Integrazione di approcci bioinformatici e convalide sperimentali per comprendere il ruolo della segnalazione di nota nel cancro ovarico
January 12th, 2020
La bioinformatica è un modo utile per elaborare set di dati su larga scala. Attraverso l'implementazione di approcci bioinformatici, i ricercatori possono ottenere rapidamente, in modo affidabile ed efficiente applicazioni approfondite e scoperte scientifiche. Questo articolo dimostra l'utilizzo della bioinformatica nella ricerca sul cancro ovarico. Convalida anche con successo i risultati della bioinformatica attraverso la sperimentazione.
La bioinformatica è un modo utile per estrarre informazioni dai set di dati. La sperimentazione è altrettanto importante per la convalida. Combiniamo entrambi gli approcci per indagare il ruolo della segnalazione della tacca nel cancro alle ovaie.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ricercatori possono utilizzare le informazioni dei database di bioinformatica per pianificare la loro direzione di ricerca prima di condurre un esperimento. Con i dati bioinformatici accumulati sulle malattie umane, gli scienziati non sono più bendati. La sperimentazione può essere eseguita per convalidare risultati specifici, che possono portare a terapie migliorate o diagnosi di malattie.
Per l'analisi meta-A dell'associazione di un gene di interesse con un tipo specifico di tumore, creare un account con un indirizzo email affiliato all'accademico per accedere al database PRECOG e inserire l'indirizzo e-mail e la password associati all'account nel terminale di accesso. Fare clic su Visualizza dettagli e immettere il gene di interesse nella barra di ricerca. Quindi usa la barra di scorrimento per ottenere il punteggio Z di sopravvivenza per il tipo specifico di interesse del cancro.
Per indagare l'associazione tra i livelli di espressione genica e le fasi del cancro alle ovaie, passare alla pagina web di CSIOVDB e inserire il nome del gene di interesse nella barra di ricerca. Quindi fai clic sulla scheda Sopravvivenza. Per valutare i dati dell'espressione genica tra tessuti diversi, normali e tumorali, passare al portale GENT e fare clic sulla scheda Cerca.
Nella sezione delle parole chiave, selezionare il simbolo genico per i termini dal menu a discesa, inserire il simbolo del gene del gene di interesse e selezionare Tessuto per l'opzione tipo. Fare clic sul pulsante Cerca. Verranno visualizzati grafici riassuntiri dell'espressione genica nei tessuti normali e tumorali di diversi tipi di cancro, basati sulle piattaforme U133A e U122 Plus 2.
Quindi fare clic sul collegamento Download dati risultato per accedere alle informazioni dettagliate sui valori dell'espressione genica, sui tipi di tessuto e sulle origini dati. Per cercare alterazioni genetiche e reti di segnalazione, aprire la pagina web del portale CBIO e, utilizzando la query nella pagina di destinazione, fare clic sugli organi o sui tessuti di interesse nella sezione Seleziona studi, selezionare il particolare studio di interesse e fare clic su Query by Gene. Nella sezione Seleziona profili genomici selezionare le mutazioni, le alterazioni putative del numero di copia da GISTIC o l'opzione di espressione dell'mRNA.
Selezionare i dati corrispondenti dal menu Seleziona set di pazienti/casi e immettere i simboli gene di destinazione nella casella di query Immettere geni. Fare clic sul pulsante Invia query e aprire la scheda Rete per recuperare la rete genica desiderata. Quindi fare clic sulla scheda File e selezionare Salva come immagine PNG per il download di immagini di rete.
Per creare mosche con sovraespressione NICD o NICD e mam, preparare le scorte di mosca appropriate e applicare la tecnica di targeting dell'espressione genica temporale e regionale per controllare l'espressione genica spatiotemporale, secondo protocolli standard. Alza le mosche a 18 gradi Celsius fino all'età adulta, prima di passare a 29 gradi Celsius con lievito per 48 ore. Alla fine dell'incubazione di 29 gradi Celsius, aggiungere tre millilitri di PBS a un piatto di raccolta degli embrioni e anestetizzare la coltura della mosca con un cuscinetto di anidride carbonica.
Utilizzare un microscopio sezionante per identificare una mosca femminile anestetizzata e utilizzare un paio di forcep sezionanti per afferrare attentamente il torace inferiore della mosca. Immergere la mosca nel PBS all'interno del piatto di raccolta dell'embrione e utilizzare un secondo paio di forcep per pizzicare l'addome inferiore, tirando delicatamente per rilasciare gli organi interni. Individuare e staccare la coppia di ovaie dal corpo della mosca e rompere la torcia muscolare, situata all'estremità posteriore delle ovaie, per separare le ovaie.
