule adipose multipotenti e dedifferenziate da adipociti maturi umani.

Generazione di cellule staminali adiposo umano attraverso dedifferenziazione di adipociti maturi in Culture soffitto

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).

Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali

La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per coltivare adipociti umani maturi. Qui dettagliamo come isolare gli adipociti dall'adiposo umano e come impostare il MAAC.

Isolamento e cultura degli adipociti maturi umani utilizzando le colture aggregate adipocite mature membrana (MAAC)

Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Qui, descriviamo un protocollo per isolare, coltivare e fenotipizzare le cellule endoteliali microvascolari dal tessuto adiposo sottocutaneo umano (hSATMVECs). Inoltre, descriviamo un modello sperimentale di cross-talk hSATMVEC-adipociti.

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Questo protocollo descrive la fabbricazione di costrutti ossei 3D utilizzando osteociti umani incorporati in idrogel di gelatina metacrilata (GelMA) integrati con matrice extracellulare decellularizzata. Il metodo è a basso costo, scalabile e compatibile con le apparecchiature di laboratorio di base, offrendo una piattaforma traslazionale per lo studio dei processi delle malattie muscoloscheletriche.

Una piattaforma di coltura ossea 3D che utilizza osteociti umani e matrice extracellulare decellularizzata per la modellazione delle malattie muscoloscheletriche

Utilizzando un modello ex vivo di espianti, piccoli pezzi della porzione rostrale del tessuto adiposo bianco viscerale di topi magri vengono coltivati per 7–10 giorni, permettendo l'induzione e lo studio dell'infiammazione del tessuto adiposo durante l'alimentazione ricca di grassi.

Un modello topino ex vivo per l'infiammazione del tessuto adiposo ad alto contenuto di grassi

Descriviamo un metodo semplice, rapido di generare 3D tessuti come sferoidi e la loro potenziale applicazione di quantificare le differenze nelle interazioni cellula-cellula.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Scopri un modello 3D di coltura ECM-adipocita umano per studiare il metabolismo del tessuto adiposo. Questo metodo consente di esaminare l'interazione tra matrice extracellulare e adipociti nel contesto del diabete di tipo 2.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

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