Analisi delle molecole complesse e delle loro reazioni sulle superfici mediante mezzi di desorpazione/spettrometria di massa indotta da cluster
1 marzo 2020
Gli ammassi neutri di SO2 di bassa energia cinetica (< 0,8 eV/costituente) vengono utilizzati per desorbiare molecole di superficie complesse come peptidi o lipidi per un'ulteriore analisi mediante spettrometria di massa utilizzando uno spettrometro di massa della trappola iografica. Non è necessaria alcuna preparazione speciale del campione e l'osservazione in tempo reale delle reazioni è possibile.
La ionizzazione di desorbimento indotta da cluster SO2 neutri che chiamiamo in breve DINeC, è un metodo di ionizzazione del desorbimento morbido ed efficiente. Lo usiamo tra gli altri per la spettrometria di massa delle biomolecole, come peptidi e proteine. Come DINeC, molecole di desorbimento intatte dalle superfici del campione, sottili cambiamenti chimici in queste molecole sono facilmente rilevabili negli spettri di massa.
Il processo è illustrato nella seguente simulazione. I cluster in ingresso si frantumano a attraverso l'impatto della superficie del cluster. Il dipeptide isotopico superficiale viene sciolto in uno dei frammenti dell'ammasso e desorbito da questo processo.
Nell'esperimento, il fascio di ammassi di SO2 viene prodotto attraverso l'espansione supersonica da un ugello pulsato. Le molecole che vengono sciolte e ionizzate durante l'impatto superficiale dell'ammasso vengono trasferite nella trappola ionica per la spettrometria di massa. Gli spettri di massa tipici mostrano solo picchi ai valori impostati MO della molecola intatta.
A dimostrare la procedura saranno Karolin Bomhardt e Pascal Schneider, due dottorandi nel mio laboratorio. Per i campioni standard, tagliare i substrati dai wafer di silicio con uno spessore di circa 0,5-un millimetro in pezzi di uno per un centimetro quadrato. Pulire i substrati di silicio in un bagno ad ultrasuoni di etanolo e acetone per 15 minuti ciascuno.
Asciugare i substrati in un flusso di gas azoto secco. Quindi, cadere gettato da cinque a 30 microlitri della soluzione del campione sul substrato. A seconda della pressione di vapore del solvente, lasciare asciugare il campione in condizioni ambientali o in un essiccatore fino a quando tutto il solvente non è stato evaporato e si è formato un film secco.
Considera lo schema di preparazione più semplice. Ad esempio, per l'indagine dell'inchiostro dell'evidenziatore, basta disegnare un punto sulla superficie del substrato. Montare i campioni sul supporto del campione con nastro adesivo o morsetti serrati da viti.
Montare inoltre un campione di riferimento come una pellicola spessa un micrometro di Angiotensina II sul supporto del campione. Quindi, premere Il blocco di carico di sfiato per sfiatare il sistema di blocco del carico. Attendere cinque minuti o fino a raggiungere la pressione atmosferica.
Aprire il blocco di carico e montare il portacampioni. Chiudere il blocco di carico e pompare la camera di blocco del carico a una pressione inferiore a due volte 10 al -5 millibar. Aprire la valvola alla camera DINeC e trasferire il portacampioni con l'asta di trasferimento al manipolatore principale.
Attaccare il portacampioni al manipolatore. Ritrarre l'asta di trasferimento e chiudere la valvola tra il blocco di carico e la camera DINeC. Aprire la valvola tra la bombola del gas e l'ugello.
Regolare la pressione della miscela di anidride solforosa e gas elio sul contorno del sistema di miscelazione del gas a 15 bar. Impostate la posizione del manipolatore sulla posizione del campione di riferimento. Per misurare gli spettri di massa cationica, impostare la distorsione del campione e della griglia su più 40 volt e più sette volt rispettivamente.
Per guidare l'ugello pulsato e lo spettrometro di massa della trappola ionica, impostare il generatore di funzioni esterne su due Hertz. Con il generatore di ritardo, impostare il ritardo tra il segnale di trappola chiara dalla trappola ionica e il segnale di innesco per l'ugello pulsato su cinque millisecondi. Nel software di controllo Bruker, nella pagina Modalità della finestra di dialogo principale, selezionare Risoluzione avanzata per la modalità di scansione.
