Name: Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara la microscopia intravitale per studiare il reclutamento dei leucociti nel muscolo cremaster del topo. Questo metodo riproducibile consente di visualizzare le interazioni leucocito-endotelio in vivo nei modelli infiammatori.

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Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell'ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un'abile assistenza tecnica.

Gli animali erano ospitati in condizioni controllate e specifiche prive di agenti patogeni presso l'IBF (Interfakult're Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'IRB locale e dal Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Germania.
1. Amministrazione dell'anestesia
<ol><li>Anestesizzare il topo mediante iniezione di bolus intraperitoneale (i.p.) di 125 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.</li>
	<li>Posizionare e fissare il mouse in una posizione recumbent dorsale su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea del mouse (36,5-38 gradi centigradi). Utilizzare una sutura sterile non assorbibile (6/0) per avvolgere un semplice anello intorno ai denti frontali e nastro le estremità di giunzione della sutura al pad di riscaldamento. Questa fissazione mira a mantenere la bocca aperta al fine di evitare disturbi nella respirazione.</li>
	<li>Controllare il mouse per la profondità appropriata di anestesia da pizzico di punta interdigitale (ritiro non dovrebbe essere visto).</li>
	<li>Una volta raggiunta l'anestesia sufficiente procedere alla preparazione chirurgica. Confermare ripetutamente l'anestesia lungo l'esperimento in corso ogni 30 min. Ri-somministrare i farmaci come descritto sopra se necessario.</li>
	<li>Soluzione salare fisiologica Equilibrate (PSS, composizione: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3)con 5% CO2/95% N2 per 15 minuti. Bolle continuamente PSS con 5% CO2/95% N2 durante l'esperimento e mantenere a 37 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Preparazione chirurgica della trachea e dell'arteria carotide (opzionale)
<ol><li>Dissezionare la pelle dalla zona del collo tirando delicatamente la pelle con una pinzetta nella linea mediana. Utilizzare le forbici per applicare un taglio circolare di 1-2 cm di diametro per dare spazio sufficiente per la preparazione chirurgica.</li>
	<li>Sezionare attentamente il muscolo circostante, i tessuti grassi e connettivi usando le pinzette.</li>
	<li>Fare un taglio trasversale (1,3 mm) nella trachea utilizzando piccole forbici chirurgiche e introdurre un tubo di polietilene (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") all'interno dell'estremità caudale della trachea per fissare le vie aeree superiori.</li>
	<li>Fissare il tubo situato nella trachea da un singolo sutura circolare (6/0 USP).</li>
	<li>Individuare l'arteria carotide lungo il lato destro della trachea e sezionare il tessuto circostante dalla parete dell'arteria carotide. In alternativa, la giugulare o anche la vena posteriore potrebbe essere utilizzata per l'accesso i.v. Cercate di evitare lesioni al nervo vagale, in quanto si trova vicino.</li>
	<li>Passare due pezzi di sutura (6/0) sotto l'arteria carotidea. Posizionare la prima propala cranica prossima, vicino alla biforcazione delle arterie carotidi e legarla in modo permanente. La seconda sutura sarà situata a circa 5-8 mm distale dal primo e successivamente utilizzato per fissare il tubo nell'arteria carotide. Non legarlo ancora.</li>
