Name: Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante linfezione da virus influenzale A nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Scopri i protocolli per valutare le cellule T helper follicolari e le risposte dei centri germinativi nei topi C57BL/6 durante l'infezione da virus influenzale A. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi immunitari associati alle Tfh.

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Ringraziamo il personale della struttura di citometria a flusso, della struttura ABSL2 e della struttura per animali SPF dell'Institut Pasteur di Shanghai per il loro aiuto tecnico e consulenza. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: Strategic Priority Research Program della Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

A causa di ruoli specializzati nel fornire aiuto alle cellule B per generare anticorpi ad alta affinità, le cellule Tfh sono state ampiamente studiate nei meccanismi di differenziazione e manipolazione per fornire nuove strategie per la progettazione dei vaccini. L'infezione da virus influenzale induce vigorose risposte alle cellule Tfh e GC B, essendo così un modello appropriato per questo campo di ricerca. In questo documento, abbiamo descritto i protocolli di infezione da virus influenzale per inoculazione intranasale...

Nell'ultimo decennio, numerosi studi si sono concentrati sul sottoinsieme di cellule CD4+ T appena identificato, sottoinsieme cellulare Tfh, per i suoi ruoli essenziali nello sviluppo del centro germinale (GC) B. Il linfoma a cellule B 6 (Bcl6), che è principalmente considerato come repressore genico, è il fattore che definisce il lignaggio delle cellule Tfh per la prova che l'espressione ectopica di Bcl6 è sufficiente per guidare la differenziazione Tfh mentre la carenza di Bcl6 si traduce in una differenziazione Tfhscomparsa 1,2,3. A differenza di altri sottoinsiemi di helper CD4+ T che eseguono la loro funzione di effettore tramite migrazione verso i siti di infiammazione, le cellule Tfh forniscono l'aiuto della cellula B principalmente nella zona follicolare delle cellule B di milza e linfonodo. Le molecole co-stimolanti ICOS e CD40L, svolgono un ruolo significativo nell'interazione tra cellule Tfh e GC B. Durante la differenziazione Tfh, L'ICOS trasmette i segnali necessari dalle cellule B affini e agisce anche come recettore che riceve segnali di migrazione da cellule B passanti per la localizzazione della zona cellulare B4,5. CD40L è un mediatore di segnali provenienti dalle cellule Tfh per la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule B6. Un altro fattore che gioca il ruolo simile a CD40L è la citochina IL21, che è principalmente secreta dalle cellule Tfh. IL21 regola direttamente lo sviluppo e la produzione di cellule GC B di anticorpi ad alta affinità, ma il suo ruolo nella differenziazione Tfh èancora controverso 7,8. Pd-1 e CXCR5, che sono ora più frequentemente utilizzati nell'identificazione delle cellule Tfh nell'analisi della citometria del flusso, svolgono anche ruoli significativi nella differenziazione e nella funzione di questo sottoinsieme. CXCR5 è il recettore della chemiochina follicolare cellulare B e media la localizzazione delle cellule Tfh nei follicoli cellulari B9. Pd-1 è ora identificato non solo per avere la funzione di guida follicolare, ma anche trasmettere segnali critici nel processo di maturazione dell'affinità delle cellule GC B10. Sulla base di questi risultati, valutare l'espressione di queste molecole potrebbe fondamentalmente riflettere la maturazione e la funzione delle cellule Tfh.
Il GC è una struttura microanatomica transitoria indotta negli organi linfoidi secondari e altamente dipendente dalle cellule Tfh, essendo così una lettura perfetta per valutare la risposta di Tfh. In GC, dopo aver ricevuto segnali mediati da citochine e molecole co-stimolanti, le cellule B sono soggette a commutazione di classe e ipermutazione somatica per generare anticorpi adalta affinità 11. La commutazione differenziale della classe di anticorpi avviene nella nicchia differenziale della citochina, in cui IL4 e IL21 inducono la commutazione di classe IgG1 mentre IFNγ induce la commutazione di classe IgG212. Le cellule plasmatiche sono i produttori di anticorpi secreti e sono cellule differenziate terminalemente. Come le cellule Tfh, lo sviluppo di cellule B in GC è associato all'espressione dinamica di molte molecole significative. Sulla base dello studio attuale, le cellule GC B possono essere identificate come cellule B220+PNA+Fas+ o B220+GL7+Fas+ e cellule plasmatiche, rispetto ai loro precursori, espressione di downregolato di B220 e upregolazione espressione CD13813. Inoltre, entrambe queste caratteristiche possono essere rilevate nella citometria del flusso e nell'analisi dell'immunofluorescenza, essendo quindi un'adeguata valutazione della risposta gc.
Risposte cellulari e umoriali robuste sono indotte nell'infezione da virus influenzale, con cellule Tfh e Th1 che dominano la risposta cellulare CD4+ T14, il che lo rende un modello perfetto per lo studio di differenziazione delle cellule Tfh. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), che è un ceppo comunemente usato adattato al topo, è frequentemente usato in questostudio 14,15,16. Qui descriviamo alcuni protocolli di base del saggio Tfh rilevante per lo studio nell'infezione da virus influenzale: 1) inoculazione intranasale del virus PR8; 2) cellule Tfh specifiche dell'antigene, cellule GC B e plasma e rilevamento IL21 con citometria a flusso; 3) visualizzazione istologica del GC; 4) rilevazione di formicolio anticorpale specifico dell'antigene nel siero con ELISA. Questi protocolli forniscono le tecniche necessarie per i nuovi ricercatori nello studio associato a Tfh.

