Name: Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per la raccolta di liquido cerebrospinale e sangue nei topi, che permette di misurare quantitativamente le proteine sintetizzate intratecalmente. Questo metodo aiuta a distinguere tra alterazioni della barriera ematoencefalica e sintesi intratecale.

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Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Fondo di Ricerca Bornstein ha finanziato questa ricerca.

Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Geisel School of Medicine di Dartmouth.
1. Raccolta di fluidi
NOTA: sono necessari sia il siero che il CSF. Due protocolli per ogni raccolta di fluidi sono necessari per la sopravvivenza e necropsia.
<ol><li>Raccolta di siero e CSF con procedure di sopravvivenza NOTA: Per la raccolta dei fluidi di sopravvivenza, la raccolta del siero dovrebbe precedere la raccolta di CSF in quanto è una procedura meno invasiva. Il CSF deve essere ottenuto entro una settimana dall'estrazione del siero.<ol><li>Procedura di sanguinamento retroorbitale per la raccolta del siero. NOTA: Questa procedura è per la sopravvivenza del sanguinamento dei topi14. La procedura descritta si applica a qualsiasi età, sesso e sforzo di topi. Poiché le regole Di IACUC impongono che un volume di sangue massimo dell'1% del peso corporeo possa essere rimosso come un singolo prelievo di sangue, si raccomanda che la procedura venga eseguita solo su topi che pesano più di 15 g.<ol>
<li>Spostare le gabbie contenenti topi dal rack in un'area di lavoro appropriata. Preparare la macchina del gas per anestesia attivando il misuratore di flusso di ossigeno a 1 L/min.</li>
			<li>Posizionare l'animale nella camera di induzione e chiudere saldamente il coperchio. Accendere il vaporizzatore isoflurano al 3,5% e monitorare l'animale fino a reclinata.</li>
			<li>Togliere l'animale dalla camera e valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale, cioè un pizzico fermo del piede. Garantire un'adeguata profondità di anestesia prima di eseguire la procedura: la mancanza di risposta a un pizzico fermo indica un'anestesia adeguata.</li>
			<li>Restringere il topo anetizzato afferrando la pelle sciolta dietro le orecchie con il pollice e l'indice della mano non dominante. Fai scorrere gli occhi usando l'indice per ritrarre la pelle sopra l'occhio e il pollice per riportare la pelle sotto gli occhi.</li>
			<li>Posizionare la punta di una pipetta Pasteur nella presa oculare sotto il bulbo oculare (Figura 1, pannello sinistro), dirigendo la punta a circa 45 gradi verso il centro della presa oculare (Figura 1, pannello destro). Ruotare la pipetta tra le dita durante il passaggio in avanti. Applicare una leggera pressione e poi rilasciare fino a quando il sangue sta entrando nella pipetta. NOTA: La quantità massima di sangue che può essere prelevata in una sola volta da questa posizione è di circa l'1% del peso corporeo, ad esempio 0,2 mL da un mouse da 20 g.</li>
			<li>Rimuovere delicatamente il capillare per prevenire lesioni all'occhio e posizionare il sangue raccolto in un tubo di centrifuga di 1,5 ml. Chiudere la palpebra e applicare una leggera pressione con garza per evitare ulteriori sanguinamento. Una volta completamente vigile e mobile (di solito 3,5 min), riporta il mouse alla sua gabbia di detenzione.</li>
			<li>Lasciare che il sangue si coaguli per 30-60 min a temperatura ambiente (RT), quindi centrizzare il sangue per 10 min a 2.000 g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi. Utilizzando una tecnica di pipetta pulita, raccogliere il siero in una nuova fiala da 0,5 mL. Congelare immediatamente fiala di siero a -80 gradi centigradi.</li>
		</ol></li>
		<li>Raccolta CSF con procedura di sopravvivenza NOTA: Questa procedura è per la chirurgia di sopravvivenza, e si basa sul protocollo pubblicato da Liu e Duff nel 200815. I topi sono anestesizzati da un cocktail di Ketamina (20 mg/mL), xilazina (0,5 mg/mL) e acepromazina (0,5 mg/mL) somministrato per via peritonea.<ol><li>Spostare le gabbie contenenti topi dal rack ad un'area di lavoro interventistica designata. Preparare lo spazio chirurgico in un ambiente sterile. Assicurarsi che tutti gli strumenti e i materiali utilizzati siano sterilizzati prima dell'intervento chirurgico.</li>
			<li>Pesare il mouse e calcolare il volume di anestesia necessario (0,1 mL di cocktail di anestesia per un mouse da 20 g). Iniettare anestesia intraperitamente16. Dopo alcuni minuti, provare il mouse pizzicando il piede per garantire un'adeguata anestesia. Se è necessaria più anestetico, iniettare ulteriormente 0,01-0,03 mL del cocktail anestetico.</li>
