Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice
7 novembre 2019
Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.
Il nostro protocollo dimostra che l'ECM può promuovere la differenziazione adipogenica in assenza di classici mediatori adipogenici ed è il primo a dimostrare una regolazione specifica della malattia del metabolismo cellulare da parte dell'ECM. La nostra tecnica fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel metabolismo dei tessuti adiposi e consente lo studio del ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi del tessuto adiposo. Rispetto alla coltura cellulare 2D standard, il nostro modello 3D consente un esame e una dissezione più robusti del cross-talk tra adipociti e ECM del tessuto adiposo nel contesto del diabete di tipo 2.
Si consiglia di iniziare con campioni più piccoli per valutare quanto bene è cellularizzato. Tieni presente che c'è variabilità interpaziale nel modo in cui le cellule crescono e in che bene il tessuto decellularizza. È importante osservare il tessuto prima e dopo ogni passaggio per garantire che il tessuto stia diventando decellularizzato e per comprendere le potenziali differenze tra i campioni.
Dopo aver ottenuto il tessuto adiposo viscerale o l'IVA dall'intervento chirurgico, prepararlo per la conservazione aggiungendo 5-10 grammi del tessuto a 15-25 millilitri di soluzione tampone di congelamento in un tubo conico da 50 millilitri. Immergere completamente il campione e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino alla decellularizzazione. Per l'isolamento dei preadipocite, posizionare due grammi di un campione fresco di IVA intatta in 20 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo II, quindi inserire forbici sterili nel tubo e tritare accuratamente il tessuto.
Una volta tritato in un liquame fine, incubarlo nella soluzione di collagenasi a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale per 60 minuti. Dopo l'incubazione, filtrare il risultante digerito attraverso una rete di nylon da 100 micrometri in un tubo conico fresco da 50 millilitri. Il digerito dovrebbe essere un liquido giallo-arancio con viscosità moderata e una piccola quantità di fili residui di tessuto non digerito.
Centrifugare il campione a 270 volte g per 10 minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in due millilitri di soluzione di lysing 1X RBC con una pipetta. Incubare la soluzione per un minuto a 25 gradi Celsius, quindi aggiungere 10 millilitri di 15%FBS DMEM F12 e centrifugarla a 270 volte g per 10 minuti. Per preparare l'ECM, congelare/scongelare il campione di IVA precedentemente congelato a 37 gradi Celsius incubandolo in un bagno d'acqua preriscaldato per 20 minuti con agitazione manuale delicata periodica.
Una volta scongelato, trasferire il tessuto a meno 80 gradi Celsius per 20 minuti e ripetere il processo di congelamento / scongelamento tre volte terminando con lo scongelamento. Utilizzare forcep sterili per trasferire il campione di IVA in un tubo conico fresco da 50 millilitri contenente 15-25 millilitri di soluzione enzimatica 1 assicurandosi che il campione sia completamente immerso. Quindi incubarlo durante la notte a 37 gradi Celsius mentre trema a 130 giri/min.
Il giorno successivo, lavare il campione tre volte con 15-25 millilitri di soluzione tampone di risciacquo, versando la soluzione dopo ogni lavaggio. Trasferire il campione in un tubo fresco da 50 millilitri con 15-25 millilitri di soluzione enzimatica 2 e incubarlo durante la notte. Ripetere i lavaggi con la soluzione tampone di risciacquo e trasferire il campione in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione di estrazione del solvente polare.
Incubare il campione durante la notte mentre si trema. Dopo l'incubazione con la soluzione di solvente polare, è importante esaminare il campione per la rimozione lipidica. Se la maggior parte dei lipidi non viene rimossa, potrebbe essere necessario ripetere questo passaggio.
Può essere utilizzato un tempo di incubazione più breve. Dopo l'incubazione, trasferire il campione in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione tampone di risciacquo e lavare il campione tre volte sullo shaker. Quindi lavare il campione tre volte con una soluzione di etanolo al 70%, versando l'etanolo dopo ogni lavaggio.
Lavare il campione una volta con soluzione di stoccaggio, quindi utilizzare forcep sterili per trasferirlo in un tubo fresco contenente 15-25 millilitri di soluzione di stoccaggio assicurandosi di immergerlo completamente. Il campione può quindi essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. L'isopropanolo e l'etanolo sono infiammabili e devono essere a temperatura ambiente e smaltiti in rifiuti infiammabili.
