Studio della breve pubblicità peptide sulla soluzione Dispersi Nanoparticelle inorganiche
11 aprile 2020
Il primo passo nella comprensione dell'interazione tra biomolecola e fase solida inorganica sta rivelando costanti fisico che possono essere valutate stabilendo isotermim di adsorbidimento. L'assorbemento dalla fase liquida è limitato da cinetica, capacità superficiale, pH e adsorbimento competitivo, che tutti dovrebbero essere considerati con cautela prima di impostare un esperimento di adsorbimento.
L'interazione di proteine e peptidi con materiale inorganico è un fenomeno fondamentale con implicazioni per la nanotecnologia, i biomateriali e la biotecnologia. Il primo passo nella comprensione di tale fenomeno è rivelare le costanti fisico-chimiche fondamentali come la costante di adsorbimento, l'energia libera di Gibbs, l'entalpia, l'entropia e l'adsorbimento limitato che possono essere valutate stabilendo isoterme di adsorbimento. Tuttavia, l'adsorbimento dalla fase liquida è limitato con cinetica, capacità superficiale, pH e adsorbimento comparativo che tutti dovrebbero essere consapevolmente considerati prima di impostare l'esperimento.
In questo video, i miei colleghi Elena Korina e Sergei Neifert presenteranno lo studio fisico-chimico dell'adsorbimento del dipeptide sulla soluzione disperde il biossido di titanio coprendo le caratteristiche di preparazione che aiuteranno a evitare rischi nascosti che i ricercatori possono affrontare durante l'esecuzione di esperimenti pertinenti. Posizionare 183 milligrammi di dipeptide nella provetta polimerica sterile e diluire fino a circa 35 millilitri con acqua distillata doppia e sciogliere a temperatura ambiente sotto agitazione vigorosa. Se il dipeptide non si dissolve in acqua distillata doppia e mescolando, posizionare la soluzione dipeptide nel bagno ad ultrasuoni e sonicare per alcuni minuti.
Regolare il pH della soluzione pre-disciolta di un peptide a 7,4 aggiungendo cautamente la soluzione di MES o idrossido di sodio alla soluzione dipeptide mescolando a temperatura ambiente e monitorando il pH con un pHmetro. Dopo aver regolato il pH, versare la soluzione nel cilindro di misura. Risciacquare la provetta e riempire il cilindro di misura con la doppia acqua distillata fino a 40 millilitri per ottenere la concentrazione finale di 16 millimolare.
Preparare diluizioni dipeptide con concentrazioni tra 0,4 e 12 millimolari diluire la soluzione di dipeptide millimolare con acqua distillata doppia. Ad esempio, per preparare otto soluzioni di dipeptide millimolare, aggiungere sette millilitri di acqua distillata doppia a 10 millilitri di soluzione di dipeptide millimolare. Dopo la diluizione, regolare il pH a 7,4 aggiungendo la soluzione per via goccia di MES o idrossido di sodio alla soluzione dipeptide.
Dopo aver regolato il pH, versare la soluzione nel cilindro di misura. Risciacquare la provetta e riempire il cilindro di misura fino a 20 millilitri con acqua distillata doppia per fare una concentrazione di otto millimolare. Di conseguenza vengono preparate altre diluizioni della soluzione di dipeptide stock.
Alla fine, otteniamo una fila di diluizioni dipeptide pronte per gli studi di adsorbimento. Preparare una soluzione tampone MES da 10 millimolare. Regolare il pH a 7,4 con idrossido di trisodio mescolando e monitorando il pH con un misuratore di pH.
Questa soluzione verrà utilizzata per l'unica preparazione. Macinare circa 200 milligrammi di ossido di titanio nanocristallino in una malta per almeno cinque minuti. Pesare 40 milligrammi di nanoparticelle di biossido di titanio.
Mettere il pallone nel bagno di sonicazione utilizzando il supporto di laboratorio. Aggiungere il biossido di titanio macinato in 20 millilitri di buffer MES nel pallone utilizzando l'imbuto di vetro e sonicare in un bagno ad ultrasuoni per 20 minuti. Impostare il termostato alla temperatura desiderata.
Aggiungere un millilitro della suola sonicata di biossido di titanio alle fiale di adsorbimento marcate. Posizionare i flaconcini di adsorbimento marcati contro le corrispondenti diluizioni in un dispositivo galleggiante improvvisato fatto di polistirolo e metterlo nel termostato per equilibrare la temperatura per almeno cinque minuti. Successivamente, aggiungere un millilitro di diluizione del dipeptide al flaconcino di adsorbimento marcato corrispondente assicurandosi che tutte le soluzioni di miscelazione abbiano la stessa temperatura.