			<li>Utilizzare forbici o un rasoio per radere una piccola area della testa, sull'estremità caudale, mediale sul cranio, per esporre un'area di lavoro abbastanza grande per la raccolta CSF. Posizionare il mouse nella posizione prona sullo strumento stereotaxic e stabilizzare la testa utilizzando le barre dell'orecchio (Figura 2A). NOTA: Il mouse è disposto in modo che la testa formi un angolo di quasi 135 gradi con il corpo (Figura 2A). Una volta che l'animale è posizionato, un drappo chirurgico viene utilizzato per mantenere un campo sterile presso il sito chirurgico. Per la raccolta di FILE CSF nei topi sono preferiti chiaramente le tende adesive, in quanto consentono una visualizzazione diretta e più mirata dell'animale.</li>
			<li>Swab il sito chirurgico con 30% clorhexidine diacetate. Utilizzando un bisturi sterile, fare un'incisione sagittale della pelle inferiore all'occipite per esporre i muscoli sovrastanti la magna della cisterna.</li>
			<li>Con la dissezione smussata con pinze, separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli per esporre la cisterna magna (Figura 2B). Utilizzare i microtrattini per tenere i muscoli separati (Figura 2B) ed esporre lo strato meningea dura mater sulla cisterna magna.</li>
			<li>Lavare delicatamente con la salina sterile con tamponamenti di fosfato (PBS) per rimuovere eventuali contaminazioni del sangue. Asciugare il dura mater con un tampone di cotone sterile e forare delicatamente la membrana che copre la cisterna magna con un ago da 30 G. Inserire rapidamente e delicatamente un piccolo tubo capillare in vetro per raccogliere CSF (Figura 2C). NOTA: La pressione intracranica consente a CSF di fluire spontaneamente nel capillare (Figura 2C). A seconda dell'età e delle dimensioni del topo, da ogni topo si ottengono circa 5-12 l di CSF.</li>
			<li>Rimuovere con attenzione il tubo capillare dalla membrana. Collegare il tubo a una siringa da 3 mL attraverso un tubo di polietilene (Table of Materials) e iniettare il CSF raccolto in un tubo etichettato da 0,5 mL ( Figura2D). Tenere le fiale nel ghiaccio.</li>
			<li>Chiudere l'incisione utilizzando sutura polidioxanone (PDS) con ago usa e getta e utilizzando suture sepolte17. Pulire l'area di qualsiasi sangue o tessuto essiccato.</li>
			<li>Iniettare i topi, sottocutaneamente o intraperitinalmente16, con 0,05-0,1 mg/kg di cloruro di buprenorfina come trattamento analgesico. Inoltre, iniettare sottocutaneamente 1 mL di salina sterile per prevenire la disidratazione.</li>
			<li>Riposizionare il mouse in una gabbia pulita e calda per il recupero. Una volta che il mouse è mobile e in grado di raggiungere il cibo e l'acqua, posizionare la gabbia sul rack.</li>
			<li>Centrifuga CSF per 10 min a 1.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi. Controllare il grado di contaminazione del sangue mediante ispezione visiva per l'identificazione della xantocromia e la presenza di un pellet rosso nella parte inferiore del tubo. Scartare campioni contaminati dal sangue. NOTA: La formula utilizzata per la correzione delle quantità di proteine CSF in campioni contaminati dal sangue si basa su parametri di equazione che includono contenuto proteico in CSF e siero, ematocrito (HCT) e globuli rossi (RBC) contano in CSF e sangue18. Tuttavia, tale strategia di correzione non può essere facilmente applicata ai campioni di CSF del topo a causa del piccolo volume, limitando così la strategia di correzione a un'ispezione visiva.</li>
			<li>Utilizzando una tecnica di pipetta pulita, raccogliere la CSF in un nuovo tubo da 0,2 mL, lasciando dietro di sé il pellet con le cellule. Diluire CSF 1:3 con PBS per ridurre la perdita di volume dovuta all'aerosol. Congelare immediatamente la fiala del CSF a -80 gradi centigradi.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di siero e CSF con procedure di non sopravvivenza NOTA: per la raccolta di fluidi non di sopravvivenza, la raccolta CSF precede la raccolta del siero in quanto il mouse deve avere un impulso.<ol>
<li>CSF collection presso necropy NOTA: Questa procedura è per la chirurgia non di sopravvivenza, e circa 10-20 L di CSF è ottenuto da ogni topo. Un campo chirurgico sterile è raccomandato, ma non richiesto per la chirurgia non di sopravvivenza.<ol>
<li>Spostare le gabbie contenenti topi dal rack in un comodo spazio di lavoro. Seguite i passaggi 1.1.2.2, 1.1.2.7 e 1.1.2.11,1.1.2.12 per la raccolta CSF. Procedere alla sezione 1.2.2 per la raccolta del siero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raccolta del sangue tramite puntura intracardiaca (approccio aperto) NOTA: I volumi di sangue previsti sono circa il 3% del peso corporeo, ad esempio 0,6 mL da un mouse da 20 g.<ol>