<table><tbody><tr><td>Immunocolorazione delle cellule Tfh, delle cellule Tfh NP-specifiche e della formaldeide Bcl-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% Sigma</td><td></td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC classe II tetramero</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>clone:7D1</td></tr><tr><td>Biotina-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>clone: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>clone:GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>clone:IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>clone:IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>clone:MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>clone:7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>clone:29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptavidin BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione intracellulare di IL21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>umano FCc IL-21 recettore</td><td>R & Kit di colorazione per cellule morte Aqua Dead Cell del sistema D System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Fixable Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC Colorazione B e plasmacelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>clone:RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>clone:281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>clone:Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>clone:11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Dosaggio del titolo anticorpale specifico per HA con ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ig anti-topo di capra (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti-topo di capra (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti topo IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti topo IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti topo IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrato Reagente</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Istologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Goat-anti ratto IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotinilato PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>diluito Alexa Fluor 488-streptavidina</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>siero di capra normale</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento oro pro-lungo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>Kit di blocco STREPTAVIDINA/BIOTINA</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione delle cellule di aiuto follicolare t e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale a nei topi

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

Le cellule T Follicular Helper (Tfh) sono un sottoinsieme indipendente di cellule CD4+ T specializzato nel fornire aiuto per lo sviluppo del centro germinale (GC) e la generazione di anticorpi ad alta affinità. Nell'infezione da virus influenzale, le risposte robuste delle cellule Tfh e GC B sono indotte a facilitare un'efficace eradicazione del virus, che conferisce un modello di topo qualificato per lo studio associato a Tfh. In questo documento, abbiamo descritto i protocolli nel rilevamento della risposta immunitaria associata a Tfh di base durante l'infezione da virus influenzale nei topi. Questi protocolli includono: inoculazione intranasale del virus influenzale; colorazione citometrica a flusso e analisi di cellule Tfh policlonali e antigene specifiche, cellule GC B e cellule plasmatiche; individuazione dell'immunofluorescenza dei TC; saggio immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) dell'anticorpo specifico del virus influenzale nel siero. Questi test quantificano fondamentalmente la differenziazione e la funzione delle cellule Tfh nell'infezione da virus influenzale, fornendo così aiuto per studi nel meccanismo di differenziazione e nella strategia di manipolazione.

Caratterizzazione della morbilità del topo nell'infezione da virus influenzale Dopo l'infezione da virus influenzale, i topi sono meno attivi e anoressici a causa di una malattia, che si riflette in una grave perdita di peso, un sintomo comunemente usato per monitorare la morbilità deltopo 19. Come mostrato nella figura 1a, i topi infetti da virus PR8 hanno iniziato a perdere peso il giorno 6, hanno raggiunto il livello di perdita...

Questo documento descrive i protocolli di valutazione della risposta Tfh e GC B nel modello di topo di infezione da virus influenzale.

Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Le cellule T helper follicolari sono un sottoinsieme di cellule T CD4 recentemente identificate che forniscono aiuto alle cellule B nella produzione animale ad alta affinità. Dimostrare l'identificazione delle cellule Tfh in un'infezione da virus influenzale aiuterà i nuovi ricercatori a capire come eseguire le tecniche necessarie per gli studi associati a Tfh. Poiché un titolo virale inappropriato può causare mortalità o una risposta immunitaria troppo debole, si consiglia di determinare il titolo prima di eseguire un esperimento.Per l'inoculazione del virus PR8 di topi maschi C57 neri 6 di otto settimane. In condizioni di biosicurezza di livello 2, scongelare una quantità di virus PR8 conservata a meno 80 gradi Celsius su ghiaccio. Agitare il virus per ottenere una soluzione omogenea.Diluire il virus a due unità di piattaforma per microlitro di PBS in una provetta pre-raffreddata da 1,5 millilitri e confermare una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita negli animali anestetizzati. Agita di nuovo il virus. Caricare un puntale per pipetta da 20 microlitri con 10 microlitri di virus.Aggiungere con cura gocce di virus in una narice di un massimo di tre animali sedati prima di ripetere l'inoculazione sull'altro lato. Quindi, metti tutti i topi in decubito sternale in gabbie calde monitorate fino al completo recupero e pesa ogni topo ogni giorno per 10 giorni. Alla fine dell'esperimento, posizionare i topi in una cappa a flusso laminare di livello 2 di biosicurezza e fissare il primo animale a una tavola di dissezione in schiuma assorbente ricoperta di carta.Usa le forbici da dissezione per tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale, allungando la pelle con una pinzetta e fissando la pelle alla tavola di dissezione. Aprire il peritoneo per raccogliere la milza e posizionare la milza in un filtro da 70 micrometri con una piastra da 6 centimetri contenente 5 millilitri di DMEM integrato con l'1% di FBS. Dividere il diaframma e le costole fino al timo e fissare la costola lateralmente per esporre la cavità toracica.Muovi il polmone e il cuore per localizzare il linfonodo mediastinico vicino al lato ventrale della trachea. Quindi, posizionare il linfonodo nel proprio colino in un secondo piatto da 6 centimetri contenente 5 millilitri di terreno e utilizzare stantuffi a siringa da 3 millilitri per schiacciare delicatamente entrambi i tessuti attraverso la rete di entrambi i filtri. Sciacquare ogni filtro con 1 millilitro di DMEM fresco più FBS e trasferire le sospensioni cellulari in singole provette da centrifuga da 15 millilitri.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere accuratamente i pellet in 1 millilitro di DMEM fresco più FBS per provetta. Quindi aggiungere altri quattro millilitri di terreno alla sospensione cellulare della milza e posizionare entrambe le provette sul ghiaccio. Per colorare le cellule per l'espressione di CXCR5, capovolgere la provetta più volte per mescolare e trasferire 2 volte 10 alle 6 cellule per campione in singole provette FACS.Aggiungere 2 millilitri di tampone di colorazione a ciascuna provetta e mescolare le cellule mediante vortex. Pellettare le celle mediante centrifugazione e scartare i surnatanti. Picchiettare delicatamente due volte su un tubo di carta assorbente e muovere delicatamente i due fondi per risospendere le cellule nel surnatante residuo.Bloccare il legame aspecifico con 0,2 microlitri di blocco del recettore Fc per provetta e muovere delicatamente la provetta per mescolarla prima di metterla sul ghiaccio per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 0,3 microlitri di biotina anti-topo CXCR5 a ciascuna provetta e mescolare con un leggero colpo. Mettere i tubi sul ghiaccio per un'ora con un leggero movimento a 30 minuti.Al termine dell'incubazione, aggiungere 2 millilitri di tampone colorante alle provette e frullare a vortice prima di sedimentare le cellule per centrifugazione. Scartare il surnatante e premere per risospendere le cellule nel tampone residuo. Quindi, posizionare le provette sul ghiaccio ed etichettare le cellule con gli anticorpi contro il marcatore di superficie di interesse, come indicato nella tabella come appena dimostrato.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con 2 millilitri di tampone di colorazione e risospendere ogni pellet in 400 microlitri di tampone di colorazione fresco per l'analisi mediante citometria a flusso. I topi infettati dal virus PR8 iniziano a perdere peso il sesto giorno, raggiungendo la perdita più alta l'ottavo giorno e tornando ai livelli di peso iniziali il decimo giorno. Come previsto, la perdita di peso non è stata osservata nei topi di controllo trattati con PBS.L'infezione virale porta anche a una robusta espansione dei linfociti all'interno del linfonodo drenante. Come osservato dall'analisi citofluorimetrica, la differenziazione delle cellule helper follicolari T si inizializza al quinto giorno e raggiunge il picco al giorno 10 dopo l'infezione con un numero robusto di cellule helper follicolari T indotte nei topi infetti dal virus dell'influenza rispetto agli animali di controllo. Inoltre, sia nei linfonodi mediastinici che nella milza, il numero di cellule T CD4-positive antigene specifico dell'influenza è indotto in modo significativo rispetto a quelli osservati nei topi di controllo con popolazioni aumentate di cellule CXCR5-positive PD-1 negli animali PR8.Inoltre, la colorazione intracellulare per IL-21 rivela che l'infezione da PR8 induce una produzione significativamente più elevata di questa citochina in risposta all'infezione virale. La colorazione immunofluorescente indica la presenza di una reazione indotta al centro germinale nei topi infetti da PR8 e l'ELISA dimostra la generazione di anticorpi specifici per il virus dell'influenza negli animali infetti dal virus. È importante eseguire la colorazione CXCR5 su ghiaccio per un'ora, poiché la qualità della macchia sarà influenzata dalla temperatura di colorazione e dal tempo.Sebbene sia stata dimostrata la colorazione con CXR5 e IL-21, altri marcatori di superficie, fattori di trascrizione e citochine possono essere valutati con questo metodo per fornire moltitudini sulla differenziazione e la funzione di Tfh.

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Immunologia e Infezioni

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Due metodi basati sulla citometria a flusso, un test di priming delle cellule T in vitro e la colorazione intracellulare delle citochine, sono stati utilizzati per misurare la capacità di presentazione dell'antigene delle cellule dendritiche e le risposte delle cellule T antigene-specifiche a un'infezione mutante del virus del Nilo occidentale nei topi.

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C'è una generale mancanza di conoscenza su come funzionano i vaccini. Qui proponiamo l'uso combinato della genetica inversa e dei topi chimerici del midollo osseo per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie precoci dell'ospite ai vaccini, con particolare attenzione alle cellule dendritiche e all'immunità delle cellule T.

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Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

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Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.

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Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante linfezione da virus influenzale A nei topi (Video) | JoVE Journal

Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi

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