Quantificazione delle cellule morte e proliferanti negli enteroidi

Questo protocollo è utile per l'isolamento enteroide in una coltura oltre a studiare la proliferazione cellulare e la sopravvivenza negli enteroidi. Gli scienziati possono applicare questa tecnica alla coltura degli enteroidi e allo studio dell'effetto dei farmaci e delle citochine infiammatorie sulle cellule epiteliali intestinali in vitro. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'acqua della malattia infiammatoria intestinale.

Applichiamo questo metodo per trovare alcune citochine terapeutiche. Questo metodo fornisce approfondimenti sulla proliferazione e la sopravvivenza epiteliale intestinale;inoltre può essere utilizzato anche in organoidi, coltivati attorno a tessuti diversi dall'intestino. Per isolare le cripte intestinali ed eseguire la coltura enteroide, usa le pini tissutali e trova le forbici dell'iride per sezionare circa otto centimetri di ileo da un topo di tipo selvatico euthanizzato di otto settimane.

Utilizzare una siringa con un ago di alimentazione del gavage per lavare l'ileo con circa 40 millilitri di salina tamponata al fosfato di Dulbecco, quindi tagliare longitudinalmente con le forbici e aprire l'ileo. Tagliare l'ileo a pezzetti e metterli in cinque millilitri di DPBS sterile ghiacciato in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi dondolare il campione per cinque minuti sul ghiaccio.

Utilizzare un controller pipetta per aspirare il DPBS e sostituirlo con 10 millilitri di tampone freddo uno. Dopo aver dondolato per 30 minuti sul ghiaccio, utilizzare il controller della pipetta per aspirare il tampone uno e sostituire con 10 millilitri di tampone freddo due. Quindi agitare per due o tre minuti a mano a circa 80 frullati al minuto.

Dopo aver tremato, ispezionare una goccia da venti micro litri di tampone due contenuti al microscopio per assicurarsi che ci siano cripte con cellule paneth granulari. Tampone filtrante due contenuti con un colino sterile a celle da 70 micron e raccogliere il tampone filtrato in un tubo conico da 50 millilitri. Pipetta 20 microlitri di filtrato sullo scivolo per contare le cripte.

Trasferire un volume sufficiente del buffer filtrato di due contenuti per assicurarsi che ci siano circa 500 cripte per pozzo. Girare verso il basso a 150 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aspirare attentamente il supernatante. Riprendo le cripte in 50 microlitri di matrice di membrana basale per 500 cripte.

Pipetta su e giù facendo attenzione ad evitare bolle. Posizionare una goccia da 50 microliter di matrice di membrana basale e miscela di cripta al centro di un pozzo di una piastra di 24 pozzetti. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per polimerizzare la matrice della membrana basale.

Dopo 30 minuti di polimerizzazione, aggiungere con cura 600 microlitri di mezzi minigut ad ogni pozzo. Riportare la piastra all'incubatore di 37 gradi Celsius e osservare al microscopio ogni giorno, cambiando il supporto ogni due o tre giorni. Per passare gli enteroidi, posizionare la piastra di coltura tissutale sul ghiaccio, aspirare il supporto e aggiungere un millilitro di DPBS freddo ad ogni pozzo.

Utilizzare una punta P1000 per pipettare su e giù fino a quando non rimangono blocchi di matrice. Passare il campione attraverso una siringa di insulina da un millilitro e scendere in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver filato per cinque minuti a 150 volte G e quattro gradi Celsius, utilizzare una pipetta per rimuovere il DPBS.

Sospendere di nuovo gli enteroidi in 50 microlitri di matrice di membrana basale per pozzo. Posizionare la piastra nell'incubatore di 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di polimerizzare. Quindi, sovrapporre ogni pozzo con 600 microlitri di supporti ENR e restituire la piastra all'incubatore.

Far crescere gli enteroidi da cinque a sette giorni prima di passarli in una nuova piastra da 24 pozzi usando un rapporto di scissione da uno a due. Aggiungere 600 microlitri di mezzo ENR a ciascun pozzo, quindi incubare gli enteroidi per quattro o cinque giorni nell'incubatore di 37 gradi Celsius. Impostare il gruppo di controllo degli enteroidi non trattati e il gruppo sperimentale di enteroidi trattati con cinque nanogrammi per millilitro di interleuchina-22.

Preparare almeno tre repliche per ogni gruppo. Aggiungere 600 microlitri di supporto EdU ad ogni pozzo di enteroidi tranne uno da usare come controllo negativo per la sottrazione di fondo. Incubare il piatto per due ore in un incubatore di 37 gradi Celsius.