<li>Dopo la raccolta CSF assicurarsi che il mouse sia ancora sufficientemente afizzato pizzicando il piede. Se si osserva una qualsiasi reazione, somministrare una seconda dose di anestetico. Se non si osserva alcuna reazione, procedere.</li>
			<li>Posizionare l'animale sulla schiena e la pelle di tampone sull'addome con il 70% di alcol. Con le forbici chirurgiche, aprire la cavità toracica ed esporre il cuore. Inserire un ago da 25 G (attaccato a una siringa da 3 mL) nel ventricolo sinistro e applicare delicatamente una pressione negativa sullo stantuffo della siringa. Ritirare l'ago dopo che il sangue è stato raccolto.</li>
			<li>Eseguire un metodo secondario di eutanasia come decapitazione o dislocazione cervicale per garantire che l'animale è deceduto.</li>
			<li>Spingere lo stantuffo della siringa verso il basso e iniettare il sangue raccolto in una fiala da 1,5 mL. Lasciare coagulare il sangue per 30-60 min a RT e quindi centrificarlo per 10 min a 2.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 gradi centigradi.</li>
			<li>Utilizzando la tecnica della pipetta pulita, raccogliere il siero in una nuova fiala da 0,5 mL. Congelare immediatamente fiala di siero in un congelatore -80 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analisi delle proteine
<ol><li>Utilizzare un metodo preferito, ad esempio la tecnologia Luminex, per quantificare le proteine bersaglio e l'albumina in campioni di siero e CSF corrispondenti. NOTA: Qui viene fornito un esempio con la tecnologia magnetica Luminex, ma praticamente qualsiasi tecnica che misura la quantità di proteine, compresi i saggi immunosorbena legati agli enzimi (ELAISA), può essere applicata al protocollo attuale. Idealmente, i campioni di CSF e siero vengono eseguiti sia per l'albumina che per le proteine target sulla stessa piattaforma. Le condizioni di analisi devono essere ottimizzate per fasi cruciali del protocollo, come la concentrazione di accoppiamento antigene-perline, le diluizioni dei campioni di siero e CSF, le curve standard più adatte per ogni analita e la composizione del buffer per ridurre la reattività non specifica. Se un kit commerciale viene utilizzato per la misurazione di proteine, ad esempio il kit di isotipizzazione dell'immunoglobulina (Tabella dei materiali) utilizzato per ottenere i dati presentati inFigura 3, le istruzioni dei produttori devono essere seguite.<ol><li>Al momento dello scongelamento e prima dell'analisi, centrifugare campioni di CSF e siero (2.000 x g per 10 minuti) e utilizzare il supernatale per prevenire l'intasamento delle piastre filtranti e/o della sonda. Seguire la procedura di valutazione fornita con il kit per le diluizioni di campione appropriate. In caso contrario, determinare la diluizione appropriata per ogni analita e fluido. Diluire i campioni in PBS di conseguenza. NOTA: Se non esistono indicazioni o istruzioni specifiche, è necessario stabilire diluizioni per ciascun analita e fluido prima del test di studio, determinando gli intervalli di diluizione appropriati necessari per ottenere stime di concentrazione che rientrano nella maggior parte dei casi gamma affidabile di una curva standard. Conoscere le caratteristiche del campione biologico da analizzare, ad esempio concentrazioni fisiologiche e patologiche nel fluido, permette di provare diverse diluizioni con campioni di basso, medio e alto contenuto di analita. Se l'intervallo previsto di concentrazioni nei campioni è noto a priori, le diluizioni possono essere selezionate dopo aver calcolato quante volte il campione deve essere diluito per essere all'interno dell'intervallo di curve standard scelto. AVVISO: Calcolando i fattori di diluizione, ricordate che il CSF è già stato diluito 1:3.</li>
		<li>Preparare una curva standard per ogni proteina di interesse, ad esempio albumina e IgG, utilizzata per generare dati nella Figura 3,diluindo serialmente le proteine standard di riferimento. Durante la preparazione delle curve standard, mescolare accuratamente ogni maggiore concentrazione prima di effettuare la diluizione successiva. NOTA: Indipendentemente dal metodo di quantificazione scelto, è essenziale includere una curva standard ogni volta che il test viene eseguito per stimare la concentrazione di proteine nei campioni. La scelta migliore per uno standard di riferimento è una concentrazione purificata e nota della proteina di interesse. La scelta delle diluizioni specifiche, nonché il numero di punti dati e repliche utilizzati per definire la curva standard, dipende dal grado di non linearità nella curva standard.</li>