Quindi posizionare le ovaie isolate in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri, contenente 500 microlitri di PBS sul ghiaccio. Una volta raccolte tutte le ovaie, sostituire il PBS con 500 microlitri di formaldeide al 4% e posizionare il tubo su un nutator per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, scartare il fissatore e lavare le ovaie con tre risciacqui di 15 minuti in un millilitro di PBT per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le ovaie con 150 microlitri da 10 microgrammi per millilitro DAPI per 10-15 minuti sul nutator. Alla fine dell'incubazione, lavare le ovaie una volta per 10 minuti con un millilitro di PBT, seguito da due lavaggi di 10 minuti in PBS. Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutti gli ultimi 300 microlitri di PBS e utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri per triteare più volte le ovaie per liberare le camere delle uova.
Successivamente, sedimentare delicatamente il tessuto ovarico attraverso un rapido giro in un microcentrifugo e rimuovere il più PBS possibile senza disturbare il pellet d'ovaio. Utilizzando una punta di pipetta da 1.000 microliter, trasferire circa tre gocce di soluzione di montaggio sul tubo e utilizzare una punta della pipetta da 200 microlitri con circa 0,33 millimetri tagliati dall'estremità per trasferire l'intero 120 microlitri di soluzione di montaggio contenente ovaie su uno scivolo al microscopio di vetro. Posizionare delicatamente un vetro coverslip sulla soluzione di montaggio e sigillare i bordi con smalto trasparente.
Quindi utilizzare un microscopio confocale con un ingrandimento 10x con un'apertura 0.8 per acquisire immagini delle ovaie macchiate e montate. Utilizzando il portale PRECOG come dimostrato, è possibile ottenere i punteggi Z di NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 nel cancro alle ovaie. I valori negativi del punteggio Z indicano la scarsa sopravvivenza complessiva dei pazienti con alti livelli di espressione dei tre geni.
Utilizzando il database CSIOVD per confermare questi risultati, indica inoltre che un'alta espressione di NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 è correlata a una scarsa sopravvivenza complessiva e priva di malattie. Ulteriori test di permutazione suggeriscono che NOTCH2, NOTCH3 e MAML1 sono altamente espressi nei tessuti tumorali. Sulla base di questi tre geni principali, è possibile creare una rete di segnalazione per fornire i 50 geni vicini più frequentemente alterati che si trovano anche nella stessa via con i più alti tassi di mutazione.
Di interesse, la sovraespressione del gene NOTCH equivalente alla Drosophila, NICD, da solo, non induce tumori nella Drosophila. Mentre la sovraespressione di NICD e mam insieme induce tumori nei moscerini della frutta, come evidenziato dalla presenza di più strati epiteliali e cellule accumulate. Un'ulteriore convalida della sperimentazione può aprire la strada all'identificazione di potenziali nuovi obiettivi terapeutici farmacologici, biomarcatori di malattie e trattamenti personalizzati.
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Panoramica
Questo articolo esplora l'integrazione della bioinformatica e della sperimentazione per investigare la segnalazione Notch nel cancro ovarico. Sfruttando i database di bioinformatica, i ricercatori possono pianificare strategicamente i loro esperimenti, portando a scoperte scientifiche più informate.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Bioinformatica
- Ricerca sul cancro ovarico
- Validazione sperimentale
Contesto
- La bioinformatica aiuta nell'elaborazione di dataset su larga scala.
- Combinare la bioinformatica con la sperimentazione migliora i risultati della ricerca.
- La segnalazione Notch svolge un ruolo significativo nel cancro ovarico.
- Utilizzare i dati di bioinformatica esistenti può guidare la progettazione sperimentale.
Obiettivo dello studio
- Investigare il ruolo della segnalazione Notch nel cancro ovarico.
- Validare i risultati della bioinformatica attraverso approcci sperimentali.
- Migliorare le terapie e le diagnostiche per il cancro ovarico.
Metodi utilizzati
- Analisi bioinformatica dei percorsi di segnalazione Notch.
- Validazione sperimentale delle previsioni bioinformatiche.
- Integrazione dei dati dai database di bioinformatica.
- Pianificazione della direzione della ricerca basata sulle intuizioni bioinformatiche.
Risultati principali
- Identificazione di successo dei componenti chiave della segnalazione Notch.
- Validazione dei risultati bioinformatici attraverso la sperimentazione.
- Intuizioni su potenziali bersagli terapeutici per il cancro ovarico.
- Dimostrazione dell'efficacia della combinazione di bioinformatica con metodi sperimentali.