	<li>Preparare un tubo di polietilene (I.D. x O.D. 0.011" x 0.024") con una lunghezza di 30 cm piegando la parte finale a un ago di siringa da 1 mL riempito con salina (0,9% NaCl). Lavaggio rigoroso è importante per prevenire l'embolizzazione dell'aria durante la preparazione.</li>
	<li>Utilizzare una clip del recipiente di 7 mm per bloccare l'arteria carotide della seconda sutura.</li>
	<li>Eseguire un piccolo taglio trasversale (0,5 mm) nell'arteria carotide e introdurre il tubo sterile di polietilene. Fissare il tubo nell'arteria utilizzando la seconda sutura preparata prima.</li>
	<li>Rimuovere la clip del vaso e applicare delicatamente un po 'di tensione alla siringa collegata al tubo di polietilene. Questo catetere carotide può ora essere utilizzato per somministrare farmaci o prelevare campioni di sangue se necessario, anche il monitoraggio della pressione sanguigna o della frequenza cardiaca è possibile con i rispettivi dispositivi.</li>
</ol>3. Preparazione chirurgica del muscolo cremaster
<ol><li>Trasferire il mouse sul pad di riscaldamento (insieme al pad di riscaldamento) al telaio in plastica su misura tenendo il palco per la microscopia successiva. Orientare il mouse con lo scroto rivolto verso lo stadio del microscopio.<ol>
<li>Rivalutare la profondità dell'anestesia prima di procedere; ri-somministrare da un quarto a metà dose di anestesia, se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localizzare lo scroto, tenendolo nella sua parte più distale con una pinzetta, tirarlo delicatamente e tagliare una sezione circolare di pelle scrotale con circa 5 mm di diametro. Assicurarsi di non danneggiare le strutture sottostanti come il muscolo cremato. Assicurarsi di mantenere il tessuto aperto ben idratato con soluzione salina.</li>
	<li>Dissect tessuto connettivo sciolto utilizzando due pinzette e localizzare entrambi i testicoli.</li>
	<li>Tenere un testicolo e iniziare delicatamente tirarlo fuori, rimuovendo il tessuto connettivo circostante passo dopo passo.</li>
	<li>Una volta che il testicolo è esteriorizzato, pinala all'estremità disalare all'anello di gomma che circonda lo stage. All'esternolizzazione, idratare il tessuto con soluzione salina durante l'intero processo.</li>
	<li>
Passaggio critico: Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo senza danneggiare il muscolo cremaster sottostante. Il tessuto connettivo in eccesso può ostacolare la visione nella microscopia successiva e può produrre immagini sfocate.</li>
	<li>Pin la parte distale del testicolo verso il basso e aprire il muscolo cremaster da un piccolo taglio trasversale (circa 1 mm), seguito da incisione longitudinale dall'estremità molto distale alla fine prossimale. Di conseguenza il muscolo creman dovrebbe aprirsi sfericamente. Vascello macroscopicamente visibile non deve essere reciso, in quanto ciò può avere un impatto sull'emodinamica.</li>
	<li>Stendere con attenzione il muscolo sullo stadio di vetro e pin all'anello di gomma. Assicurarsi di non toccare o danneggiare la regione centrale, come microscopia verrà eseguita qui. Attenzione: l'eccesso di stretching può ostacolare il flusso sanguigno.</li>
	<li>Pin i testicoli rimanenti da parte per dare accesso alla regione di interesse. Assicurarsi di inumidire ripetutamente con PSS per evitare l'essiccazione. Il muscolo montato è ora pronto per la microscopia.</li>
</ol>4. Microscopia intravitale
<ol><li>Posizionare il muscolo cremaster montato al microscopio verticale ed eseguire la microscopia utilizzando un obiettivo 40x.</li>
	<li>Acquisire dati ed esportare utilizzando la spettrografia di imaging ad alta velocità effettiva.</li>