		<li>Selezionare i set di perline magnetiche accoppiati con anticorpo appropriati (Tabella dei materiali). Per le singole fiale di perline, sonicare ciascuna fiala per 30 s e vortice per 1 min. Preparare una "miscela di perline di lavoro" diluindo le scorte di perline ad una concentrazione finale di 50 perline di ogni set / s nel tampone di assaggio / lavaggio (PBS, 1% di albumina di siero bovino [BSA]). Aggiungete 50 l di perline miste ad ogni pozzo in una piastra piatta di 96 pozze (Tabella dei materiali). AVVISO: Le perle fluorescenti sono sensibili alla luce. Pertanto, devono essere protetti dall'esposizione prolungata alla luce durante tutta la procedura.</li>
		<li>Creare un diagramma della posizione di sfondi, standard ed esempi in un foglio di lavoro mappa benfile.</li>
		<li>Aggiungete 50 l di assaggio/lavaggio a ogni po' di fondo e 50 l unpo di ogni standard ai pozze per la curva standard. Caricare 50 mL di ogni campione diluito per ultimo nei pozzi appropriati. Avvolgere la piastra con un foglio e incubare con agitazione (800 rpm) su uno shaker di piastra per 30 min a RT.</li>
		<li>Posizionare la piastra su un magnete portatile (Tavolo dei materiali) e appoggiare la piastra sul magnete per s 60 s per consentire la completa impostazione di perline magnetiche. Rimuovere il contenuto del pozzo decantando delicatamente la piastra e toccare la piastra su pastiglie assorbenti per rimuovere il liquido residuo.</li>
		<li>Lavare la piastra rimuovendola dal magnete, aggiungendo 200 l di tampone di assaggio/lavaggio, agitando per 30 s, e infine ricollegandola al magnete. Ripetere il lavaggio 3x.</li>
		<li>Diluire l'anticorpo di rilevamento biotinylato, cioè l'anticorpo con etichetta biotina allevato contro la specie di ospite di proteine, a 4 g/mL nel tampone di analisi/lavaggio. Aggiungere 50 l dell'anticorpo di rilevamento diluito ad ogni pozzo. Coprire la piastra e incubare per 30 min a RT sullo shaker piastra a 800 rpm. Posizionare la piastra sul magnete e ripetere i passaggi 2.1.6 e 2.1.7.</li>
		<li>Dilute phycoerythrin (PE)-coniugato streptavidin (SAPE) a 4 g/mL in assaggio/lavaggio tampone. Aggiungete a ogni pozzo 50 l di SAPE diluita. Coprire la piastra e incubare per 30 min a RT sullo shaker piastra a 800 rpm. Posizionare la piastra sul magnete e ripetere i passaggi 2.1.6 e 2.1.7.</li>
		<li>Rimuovere la piastra dal magnete e risospendere le perline in 100 -L di aspetto/lavaggio tampone. Leggere i pozzi con un doppio strumento di rilevamento basato sul flusso laser che consente di rilevare la magnitudine dell'intensità della fluorescenza PE (FI). NOTA: Il segnale, ad esempio FI, generato è proporzionale alla quantità di antigene bersaglio attaccato alla superficie delle perline.</li>
		<li>Esportare dati grezzi e creare curve standard grafico segnale di rilevamento FI rispetto alle concentrazioni proteiche standard. Utilizzare le curve standard per calcolare la concentrazione degli analiti nei campioni. NOTA: L'albume è espresso preferibilmente in g/dL, mentre le proteine di interesse sono espresse preferibilmente in mg/dL.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calcoli dell'indice intratecale
<ol><li>Organizzare i valori di concentrazione delle proteine in un foglio di calcolo e analizzare i risultati applicando le seguenti formule.</li>
	<li>CalcolaalbuminaQ : <img alt="Equazione per il quoziente di albumina, formula per Q_albumin, correlazione dei livelli di liquido cerebrospinale e albumina sierica." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> dovealbumin CSF ealbumin serum sono concentrazioni di albumina in siero abbinato e campioni CSF, rispettivamente.</li>
	<li>Calcolare laproteinaQ : <img alt="Equazione del rapporto di concentrazione delle proteine Q_protein=(CSF_protein/Serum_protein), analisi biochimica." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> dove laproteina CSF e laproteina del siero sono concentrazioni di proteine bersaglio (s) nei campioni di siero e CSF corrispondenti, rispettivamente.</li>
	<li>Calcolare l'indice proteico: <img alt="Formula dell'indice proteico, equazione, Q_protein/Q_albumin, analisi biochimica." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi quantitativi per la valutazione delle maggiori concentrazioni di proteine CSF sono strumenti utili per la caratterizzazione dello stato fisiologico e patologico del SNC. Tuttavia, al di là della quantificazione affidabile dei livelli di proteine CSF, il rilevamento delle proteine CSF richiede un'espressione dei risultati che discriminano tra le frazioni derivate dal sangue e il SNC nel CSF. Tuttavia, ad oggi, i saggi di quantificazione delle proteine comunemente utilizzati non consentono la discriminazione tra i...