Mantenere la serie di campioni di adsorbimento ottenuti sul termostato per 24 ore per raggiungere l'equilibrio di adsorbimento. Occasionalmente agitare le dispersioni di ossido di titanio durante il termostato. Per evitare il nuovo equilibrio indotto dalla temperatura, eserti un campione dal termostato per la filtrazione alla volta.
Preleva un campione della soluzione dipeptide da ogni flaconcino di vetro con una siringa. Rimuovere l'ago dalla siringa e mettere il filtro siringa per filtrare la soluzione dipeptide nel flaconcino di vetro. Ripetere la filtrazione con campioni di altre concentrazioni.
Ora questi campioni sono pronti per l'analisi. Preparare la soluzione da 50 millilitri di TFA in acetonitrile. Punte 0,34 millilitri di TFA nel cilindro di misura e regolare il volume della soluzione a 50 millilitri con acetonitrile a temperatura ambiente.
Preparare la soluzione di derivazione. Punte 299 microlitri di feniletiocianato e 347 microlitrieri di trietilammina nel cilindro di misura e riempire il cilindro fino a 50 millilitri con acetonitrile. Prima dell'analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni, denominare i campioni con i reagenti di Edman nelle fiale cromatografiche.
Mescolare i 400 microlitri del campione con 400 microlitri di reagente di derivazione. Conservare i campioni a 60 gradi per 15 minuti. Dopo il riscaldamento, neutralizzare i campioni con 225 microlitri di soluzione di TFA e attendere alcuni minuti per raffreddare il campione a temperatura ambiente.
Utilizzare l'analisi HPLC per determinare la concentrazione della soluzione dipeptide prima e dopo l'adsorbimento. Avviare l'analisi dei campioni con le condizioni necessarie impostate dal software. Le dipendenze dell'adsorbimento dalla concentrazione del dipeptide di equilibrio dopo l'adsorbimento, gli isotermi di adsorbimento sono state tracciate di conseguenza in base ai dati sperimentali ottenuti.
Le misurazioni dell'adsorbimento del dipeptide sono stati dati elaborati utilizzando il modello Henry. La costante di legame di equilibrio è stata ottenuta dalla pendenza della dipendenza dell'adsorbimento del dipeptide dalla concentrazione di equilibrio del dipeptide. L'equazione di van't Hoff è stata usata per determinare l'energia libera standard di Gibbs per ogni temperatura.
Tracciati in un grafico dell'energia libera rispetto alla temperatura, abbiamo determinato l'entalpia come intercettazione del grafo lineare con un asse di energia libera per il dipeptide. Il cambiamento di entropia per ogni temperatura è stato determinato dall'equazione fondamentale. I valori calcolati della costante di legame di equilibrio, dell'energia libera standard di Gibbs, dell'entalpia e dell'entropia per il dipeptide sono presentati nella tabella uno.
La costruzione dell'isoterma di adsorbimento dai dati di esaurimento rimane quella più disponibile che non richiede configurazioni costose, fornendo dati fisico-chimici esaustivi per letteralmente ogni sorbato solubile. Combinato con dati spettroscopici o computerizzati, può rivelare caratteristiche strutturali fondamentali del comportamento complesso delle biomolecole al contatto con le nanoparticelle inorganiche.
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Panoramica
Questo studio esplora l'interazione tra dipeptidi e materiali inorganici, in particolare il biossido di titanio. Comprendere le costanti fisico-chimiche fondamentali è fondamentale per ottimizzare gli esperimenti di adsorbimento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biomateriali
- Nanotecnologia
- Biotecnologia
Sfondo
- Le proteine e i peptidi interagiscono con materiali inorganici.
- Le costanti di adsorbimento e i parametri termodinamici sono essenziali per comprendere queste interazioni.
- Fattori come la cinetica, la capacità superficiale e il pH influenzano l'adsorbimento dalla fase liquida.
- È necessaria una preparazione accurata per evitare trappole sperimentali.
Scopo dello studio
- Valutare l'adsorbimento di dipeptidi sul biossido di titanio.
- Stabilire isoterme di adsorbimento e determinare le principali costanti fisico-chimiche.
- Fornire indicazioni per l'allestimento sperimentale al fine di ridurre al minimo i rischi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una soluzione di dipeptide in provette sterili polimeriche.