Digitare M su Z 50-3000 per intervallo, digitare 0,1 millisecondi per il tempo di accumulo, digitare in 10 cicli per la media e, per la polarità, selezionare positivo per la misurazione degli spettri di massa cationica e negativo per la misurazione degli spettri anionici. Una volta raggiunta una pressione inferiore a tre volte 10 a quello negativo di sei millibar nella camera DINeC, avviare la misurazione. Impostare il valore M su Z sulla rispettiva massa per seguire il segnale del cromatogramma dipendente dal tempo.
Premere Operate nel software di controllo. Iniziare a registrare le misurazioni premendo il pulsante Registra. Misurare lo spettro di prova da un campione di riferimento, ad esempio Angiotensina II per circa 300 secondi.
Ottimizzare l'intensità del segnale regolando il ritardo di tempo tra il segnale di trappola chiara e il segnale che attiva l'ugello pulsato. Con il ritardo ottimizzato, spostare il manipolatore nella posizione del campione da misurare. Fare clic sul pulsante Registra per acquisire spettri di massa nell'intervallo di tempo di interesse.
Al termine della misurazione, caricare il rispettivo set di dati nel programma analisi dati, come illustrato di seguito per la misurazione di riferimento. Selezionare l'intervallo di tempo di interesse nel cromatogramma con il pulsante destro del mouse. Lo spettro medio viene visualizzato in una finestra separata.
Fare clic su Esporta come file ASCII per esportare lo spettro come file di dati per ulteriori elaborazioni in un programma di scelta. Lo spettro di massa DINeC da un campione di Angiotensina II è cambiato con il tempo quando il campione è stato riscaldato a circa 140 gradi Celsius. Una volta che la temperatura ha raggiunto il valore finale, il picco della molecola protinata attaccata a M su Z pari a 1047 è sceso e sono stati osservati nuovi picchi.
Il processo è riassunto in questi tre grafici. I picchi aggiuntivi a M su Z pari a 932, 1012 e 1029 sono stati ben osservati. L'analisi della cinetica di reazione dimostra che l'entità con M su Z uguale a 1029 è un intermedio che è stato ulteriormente scomposto in frammenti più piccoli man mano che l'intensità aumentava e poi diminuiva.
Le caratteristiche più importanti di DINeC sono la natura morbida del processo di desorbimento, l'efficienza e l'elevata sensibilità superficiale. Tutti si uniscono ai bassi requisiti per quanto riguarda la preparazione del campione. Il DINEC può quindi essere applicato a un'ampia varietà di campioni diversi che vanno dai materiali di corteccia organica agli adsorbati superficiali complessi nella regione del sub-monostrato.
In tutti i casi, è possibile ottenere informazioni chimiche complete in tempo reale.
Panoramica
Questo studio presenta un nuovo metodo di ionizzazione per desorbimento utilizzando cluster di SO2 neutri, denominato DINeC, per l'analisi spettrometrica di massa delle biomolecole. La tecnica permette l'osservazione in tempo reale dei cambiamenti chimici in peptidi e proteine senza un'estesa preparazione del campione.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Spettrometria di massa
- Analisi biomolecolare
- Chimica di superficie
Sfondo
- DINeC è un metodo di ionizzazione per desorbimento delicato.
- Consente l'analisi di molecole di superficie complesse.
- È possibile il monitoraggio in tempo reale delle reazioni.
- È richiesta una minima preparazione del campione.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare l'efficacia di DINeC per la spettrometria di massa.
- Analizzare sottili cambiamenti chimici nelle biomolecole.
- Fornire un protocollo dettagliato per la preparazione del campione e la misurazione.
Metodi utilizzati
- Produzione di cluster di SO2 mediante espansione supersonica.
- Desorbimento delle molecole attraverso l'impatto della superficie del cluster.
- Trasferimento di molecole ionizzate in uno spettrometro di massa a trappola ionica.
- Acquisizione e analisi in tempo reale dei dati e degli spettri di massa.
Principali risultati
- Gli spettri di massa mostrano picchi molecolari intatti.
- Nuovi picchi emergono all'aumentare della temperatura durante l'analisi.
- La cinetica della reazione rivela la formazione di specie intermedie.
- DINeC dimostra un'elevata sensibilità e efficienza di superficie.
Conclusioni
- DINeC è un metodo versatile applicabile a vari campioni.
- Fornisce informazioni chimiche complete in tempo reale.
- I bassi requisiti di preparazione del campione del metodo ne aumentano l'utilità.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