Il liquido cerebrospinale (CSF), un liquido chiaro e incolore che circonda il cervello e il midollo spinale, ha una grande importanza clinica e scientifica di base. Il CSF conserva l'ambiente elettrolitico del sistema nervoso centrale (CNS), bilancia lo stato di base dell'acido sistemico, fornisce nutrienti alle cellule neuronali e gliali, funziona come sistema linfatico per il SNC e trasporta ormoni, neurotrasmettitori, citochine e altri neuropepti in tutto il CNS1. Così, poiché la composizione csF riflette l'attività del SNC, questo fluido offre un prezioso, anche se indiretto, accesso per caratterizzare lo stato fisiologico e patologico del SNC.
CSF è stato utilizzato per diagnosticare condizioni che colpiscono il SNC per oltre un centinaio di anni, e per la maggior parte di questo tempo, è stato studiato principalmente dai medici come strumento diagnostico. Tuttavia, negli ultimi anni i neurobiologi hanno riconosciuto il potenziale della CSF per studiare la fisiopatologia del SNC. In particolare, nel regno delle neuroscienze sono stati introdotti diversi strumenti di analisi delle proteine ad alto contenuto di velocità, consentendo uno studio dettagliato della composizione delle proteine del CSF, con l'aspettativa che questa analisi possa contribuire a fornire informazioni sui cambiamenti dinamici all'interno del SNC.
Gli sviluppi tecnologici nelle tecniche di immunoanalisi multiplex come le tecnologie Luminex e Simoa2,3, forniscono ai ricercatori oggi la capacità di rilevare centinaia di proteine a concentrazioni molto basse. Inoltre, queste stesse tecnologie consentono l'uso di piccoli volumi di campioni, promuovendo così studi su piccoli animali, compresi i topi, in cui volumi di campioni limitati di CSF hanno impedito caratterizzazioni dettagliate del fluido fino a poco tempo fa.
Tuttavia, un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare da sintesi intrateca e/o trasuda dal siero a causa di un'interfaccia emato-encefalica danneggiata (BBI). Sfortunatamente, l'analisi delle proteine del CSF da sola può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra proteine prodotte innodate e intratelamente, le misurazioni delle proteine CSF utilizzando qualsiasi strumento di analisi delle proteine disponibile devono essere regolate per la variabilità individuale nelle concentrazioni di siero e l'integrità delle barriere. Tuttavia, anche se questa regolazione è comunemente utilizzata nella pratica clinica, ad esempio, l'indice CSF IgG, che ha un'elevata sensibilità per rilevare la sintesi intrateca IgG4,5,6, ad oggi pochissimi studi di ricerca hanno corretto le concentrazioni di proteine CSF per la concentrazione di siero e l'integrità della barriera7,8.
Attualmente, l'approccio Reibergram è il modo migliore per determinare la funzione di barriera e la sintesi intratecala delle proteine. Si tratta di una valutazione grafica nei diagrammi quoziente CSF/siero che analizza, in modo integrato, sia la barriera (di)funzione che la sintesi delle proteine intrateche, riferendosi a una proteina esclusivamente derivata dal sangue9,10. L'abbondante albumina proteica è solitamente scelta come proteina di riferimento perché è prodotta solo nel fegato e perché la sua dimensione, circa 70 kDa, è intermedia tra proteine piccole e grandi11. Il diagramma di analisi è stato definito per la prima volta da Reiber e Felgenhauer nel 1987 per le principali classi di immunoglobuine (Igs)11, essendo empiricamente basate sui risultati ottenuti dall'analisi di migliaia di campioni umani9. L'approccio è stato successivamente confermato dall'applicazione delle due leggi di diffusione dei due Fick nella teoria della diffusione molecolare/velocità di flusso12. Tale teoria dimostra la diffusione di una proteina attraverso la barriera ha una distribuzione iperbolica e può spiegare quantitativamente la dinamica delle proteine nel CNS9,13. Nel complesso, il vantaggio di utilizzare il Reibergram per dimostrare la sintesi delle proteine intratecali è che identifica contemporaneamente la frazione proteica che entra nel CSF dal siero e la quantità di proteine presenti nel CSF a causa della produzione locale.
Il presente articolo e il relativo protocollo descrivono l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli finali che correggono i livelli di proteine CSF, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche in modelli murini di neurologia Disturbi. Questa procedura fornisce una linea di base rispetto alla quale valutare (1) l'origine patofisiologica di qualsiasi proteina CSF e (2) la stabilità e il significato funzionale dell'integrità della barriera. Questa procedura e questo protocollo non sono solo utili per valutare campioni di CSF dei topi, ma sono anche utili nell'analisi della CSF in una moltitudine di modelli animali di malattie neurologiche e pazienti umani.