Tutti i rifiuti umani devono essere smaltiti separatamente dai normali rifiuti a rischio biologico. Trasferire i frammenti di ECM immagazzinati su singoli pozzi di una piastra a 24 pomp po' con forcep sterili aggiungendo tutti i frammenti necessari per i test a valle pianificati. Lavarli tre volte con 500 microlitri di 70%etanolo su uno shaker orbitale, quindi reidratarli lavandoli tre volte con PBS.
Utilizzare forbici sterili per tagliare l'ECM in frammenti da 100 milligrammi. Posizionare ogni frammento in un pozzo di una piastra di 24 po 'e incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 15 minuti per consentire al PBS in eccesso di estrudere dai frammenti. Quindi rimuovere con cura qualsiasi PBS rimasto dai pozzali con una pipetta.
Seme ogni frammento con 20 microlitri di sospensione cellulare preadipocite tubazionando le cellule direttamente nell'ECM. Posizionare la punta della pipetta nell'ECM ed espellerla delicatamente al centro della matrice assicurandosi che la sospensione cellulare non trabocca e finisca nella parte inferiore del pozzo. Se la sospensione della cella trabocca dall'ECM, rimuovere la punta della pipetta da tale posizione e inserirla altrove nell'ECM.
Dopo la semina cellulare, incubare l'ECM per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Riempire ogni bene con 500 microlitri di mezzi di crescita per coprire i frammenti di ECM seminati. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore.
Dopo 72 ore, aspirare attentamente il mezzo di crescita senza disturbare il frammento ECM. Aggiungere 500 microlitri di mezzi di differenziazione e coltura le cellule per 14 giorni cambiando il supporto ogni due o tre giorni. Verificare la differenziazione utilizzando la microscopia ottica.
Le cellule accumuleranno lipidi, diventeranno di colore marrone-giallo e diventeranno più sferiche man mano che si differenziano. La preparazione dell'ECM del tessuto adiposo, la semina con preadipociti e la differenziazione in vitro in adipociti maturi sono state monitorate con microscopia elettronica a scansione che ha rivelato la decellularizzazione dell'ECM e la successiva ricapitolazione dei lipidi contenenti adipociti al momento del reseeding e della differenziazione. L'immunoistochimica specifica collagene 1 dell'ECM decellularizzato ha mostrato il mantenimento della micro architettura del collagene mentre la colorazione Oil Red-O di costrutti 3D ECM-adipociti vivi e fissi ha mostrato lipidi contenenti adipociti.
Gli adipociti differenziati in ECM sono stati vengono Viene mostrata la differenza completa nei livelli di trascrizione. Quattro combinazioni di ECM e adipociti di soggetti diabetici e non diabetici sono state sottoposte a fenotipizzazione metabolica.
L'assorbimento alterato del glucosio nella funzione litivitica è stato scoperto nei costrutti dei tessuti diabetici. È importante sottolineare che l'ECM nondiabetica salva l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina e la capacità limolitica negli adipociti diabetici. La contaminazione dei preadipociti isolati, del tessuto decellularizzato e dell'ECM risigillato non è rara.
La sterilità deve essere diligentemente mantenuta in tutto il protocollo.
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Panoramica
Questo studio presenta un sistema di coltura tridimensionale di adipociti in matrice extracellulare umana che consente l'esplorazione delle interazioni tra la matrice e gli adipociti nel metabolismo del tessuto adiposo. Il sistema è progettato per migliorare la comprensione della differenziazione adipogenica e della regolazione del metabolismo cellulare da parte della matrice extracellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare
- Metabolismo
- Ricerca sui Tessuti Adiposi
Sfondo
- La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo cruciale nell'omeostasi dei tessuti.
- Gli adipociti sono regolatori chiave dei processi metabolici nel tessuto adiposo.
- Le colture tradizionali in 2D non riproducono in modo adeguato l'ambiente in vivo.
- Il diabete di tipo 2 è associato a un metabolismo alterato del tessuto adiposo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema di coltura 3D per lo studio delle interazioni adipocita-ECM.
- Indagare il ruolo dell'ECM nella differenziazione adipogenica.
- Esplorare la regolazione specifica per malattia del metabolismo da parte dell'ECM.
Metodi Utilizzati
- Creazione di un modello di coltura 3D di adipociti umani in matrice extracellulare (ECM).
- Valutazione della differenziazione adipogenica in assenza di mediatori classici.
- Valutazione della regolazione del metabolismo cellulare da parte della matrice extracellulare (ECM).
- Confronto dei risultati ottenuti con la coltura 3D rispetto alle colture cellulari standard in 2D.
Risultati principali
- La MEC promuove la differenziazione adipogenica in modo indipendente dai mediatori tradizionali.
- È stata osservata una notevole variabilità inter-paziente nella crescita cellulare e nella descellularizzazione del tessuto.