Per raccogliere enteroidi dalla matrice della membrana del seminterrato, utilizzare un controller pipetta per aspirare il mezzo EdU e lavare una volta con DPBS. Quindi, aggiungere un millilitro di DPBS. Utilizzare una punta della pipetta P1000 per pipettare su e giù fino a quando non rimangono blocchi di matrice a membrana basale solida.

Trasferire il campione su un tubo da 15 millilitri e girare verso il basso a 300 volte G per cinque minuti prima di scartare il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di enzimi di dissociazione cellulare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi utilizzare una punta della pipetta P200 per pipettare su e giù e suddividere gli enteroidi in singole celle.

Aggiungere quindi tre millilitri del mezzo aquila modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e pipettare ripetutamente con una punta di pipetta P1000. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti e aspirato il supernatante, sospendiamo le cellule in un millilitro di DPBS. Per eseguire la fissazione e la permeabilità delle cellule, trasferire prima la sospensione cellulare su un tubo millilitro di un punto cinque, girare verso il basso a 300 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.

Sospendiamo le cellule in un millilitro di paraformaldeide al 4% e fissiamo per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, aspirare il supernatante con una punta di pipetta. Lavare le celle una volta con il DPBS e girare di nuovo verso il basso per rimuovere il supernatante.

Rimescolare le cellule con un millilitro dello 0,5% di tensioattivo non ionico e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente prima di lavare le celle con DPBS come prima. Per rilevare l'EdU, aggiungere 100 microlitri di cocktail di reazione a ogni tubo da 1,5 millilitri. Rimorsi le cellule e proteggerle dalla luce, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, aspirare delicatamente la soluzione di reazione con una punta di pipetta Aggiungere 0,5% di penetrante tensioattivo non ionico a ciascun tubo per lavare una volta a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione come prima, sospendiamo le cellule in un millilitro di DPBS. Filtrare le cellule rimorsi con un colino da 40 micron e raccogliere le celle filtrate in un tubo conico da 15 millilitri.

Eseguire i fatti sul rilevamento della macchina il prima possibile. Selezionare il canale e la tensione appropriati per l'analisi della citometria di flusso. Per la strategia di gating, disegnare un plottaggio pseudocolore FSC-A contro SSC-A e distribuire la maggior parte delle celle nell'intervallo visibile della mappa puntiforme regolando la tensione.

Selezionate la popolazione di celle come R1 ed escludete i detriti cellulari nell'angolo in basso a sinistra. Dalla popolazione cellulare R1, stabilire un grafico pseudocolore FSC-A contro FSC-H. Impostate il cancello per selezionare singole celle designate come R2 ed escludete i grumi di celle.

Dalla popolazione cellulare R2, stabilire l'intensità di fluorescenza rispetto al grafico del numero di cella e utilizzare il controllo negativo per impostare il gate. La regione del segnale fluorescente è una regione a cellule positive denominata R3.Confronta il rapporto di queste cellule positive edu tra i gruppi sperimentali e di controllo. Piccole cripte intestinali erano isolate e coltivate come enteroidi nella matrice della membrana basale.

Gli enteroidi iniziarono a formare gemme due giorni dopo l'isolamento. Il sesto giorno, gli enteroidi avevano molte gemme con molti detriti nel lume. Gli enteroidi erano pronti per essere passaggi in questa fase.

Gli enteroidi sono stati trattati con IL-22 per 3 giorni, dopo di che il DNA sintetico è stato etichettato con EdU in rosso per indicare la proliferazione cellulare. Gli enteroidi trattati con IL-22 mostrarono un numero maggiore di cellule positive dell'EdU. IL-22 ha aumentato le cellule prolifere dal 40,1% all'83,5% come analizzato dalla citometria del flusso.

Il trattamento IL-22 ha anche aumentato la morte cellulare negli enteroidi indicati dalla colorazione del propidio ioduro in rosso. IL-22 ha aumentato le cellule morte dal 4,9% al 16,2% come analizzato dalla citometria del flusso. Durante l'isolamento della cripta è necessaria una bella scossa dopo aver aggiunto un buffer per garantire che abbastanza cripte vengano scosse.

Si consiglia di ispezionare i contenuti al microscopio. Seguendo questa procedura, possiamo anche quantificare i tipi di epiteliali differenziati e gli enteroidi utilizzando specifici Questo metodo aiuterà i ricercatori a indagare la differenziazione epiteliale intestinale negli enteroidi. Dopo il suo sviluppo questa domanda apre la strada ai ricercatori nel campo della gastroenterologia per esplorare le questioni dello sviluppo o patologiche nel taglio.