<table><tbody><tr><td>Siringa da insulina da 1 mL</td><td>BD</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>ago da 25 gauge</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>BD</td><td>309582</td><td></td></tr><tr><td>ago da insulina da 30 gauge</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi assorbenti</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td>adatta</tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Rondella magnetica portatile</td><td>BioRad</td><td>171020100</td><td>Magnete</td></tr><tr><td>BioPlex MAGPIX Lettore multiplex</td><td>BioRad</td><td>171015001</td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Pro Piastre a fondo piatto BioRad</td><td></td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo di rilevamento biotinilato</td><td>Qualsiasi fonte</td><td></td> adatta <td>L'anticorpo deve essere diretto contro le specie di la proteina di interesse.</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina cloridrato</td><td>PAR Farmaceutico</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari</td><td>Strumento Sutter</td><td>B100-75-10</td><td>OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm Vetro borosilicato 10 cm; tirato su Bunsen per ridurre le dimensioni dell'ID.</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato di clorexidina</td><td>Nolvasan</td><td>E004272</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette monouso</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td>adatta</tr><tr><td>Barre auricolari</td><td>KOPF Instruments</td><td>1921 o 1922</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Kopter</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore</td><td>VWR</td><td>VWR32086A</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Medline</td><td>NON25212</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Sunbeam</td><td></td><td>XL King Size SoftTouch, 4 impostazioni di calore con spegnimento automatico, verde acqua, camera di induzione da 12 pollici x 24 pollici</td></tr><tr><td></td><td>VETEQUIP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (KetaVed)</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagPlex Microsfere (accoppiate ad anticorpi)</td><td>BioRad</td><td></td><td>Agitatore per micropiastre a sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi</td></tr><tr><td>Microdivaricatori</td><td>Southwest Scientific</td><td>SBT1500</td><td></td></tr><tr><td>Carfill</td><td>Quality</td><td>ACD-010</td><td>Blunt - 1 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MilliPlex MAP Isotipizzazione delle immunoglobuline del mouse Pannello di perline magnetiche</td><td>EMD Millipore</td><td>MGAMMAG-300K</td><td>Kit commerciale per la quantificazione tramite Luminex di un pannello di isotipi e sottoclassi di immunoglobuline nei fluidi di topo.</td></tr><tr><td>Kit ELISA per la cattura dell'albumina di topo</td><td>Novus Biological</td><td>NBP2-60484</td><td>Kit commerciale per la quantificazione tramite ELISA dell'albumina nei fluidi di topo.</td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi non sterili</td><td>MediChoice</td><td>WOD1002</td><td>Necessità di sterilizzazione in autoclave</td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>AIRGAS</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pippettes</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td>5 e 3/4"</td></tr><tr><td>Sutura PDS con ago monouso, 6-0 Prolen</td><td>Patterson Vet</td><td>8695G</td><td>P-3 Taglio inverso, 18"</td></tr><tr><td>PE-Streptavidina</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatori</td><td>Eppendorf</td><td>Research seriers</td><td></td></tr><tr><td>Tubi</td><td></td><td></td><td></td>in polietilene</tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Coltro Beckman</td><td>ALLEGRA X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Scala</td><td>Uline</td><td>H2716</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Piuma</td> <td>di bisturiEF7281</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-5204</td><td></td></tr><tr><td>Proteine standard</td><td>Qualsiasi fonte</td><td></td> adatta <td>La scelta migliore per uno standard di riferimento è una concentrazione purificata e nota della proteina di interesse.</td></tr><tr><td>Strumento stereotassico</td><td>KOPF Instruments Modello</td><td>900LS</td><td>Accessori standard</td></tr><tr><td>Sterile 1 x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Baxter</td><td>0338-0048-02</td><td>Irrigazione con cloruro di sodio allo 0,9</td></tr>% <tr><td>Forcipe chirurgica USP curva, 7 (2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td> Dumont <td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Vaporizzatore 25x in acciaio inox</td></tr><tr><td>+ Flussometro</td><td>Moduflex Anhestesia Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto riscaldante</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RT-JR-20</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore d'acqua</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-08895-01</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Il liquido cerebrospinale (CSF), un fluido trovato nel cervello e nel midollo spinale, è di grande importanza sia per la scienza di base che clinica. L'analisi della composizione delle proteine CSF fornisce informazioni cruciali nella ricerca sulle neuroscienze di base e sulle malattie neurologiche. Un avvertimento è che le proteine misurate in CSF possono derivare sia dalla sintesi intrateca che dalla trasposizione dal siero, e l'analisi delle proteine del CSF può determinare solo la somma di questi due componenti. Per distinguere tra la trasposizione proteica dal sangue e le proteine prodotte intratelamente nei modelli animali e negli esseri umani, le misurazioni di profilazione delle proteine CSF utilizzando strumenti di analisi delle proteine convenzionali devono includere il calcolo dell'albumina CSF/serum quotient (Qalbumin),un marcatore dell'integrità dell'interfaccia emato-encefalica (BBI), e l'indice proteico(proteinaQ /Qalbumin ), una stima della sintesi di proteine intrateche. Questo protocollo illustra l'intera procedura, dalla raccolta del CSF e del sangue ai calcoli dei quozienti e degli indici, per la misurazione quantitativa della sintesi delle proteine intrateche e la compromissione della BBI nei modelli murini di disturbi neurologici.