	<li>Eseguire registrazioni in continua superfusione con PSS17preriscaldata (35-37 gradi centigradi). Applicare la superfusione da un piccolo tubo che è stato registrato per l'obiettivo verticale del microscopio per consentire il continuo gocciolamento di PSS insieme all'obiettivo verso il basso sul tessuto muscolare.</li>
	<li>Identificare le venule post-capillari (confluenza di due vasi più piccoli) e misurare la microcircolazione sulle venule con un diametro di 20-40 m.</li>
	<li>Registra immagini ad alta risoluzione della microcircolazione dal muscolo cremaster in un intervallo di tempo di 30 s. Come ci potrebbe essere una leggera contrazione e rilassamento del tessuto muscolare durante la registrazione, assicurarsi di regolare continuamente la messa a fuoco. Generalmente, il topo tende a mostrare una circolazione stabile per circa 2 ore. È possibile acquisire diverse registrazioni di navi diverse provenienti da diverse regioni. Uno o entrambi i testicoli possono essere utilizzati successivamente. NOTA: Poiché si tratta di un modello di infiammazione, sono: applicazione sistemica o iniezione scrotale locale Ndi mediatori infiammatori pro, nonché superfusione con ad esempio N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP). La stimolazione locale tNF-z è comunemente usata per innescare il reclutamento di leucociti; L'endotossiamia indotta da LPS è un modello di infiammazione sistemica grave SIRS.</li>
</ol>5. Visualizzazione Leukocite
NOTA: I leucociti aderenti e rotondi possono essere facilmente visti senza ulteriori visualizzazioni. Per determinare la velocità della linea centrale dei leucociti in movimento libero, eseguire la colorazione differenziale.
<ol><li>Se si utilizzano topi etichettati eGFP, analizzarli direttamente mediante microscopia a fluorescenza.</li>
	<li>Per i ceppi di topo etichettati non eGFP, utilizzare la colorazione della rodamina.<ol>
<li>Somministrare la rhodamina 6G a 0,2 mg/kg di peso corporeo. Dosi ripetute possono essere necessarie per ottenere intensità di colorazione sufficiente. Assicurarsi di mantenere piccoli volumi, in quanto volumi più grandi possono influenzare i parametri emodinamici.</li>
		<li>Per la colorazione istantanea dei leucociti, somministrare la macchia attraverso l'arteria carotide. Se la dissezione dell'arteria carotide non è stata eseguita, la colorazione sufficiente può essere ottenuta mediante applicazione i.p. utilizzando la stessa dose18. In alternativa alla cateterizzazione dell'arteria carotide, è possibile eseguire qualsiasi altra cateterizzazione venosa. NOTA: Tenere presente che la colorazione delle roderie, a differenza dell'etichettatura eGFP, mostra il decadimento temporale dell'intensità della fluorescenza e un massimo complessivo di colorazione di circa l'80% dei leucociti a concentrazioni più elevate.</li>
		<li>Visualizza la microscopia a rio di rotoli con macchie di rhodamina liberamente in movimento mediante microscopia a fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Fine dell'esperimento
NOTA: il tempo stimato complessivo per l'esecuzione di questo protocollo deve essere 90 – 150 minuti.
<ol><li>Termina l'esperimento con eutanasia per lussazione cervicale.</li>
	<li>Per ulteriori analisi, come la trasmigrazione, fissare il muscolo cremaster in PFA mentre ancora allungato sul palco e macchiato per l'istologia come richiesto.</li>
</ol>7. Analisi offline
<ol><li>Analizzare i seguenti parametri come conteggi semplici durante la riproduzione video.<ol>
<li>Calcolare il flusso di rotolamento [numero / min]: numero di cellule che rotolano passando una linea immaginaria / min</li>
		<li>Calcolare l'adesione [numero/mm2]: numero di cellule adesive alla parete del vaso all'interno del campo visivo - 30 s/superficie vascolare [mm2].</li>