Conclusioni
- La bioinformatica è uno strumento potente nella ricerca sul cancro.
- La validazione sperimentale è cruciale per confermare le previsioni bioinformatiche.
- Combinare questi approcci può portare a significativi progressi nella comprensione del cancro ovarico.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Integrating bioinformatics with experimental validation enables biopharma teams to de-risk target hypotheses in ovarian cancer by leveraging large-scale datasets for target prioritization before costly wet-lab efforts. This combined approach improves predictive confidence in Notch signaling components as potential therapeutic targets or biomarkers, supporting informed go/no-go decisions in early discovery. The methodology supports translational continuity from target identification through preclinical validation by aligning computational findings with functional evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Notch2, Notch3, and MAML1 as putative drivers in ovarian cancer through bioinformatics analysis of survival Z-scores and gene expression correlations.
- Operational Value: Supports functional target validation by guiding experimental design using PRECOG, CSIOVDB, GENT, and CBIO portals to identify differentially expressed genes and altered signaling networks.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying genetic alterations and signaling networks associated with poor survival, informing target selection for further validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (e.g., Drosophila ovaries with NICD/mam overexpression) for downstream compound screening by establishing phenotype-genotype links in Notch pathway modulation.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through defined spatiotemporal gene expression controls and standardized ovarian tissue isolation, fixation, and imaging protocols.
- Scalability Value: Enables platform reuse across cancer types by demonstrating a transferable workflow for integrating database mining with experimental validation in genetically tractable models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking Notch pathway activation in Drosophila ovaries to tumorigenic phenotypes, providing a mechanistic basis for therapeutic targeting.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by requiring combinatorial overexpression (NICD + mam) to induce tumors, highlighting context-dependent pathway activity critical for target validation.
- Translational Biomarker Alignment: Connects bioinformatics-derived survival correlations (NOTCH2/3/MAML1 Z-scores) with experimental tumor phenotypes, supporting biomarker qualification efforts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, where bioinformatics informs hypothesis generation and experimental validation confirms target druggability and pathway relevance in ovarian cancer.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mining survival and expression databases to prioritize Notch signaling components for functional interrogation.
- Screening: Describes assay readiness through standardized ovarian tissue preparation and confocal imaging, enabling quantitative readouts of Notch pathway activation phenotypes.
- Analytics: Highlights survival Z-scores, gene expression correlations, and permutation test outputs that allow cross-functional teams to compare target relevance and pathway alteration frequencies.
- Translational Research: Connects computational target prioritization to preclinical continuity by validating Notch-driven tumorigenicity in a genetic model, supporting de-risked advancement.
- Enterprise Reuse: Frames the workflow as a reusable capability for target validation across oncology indications by demonstrating a repeatable process of database interrogation followed by experimental confirmation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target selection, reduction of mechanistic ambiguity in Notch pathway involvement, and improved target hypothesis quality.
- Operational Value: Standardization of bioinformatics-to-experiment workflows, reproducibility of ovarian tissue isolation and imaging, and scalability of database mining approaches.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through dual-evidence target validation, capital efficiency by focusing experiments on bioinformatics-prioritized targets, and reduced late-stage biological risk via mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of Notch2/3/MAML1 or network neighbors for investment, and data-driven advancement decisions based on concordant computational and experimental evidence.
Implementation Considerations
- Required expertise in bioinformatics database navigation (PRECOG, CSIOVDB, GENT, CBIO) and interpretation of survival Z-scores, gene expression profiles, and mutation data.
- Instrumentation needs include access to academic-affiliated bioinformatics portals, standard molecular biology tools for fly handling, dissection microscopes, centrifuges, and confocal microscopes for tissue imaging.
- Cross-team standardization requires alignment between computational biologists and experimentalists on target selection criteria, gene symbols, and validation endpoints such as tumor phenotype scoring.
- Adaptation considerations include modifying gene targets, cancer types in database queries, and overexpression constructs while maintaining the core workflow of in silico prediction followed by in vivo/in vitro validation.
- Practical limitations include dependency on database annotation quality, potential species-specific differences in Notch signaling between Drosophila and humans, and the need for orthogonal validation in mammalian models to confirm translational relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Prediction of Clinical Outcomes from Genomic Profiles (PRECOG)
1:22
Cancer Science Institute of Singapore Database (CSIOVDB) and Gene Expression Across Normal and Tumor Tissue (GENT)
2:30
cBioPortal
3:30
Drosophila Dissection and Staining
7:23
Results: Representative Bioinformatic Approaches to Understanding the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer
8:42
Conclusion