- Il modello 3D consente un'analisi robusta delle interazioni tra adipociti e MEC.
- Sono state ottenute informazioni sul ruolo della MEC nell'omeostasi del tessuto adiposo.
Conclusioni
- Il sistema di coltura 3D sviluppato rappresenta uno strumento prezioso per lo studio del metabolismo del tessuto adiposo.
- Comprendere l'influenza della matrice extracellulare sugli adipociti può fornire indicazioni utili per la ricerca sul diabete.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni della variabilità tra pazienti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello di coltura 3D di adipociti umani in matrice extracellulare affronta una lacuna critica nella ricerca sul tessuto adiposo, permettendo l'analisi meccanicistica della comunicazione metabolica tra matrice e cellule in un sistema umano rilevante per le malattie. Offre un valore predittivo per la validazione di bersagli nelle malattie metaboliche, dimostrando come la composizione della matrice extracellulare influenzi direttamente la funzione degli adipociti e la risposta all'insulina. La piattaforma consente una riduzione del rischio preclinico, permettendo il confronto diretto tra gli effetti della matrice extracellulare diabetica e non diabetica sul metabolismo cellulare, fornendo indicazioni decisive per lo sviluppo di terapie contro l'obesità e il diabete di tipo 2.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi della regolazione mediata dalla MEC sulla differenziazione adipogenica indipendentemente dai mediatori classici dell'adipogenesi.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale di bersagli dimostrando un dialogo reciproco specifico della malattia tra MEC e adipociti nel tessuto adiposo umano.
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico isolando le variabili della MEC per valutarne l'impatto diretto sul metabolismo cellulare e sull'accumulo lipidico.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera costrutti tridimensionali metabolicamente attivi, adatti alla valutazione quantitativa dell'assorbimento del glucosio e della funzione lipolitica.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per confrontare fonti di matrice extracellulare in diversi fenotipi di pazienti.
- Valore operativo: Permette una preparazione scalabile dei saggi mediante frammenti di matrice extracellulare descelularizzata, seminati con preadipociti in formati multi-well.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene le caratteristiche della matrice extracellulare (ECM) e degli adipociti derivati dal paziente, potenziando la rilevanza traslazionale per approcci di medicina personalizzata.
- Valore scientifico: Consente lo studio del ruolo della matrice extracellulare nel regolare l'omeostasi del tessuto adiposo, collegando alterazioni della matrice a fenotipi metabolici.
- Valore operativo: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, identificando componenti della matrice extracellulare capaci di ripristinare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina negli adipociti diabetici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla valutazione preclinica, in particolare per i programmi su malattie metaboliche in cui la disfunzione del tessuto adiposo rappresenta un fattore patofisiologico chiave.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul ruolo della matrice extracellulare (ECM) nella differenziazione degli adipociti e nella funzione metabolica mediante analisi dell'espressione genica e valutazioni fenotipiche.
- Screening: Fornisce output quantitativi come l'accumulo lipidico (Oil Red-O), l'espressione genica (qPCR) e la funzione metabolica (assimilazione del glucosio, lipolisi) per il confronto tra composti o condizioni.
- Analisi: Permette il confronto diretto di quattro combinazioni ECM-adipociti (ECM diabetica/nondiabetica con adipociti diabetici/nondiabetici) per ridurre i rischi associati alle ipotesi meccanicistiche.
- Ricerca traslazionale: Utilizza tessuto adiposo viscerale umano per mantenere un contesto biologico rilevante per la malattia, dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo studio delle interazioni ECM-cellula in diversi distretti adiposi e in varie condizioni metaboliche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo rivelando la regolazione metabolica mediata dalla matrice extracellulare non rilevata nelle colture in 2D.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di decellularizzazione, riseminazione e differenziazione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'identificazione precoce di terapie modulatrici della matrice extracellulare con attività specifica per malattia.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorizzazione dei target aggiustata per il rischio, in base alla capacità della matrice extracellulare di ripristinare la disfunzione degli adipociti diabetici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nella digestione enzimatica e nelle tecniche di coltura cellulare sterili.
- È subordinato all'accesso al tessuto adiposo viscerale umano e alle relative infrastrutture per la lavorazione (congelamento, centrifugazione, agitazione).
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per gestire la variabilità inter-paziente nella decellularizzazione della matrice extracellulare e nella crescita cellulare.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il modello a diversi depositi adiposi o a tipi cellulari diversi dagli adipociti.
- È limitato dalla necessità di mantenere una sterilità meticolosa e di monitorare attentamente la rimozione dei lipidi durante la preparazione della matrice extracellulare.