	</ol>
</li>
	<li>Misurare i seguenti parametri emodinamici e microvascali vengono misurati utilizzando ImageJ.<ol>
<li>Calcolare il diametro del vaso [m] come diametro della parete interna.</li>
		<li>Calcolare la lunghezza della nave [m] come lunghezza della linea centrale della nave.</li>
		<li>Calcola la <img alt="Simbolo del micrometro al secondo [μm/s] per la misurazione della velocità nelle equazioni scientifiche." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> velocità della linea centrale ottenuta dall'analisi video fotogramma-fotogramma dei leucociti in movimento libero nella linea centrale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare le equazioni seguenti come stima.<ol>
<li>Calcolare la superficie vascolare in [mm2]:lunghezza del recipiente [m] x diametro del recipiente [m] x x 10-6.</li>
		<li>Calcolare la <img alt="Analisi dell'equilibrio statico; simbolo ΣFx=0; illustrazione concettuale; educazione fisica." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> velocità di taglio della parete : <img alt="Simbolo del micrometro al secondo [μm/s] per la misurazione della velocità nelle equazioni scientifiche." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 4,9 x (velocità della linea centrale 8 x x 0,625/diametro del vaso [m]).</li>
		<li>Velocità media del <img alt="Simbolo del micrometro al secondo [μm/s] per la misurazione della velocità nelle equazioni scientifiche." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> flusso sanguigno <img alt="Simbolo del micrometro al secondo [μm/s] per la misurazione della velocità nelle equazioni scientifiche." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> : velocità della linea centrale x 0,625.</li>
		<li>Calcolare il <img alt="Equazione che descrive la misura della velocità in unità di numero al minuto per l'analisi sperimentale dei dati." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> flusso totale di leucociti : <img alt="Misura della concentrazione in unità di numero per microlitro [numero/μL], utilizzata nei calcoli di laboratorio." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> conteggio leucocito sistemico x (velocità <img alt="Simbolo del micrometro al secondo [μm/s] per la misurazione della velocità nelle equazioni scientifiche." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> media <img alt="Formula di calcolo del diametro vascolare, diagramma per la misurazione e l'analisi microvascolare." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> del flusso sanguigno x 60/1000) x x .</li>
		<li>Calcolare la frazione del flusso di rotolamento [%]: flusso di rotolamento/flusso di leucociti ox 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422(2014).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678(2014).</li>
<li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li>
<li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li>
<li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li>
<li>von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avon+Andrian%2C+UH+%22Microcirculation%22">Microcirculation</a>. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).</li>
<li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li>
<li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+%28IRI%29+of+the+rat+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973(2012).</li>
<li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457(2019).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874(2011).</li>
<li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L'obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai parametr...