Questo esperimento rappresentativo mirava a confrontare la sintesi intratecala di IgG in due modelli di roditori clinicamente rilevanti della sclerosi multipla (MS): il PLP139-151-indotta recissa sperimentale di encefalomiesi (R-EAE) e la progressiva cronica, La malattia demielinante indotta dal virus dell'encefalomielisi del Telemanolio (TMEV-IDD). R-EAE è un modello utile per comprendere la recidiva delle MS, mentre il modello TMEV-IDD è dotato di MS19progressivo cronico.
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Livelli elevati di proteine del fluido spinale possono essere il risultato della diffusione della proteina plasmatica attraverso una barriera emato-encefalica alterata o sintesi intratea. In questo articolo viene presentato un protocollo di test ottimizzato che aiuta a discriminare entrambi i casi e fornisce misurazioni quantitative delle proteine sintetizzate intrathecally.

Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Questo protocollo consente al CSF e alla raccolta del sangue nella correzione quantitativa dei livelli proteici csf di misurare in una sintesi proteica tecale nei modelli di topo di disturbi neurologici. Questa procedura fornisce una linea di base, contro la quale è possibile valutare l'origine fisiopatologici delle proteine CSF di interesse e la stabilità e il significato funzionale del QCS del sangue favoriscono l'integrità. L'analisi della sintesi intertecale delle proteine e dell'integrità della barriera può essere applicata ad altri modelli animali e studi sull'uomo.Ad esempio, per verificare la presenza di malattie del sistema nervoso centrale. Raccogliere volumi significativi di CSF pulito può essere tecnicamente impegnativo nei topi, quindi si consiglia di praticare la tecnica fino a quando non è possibile ottenere grandi volumi di campione incontaminato. A dimostrare le procedure sarà Micheal Linzey, studente laureato del programma di medicina sperimentale e molecolare al Dartmouth, nel nostro nuovo gruppo di ricerca immunologica.Per la raccolta del siero tramite sanguinamento orbitale retrò. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo a