- Diluizione del dipeptide con acqua doppio-distillata.
- Utilizzo di un bagno ad ultrasuoni per la dissoluzione, se necessario.
- Stabilimento di isoterme di adsorbimento per l'analisi.
Risultati principali
- Preparazione corretta di soluzioni di dipeptidi.
- Identificazione dei fattori chiave che influenzano l'adsorbimento.
- Conoscenze sui parametri termodinamici dell'adsorbimento.
- Raccomandazioni per la progettazione sperimentale al fine di evitare problemi comuni.
Conclusioni
- Lo studio migliora la comprensione delle interazioni tra biomolecole e sostanze inorganiche.
- Fornisce un quadro di riferimento per future ricerche nel campo della nanotecnologia e dei biomateriali.
- Una preparazione adeguata e la considerazione delle variabili sono fondamentali per esperimenti di successo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere l'adsorbimento di peptidi su nanoparticelle inorganiche è fondamentale per progettare biointerfacci stabili nelle piattaforme di somministrazione di farmaci e diagnostica. Il metodo di deplezione offre un approccio accessibile per quantificare la termodinamica dell'adsorbimento, consentendo una riduzione dei rischi meccanicistici delle interazioni tra nanoparticelle e biomolecole già nelle fasi iniziali della scoperta. Ciò supporta una maggiore affidabilità predittiva nello sviluppo delle formulazioni, rivelando affinità di legame e fattori termodinamici determinanti, senza richiedere strumentazione specializzata.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della termodinamica del legame tra peptidi e nanoparticelle per convalidare ipotesi sulle interazioni superficiali.
- Valore operativo: Utilizza attrezzature di laboratorio facilmente disponibili per generare isoterme di adsorbimento per lo screening di peptidi promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi di esaurimento per valutare l'affinità e la capacità di legame tra diverse varianti peptidiche.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi attraverso protocolli controllati di pH, temperatura e tempo di equilibrazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce parametri termodinamici (ΔG, ΔH, ΔS) per informare le previsioni di stabilità dei coniugati peptidici con nanoparticelle in condizioni fisiologiche.
- Valore operativo: Consente decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio quantificando la reversibilità dell'adsorbimento e la forza di legame.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui i candidati peptidici vengono valutati per la compatibilità con nanoparticelle prima di strategie di coniugazione o incapsulamento.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di adsorbimento peptidico mediati dalla superficie attraverso la modellizzazione delle isoterme.
- Screening: Fornisce output quantitativi riproducibili (adsorbimento rispetto alla concentrazione) per la valutazione comparativa di librerie peptidiche.
- Analisi: Permette l'estrazione di costanti di legame e profili termodinamici mediante il modello di Henry e l'analisi di van't Hoff.
- Ricerca Translazionale: Collega i dati di legame molecolare alle previsioni di stabilità delle formulazioni solo quando supportato da parametri derivati dalla fonte.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di caratterizzazione fisico-chimica per svariati sistemi peptidi-nanoparticelle.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle interazioni dei biomateriali mediante la misurazione diretta dell'energetica di adsorbimento.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità grazie a passaggi controllati di equilibrazione per esaurimento e filtrazione.
- Valore strategico: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione dello sviluppo in base alla compatibilità tra peptidi e nanoparticelle, riducendo il rischio di fallimento formulativo in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati peptidici in base alla termodinamica quantificata del legame, adeguata al rischio.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei peptidi, nel controllo del pH e nella stabilità della dispersione delle nanoparticelle.
- Presuppone l'accesso a strumentazione per la sonificazione, incubatori termostatici e sistemi HPLC per la quantificazione.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi dei tempi di equilibrazione dell'adsorbimento e dei protocolli di filtrazione.
- Deve tenere conto dell'aggregazione delle nanoparticelle, della distribuzione dimensionale e degli stati di carica dei peptidi dipendenti dal pH.
- È limitato dai tempi di equilibrazione più lunghi richiesti per gli assorbenti ad alta area superficiale e dagli effetti potenziali di adsorbimento competitivo.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:58
Preparation of 16 mM Dipeptide Stock Solution
2:18
Preparation of Peptide Dilutions
3:25
Preparation of Titania Sole
4:26
Mixing and Thermostating
5:32
Filtration of Thermostated Samples
6:10
Preparation of Derivatization Solutions
6:58
Derivatization
7:37
HPLC Analysis
7:58
Results
9:05
Conclusion