La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall'adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall'estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,3. L'interazione di diversi siti normativi, fattori di controllo e mediatori della cascata di reclutamento di leucociti come recettore dei prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), del motivo C-X-C ligando (CXCL)1/2 e del loro recettore CXCR2 sono stati scoperti utilizzando IVM4,5,6,7,8,9.
Il metodo di IVM è stato descritto per molti organi e tessuti diversi come l'intestino10, pelle11, linfonodi12, il sacco di tuorlo embrionale13 e altri. Tuttavia, il metodo più studiato di IVM è il modello cremaster, descritto per la prima volta nei ratti14. Mentre ancora utilizzato nei ratti15, il metodo è oggi applicato principalmente nei topi a causa dell'alta abbondanza di diverse linee transgeniche. Il nostro gruppo ha recentemente evidenziato il potenziale ruolo del cremaster IVM nel campo delle muscolopatie infiammatorie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) che studiano topi immdxliti carenti di distrofina16. Grazie alla sua sottile composizione in fibra intrecciata e facilmente accessibile, il muscolo cremante rappresenta il muscolo candidato ideale da studiare come intero supporto utilizzando microscopia leggera o fluorescente. Il reclutamento e l'estravlocazione dei leonici avvengono principalmente in venule post-capillari, che possono essere facilmente identificate su uno strato muscolare continuo nel muscolo cremante.
Il vantaggio dell'imaging in vivo rispetto ad altri saggi in vitro è il suo contesto biologico in un organismo vivente. Allo stesso tempo, delineare contributi specifici per le cellule al reclutamento alterato dei leucociti può richiedere ulteriori modelli in vitro come camere di flusso o saggi endoteliali. La combinazione di più metodi produrrà i dati più convincenti. Gli scienziati dovrebbero essere consapevoli dei limiti del modello cremaster in quanto qualsiasi manipolazione chirurgica porterà ad un aumento del traffico e del reclutamento dei leucociti. Di conseguenza, l'assunzione di base è difficile da stimare con questo metodo. Nonostante la sua ampia applicazione, IVM del cremaster può essere impegnativo e una nuova configurazione può richiedere tempo e risorse per stabilire. Ora forniamo un protocollo facile che aiuterà a evitare alcuni degli errori comuni in IVM. Inoltre, le limitazioni saranno discusse e i metodi gratuiti saranno evidenziati ove applicabile.
IVM del cremaster rappresenta un approccio ideale da attuare nel campo degli studi infiammatori e infettivi. Più specificamente, il modello cremaster può essere di grande interesse per gli scienziati che studiano la biologia muscolare scheletrica nel contesto delle malattie infiammatorie.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN: 08509909</td><td>anestesia. Generico / IUPAC Nome: ketamina</td></tr><tr><td>xilazina</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>Codice articolo: 1205&nbsp;</td><td>anestesia. Nome generico / IUPAC: xilazina (come idrocloruro)</td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>PZN 02737756</td><td>preparazione chirurgica. Generico / IUPAC Nome: cloruro di sodio</td></tr><tr><td>Ago per siringa Omnican F</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>REF 9161502</td><td>preparazione chirurgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Sutura 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>preparazione chirurgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene #10&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>N. fornitore 427401</td><td>preparazione chirurgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene #90&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>N. fornitore 427421</td><td>preparazione chirurgica&nbsp;</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>Numero CAS 989-38-8&nbsp;</td><td>colorazione leucocitaria. Generico / Nome IUPAC: etile 2-[3-(etilammino)-6-etilimmino-2,7-dimetilxantene-9-il]benzoato</td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura per l'installazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td>BX51W1</td><td>microscopia</td></tr><tr><td>obiettivo 40 volte&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Achroplan 40 &times; /0.80 W</td><td>microscopia</td></tr><tr><td>ImSpector software</td><td>Lavision Biotec GmbH</td><td>ver. 4.0.469</td><td>software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, USA</td><td>ver. 1.51j8</td><td>software</td></tr></tbody></table>