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Transgenici (Tg) modelli murini di AD forniscono un'eccellente opportunità per indagare come e perché i livelli di Aβ o tau nel liquido cerebrospinale cambiare il progredire della malattia nei pazienti umani. Qui, dimostrano una raffinata tecnica di puntura cisterna magna per il campionamento CSF ​​seriale dal mouse.

Una tecnica per la raccolta seriale del liquido cerebrospinale dalla Magna Cisterna in Mouse

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

Questo video dimostra la colorazione in immunofluorescenza di una fetta di cervello di topo per quantificare la distribuzione di una specifica proteina presinaptica. Il processo prevede il blocco di siti aspecifici, l'applicazione di anticorpi primari per la proteina bersaglio e un marcatore di riferimento, seguiti dalla marcatura degli anticorpi secondari e dalla controcolorazione nucleare. Il marcatore di riferimento garantisce una quantificazione accurata fornendo una linea di base coerente...

Quantificazione della distribuzione di una proteina presinaptica nel cervello di topo mediante immunofluorescenza

L'identificazione di molecole e percorsi che controllano la plasticità sinaptica e la memoria è ancora una grande sfida nelle neuroscienze. Qui, viene descritto un flusso di lavoro che affronta la quantificazione relativa delle proteine sinaptiche presumibilmente coinvolte nella riorganizzazione molecolare delle sinapsi durante l'apprendimento e nel consolidamento della memoria in un paradigma di apprendimento uditivo.

Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

Viene descritta una procedura di misura di riferimento per la quantificazione assoluta di Aβ1-42 nel liquido cerebrospinale umano basata sull'estrazione in fase solida e sulla spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida.

Quantificazione assoluta di A?<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

Abbiamo generato con successo due saggi di substrato specifico γ-secretasi. Entrambi analisi cell-based qui presentate sono progettate per quantificare le attività enzimatiche γ-secretasi tramite l'uscita dei reporter luciferasi firefly.

Misurazione quantitativa della proteina precursore dell'amiloide γ-secretasi-mediata e la fenditura di Notch in Cell-based Luciferase Reporter Assay piattaforme

La sintesi proteica è un processo biologico critico per le cellule. Nel cervello, è necessario per le modifiche adattive. La misurazione dei tassi di sintesi proteica nel cervello intatto richiede un'attenta considerazione metodologica. Qui presentiamo il metodo autoradiografico quantitativo L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali in vivo.

Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Questo metodo viene descritto un approccio affidabile e riproducibile per il confronto dei livelli della proteina in tessuti differenti e timepoints inerente allo sviluppo diversi utilizzando un approccio macchiante occidentale quantitativo standardizzato.

Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Questo lavoro descrive un protocollo per la quantificazione delle modificazioni istoniche globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare in microglia cerebrali isolate. Il lavoro contiene anche il protocollo di isolamento della microglia che è stato utilizzato per la raccolta dei dati.

Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Scopri un protocollo ottimizzato per la raccolta di liquido cerebrospinale e sangue nei topi, che permette di misurare quantitativamente le proteine sintetizzate intratecalmente. Questo metodo aiuta a distinguere tra alterazioni della barriera ematoencefalica e sintesi intratecale.

Misurazione quantitativa delle proteine intratecalliamente sintetizzate nei topi

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