infiltrazione leucocita del muscolo cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all'interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l'interazione con l'endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all'interno dell'organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull'attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.
Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.
IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.

IVM in base al protocollo fornito fornirà informazioni uniche sulla cascata di reclutamento di leucociti nel muscolo scheletrico. La sezione dei risultati si concentrerà sui risultati tipici ottenuti da IVM ed evidenzierà i potenziali problemi che possono verificarsi.
La configurazione sperimentale per la microscopia intravitale è descritta nella Figura 1. La preparazione del muscolo cremaster e la rimozione del tessuto connettivo è fondamentale per ottenere immag...

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Questo metodo pratico e riproducibile può essere utilizzato per visualizzare le interazioni con i leucociti dell'endotelio che portano al reclutamento di leucociti all'interno di un topo intatto. Questa tecnica presenta anche un potente strumento per il monitoraggio dei processi fisiologici e fisiopatologici all'interno della cascata di reclutamento dei leucociti in vivo. Il metodo può essere applicato in diversi modelli infiammatori e settici.Ad esempio, abbiamo recentemente evidenziato la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che comportano infiltrazioni esagerate di leucociti muscolari. Il nostro suggerimento ai colleghi scienziati che stanno pensando di utilizzare questa tecnica è di ottenere quanta più esperienza pratica possibile il metodo è molto suscettibile a piccole deviazioni. A dimostrare la procedura sarà Simon Kranig, un clinico e scienziato anziano del mio laboratorio.Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piede nell'animale sperimentale anestetizzato, fissare il mouse in posizione reclinata dorsale su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi e utilizzare una sutura sterile 6-0 non assorbibile per avvolgere un semplice anello intorno ai denti frontali. Rastrettare le estremità di giunzione della sutura sul riscaldante e utilizzare le pinzette per sollevare delicatamente la pelle a metà linea. Successivamente, fare un'incisione circolare da uno a due centimetri di diametro sul collo e sul torace superiore e utilizzare una pinzetta per sezionare attentamente i tessuti muscolari, grassi e connettivi circostanti.Metti una sutura sotto la trachea. Utilizzare piccole forbici chirurgiche per fare un taglio trasversale di circa 1,3 millimetri nella trachea e introdurre un tubo di polietilene nell'estremità caudale della trachea per fissare le vie aeree superiori. Fissare il tubo situato con un'unica sutura a nodo circolare e individuare l'arteria carotide lungo il lato destro della trachea.Sezionare il tessuto circostante dalla parete dell'arteria carotide e passare due pezzi di sutura sotto l'arteria. Legare la prima sutura cranica prossimale alla biforcazione delle arterie carotidi e posizionare la seconda sutura a circa cinque-otto millimetri distale dalla prima sutura senza legare. Successivamente, attaccare un pezzo di tubi di polietilene di 30 centimetri a un ago della siringa da un millilitro riempito con soluzione salina e utilizzare una clip per vasi di sette millimetri per bloccare l'arteria carotide distorsi alla seconda sutura.Effettuare un taglio trasversale di circa 0,5 millimetri nell'arteria carotide e introdurre il tubo sterile in polietilene nell'arteria. Fissare il tubo con la seconda sutura e rimuovere la clip del recipiente. Quindi deprimere delicatamente lo stantuffo della siringa per lavare la soluzione salina nel vaso.Per preparare il muscolo cremastere, trasferire il mouse su un telaio al microscopio in plastica su misura con lo scroto rivolto verso lo stadio del microscopio e afferrare attentamente lo scroto alla sua estremità più distale con una pinzetta. Tirando delicatamente lo scroto, rimuovere una sezione circolare di circa cinque millimetri di diametro della pelle scrotale mantenendo il tessuto aperto ben idratato con soluzione salina. Utilizzare due pinzette per sezionare il tessuto connettivo sciolto e localizzare entrambi i teste.Afferrare un testicolo distally e iniziare delicatamente a estrarre il tessuto riproduttivo rimuovendo i tessuti connettivi circostanti passo dopo passo. Una volta che il testicolo è stato esteriore, fissare l'estremità distale del tessuto all'anello di gomma che circonda il palco e idratare il tessuto con soluzione salina. Quindi, rimuovere con cura il tessuto connettivo senza danneggiare il muscolo cremastere sottostante.È fondamentale rimuovere tutto il tessuto connettivo che si tradurrebbe in immagini sfocate senza danneggiare il muscolo cremastere sottostante. Quando tutto il tessuto è stato rimosso, fare un'incisione trasversale di un millimetro per aprire il muscolo cremastere prima di fare un'incisione longitudinale dall'estremità molto distale all'estremità prossimale del tessuto. Il muscolo dovrebbe aprirsi sfericamente.Stendere con cura il muscolo sul palco di vetro e inchiodare il muscolo all'anello di gomma facendo attenzione a non toccare o danneggiare la regione centrale del tessuto. Quindi fissare il testicolo rimanente di lato per dare accesso alla regione di interesse e idratare il tessuto con PSS. Per la visualizzazione intravitale della vascuola muscolare, posizionare il muscolo cremastere montato nel microscopio verticale e selezionare l'obiettivo 40X.Eseguire le registrazioni sotto superfusione continua con PSS da 35 a 37 gradi Celsius attraverso un pezzo di piccoli tubi che è stato attaccato all'obiettivo verticale del microscopio per consentire il gocciolamento continuo di PSS insieme all'obiettivo verso il basso sul muscolo e sul tessuto. Identificare le venule post-capillari. Misurare il microcircolo su venyole con un diametro da 20 a 40 micrometri.Quindi registrare immagini ad alta risoluzione del microcircolo dal muscolo cremastere per un periodo di 30 secondi regolando continuamente la messa a fuoco a causa di lievi cambiamenti nella contrazione e rilassamento del tessuto muscolare. L'eccesso di tessuto connettivo può portare a immagini microscopiche sfocate. In questa immagine microscopica rappresentativa, le venule post-capillari che dovrebbero avere un diametro compreso tra 20 e 40 micrometri possono essere identificate dalla confluenza di due vasi più piccoli.I leucociti aderenti e rotolanti possono essere visualizzati mentre i leucociti circolanti possono essere tracciati solo nella riproduzione al rallentatore di video registrati. Una moltitudine di parametri può influenzare il reclutamento di leucociti in vivo tra cui l'uscita cardiaca, il diametro del vaso, la velocità dell'uscita centrale, la velocità di taglio delle pareti e il numero di leucociti circolanti. Si noti che la velocità dell'uscita della linea centrale è influenzata dall'uscita cardiaca, dalla resistenza vascolare periferica e dal volume intravasale.Ad esempio, un grande volume di rhodamina o altra sostanza sperimentale somministrata attraverso il catetere carotide aumenta la velocità dell'ala centrale post-capillare e inibisce la cattura e il rotolamento dei leucociti. Al contrario, l'insufficienza cardiaca, l'anestesia profonda o l'ipotermia possono diminuire il flusso post-capillare. Per determinare la velocità della linea centrale, possono essere utilizzati leucociti fluorescenti che circolano liberamente o i leucociti devono essere tinti con reagenti fluorescenti come la rodiammina.Si noti che i ceppi di tipo selvatico possono mostrare una varianza fisiologica. Ad esempio, i topi C57BL/6 dimostrano una laminazione, un'adesione e una trasmigrazione dei leucociti chiaramente migliorate rispetto agli animali C57BL/10ScSn. Le fasi di pianificazione e standardizzazione sono importanti per padroneggiare la tecnica soprattutto durante la preparazione del muscolo cremastere per la microscopia.Altri metodi per visualizzare il reclutamento di leucociti possono essere condotti per fornire ulteriori informazioni e per aiutare a sezionare il contributo individuale dei leucociti e delle cellule endoteliali alla cascata di reclutamento. Questa tecnica fornisce una piattaforma per la valutazione preclinica dei meditatori farmacologici e delle nuove sostanze modulatori immunitarie.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Una preparazione dei tessuti è descritto per la visualizzazione e manipolazione sperimentale del microcircolo viventi. In anestetizzati topi maschi, il sottile, altamente vascolarizzata muscolo cremastere è preparato per la microscopia intravitale per studiare le reti microvascolare tra arteriole, capillari e venule. Questa preparazione è facilmente adattato per ratti e criceti.

La preparazione muscolare mouse Cremaster for Imaging intravitale del microcircolo

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Digital microscopia intravitale epifluorescenza delle venule postcapillari nella microcircolazione cremasterico è un metodo comodo per acquisire conoscenze in...

In tempo reale Imaging digitale di leucociti-endotelio in ischemia-riperfusione (IRI) del muscolo Cremaster Rat

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Microscopia intravitale del microcircolo cremastere topo M. offre un unico e ben standardizzato-modello in vivo per l'analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.

Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l&#39;analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

L'imaging in vivo delle articolazioni è una tecnica preziosa per scoprire il comportamento migratorio dei leucociti e la dinamica molecolare all'interno delle articolazioni infiammate. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging in vivo delle articolazioni utilizzando un modello murino di artrite indotta dal collagene di tipo II (CIA).

In vivo L'imaging rivela il comportamento migratorio dei leucociti all'interno delle articolazioni

Impara la microscopia intravitale per studiare il reclutamento dei leucociti nel muscolo cremaster del topo. Questo metodo riproducibile consente di visualizzare le interazioni leucocito-endotelio in vivo nei modelli infiammatori.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

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