Quantificazione dell'adesione delle cellule tumorali nelle Criosezioni del linfonodo

I siti più frequenti per la metastasi sono i linfonodi originali. Le somatidi possono essere utilizzate per rilevare l'affinità adesiva tra le sezioni linfonodo delle cellule tumorali in vitro. Un vantaggio di questa tecnica è che le sezioni dei linfonodi freschi forniscono una complessità naturale del tessuto originale, che non sarebbe possibile ricreare usando proteine purificate.

Questo metodo potrebbe essere utile per studi di oncologia molecolare che cercano di identificare geni o terapie che interferiscono con l'adesione delle cellule tumorali agli organi bersaglio metastatici, come i linfonodi. Per raccogliere i linfonodi entro trenta minuti dal sacrificio, posizionare il ratto Wistar adulto in recumbency dorsale su una tavola di dissezione pulita a temperatura ambiente e spruzzare la pelliccia con alcol isopropile al 70%. Utilizzando strumenti sterilizzati, sollevare la pelle addominale e fare un'incisione mediale della pelle per esporre i visceri addominali.

Estrarre l'intestino fino a quando i linfonodi toracici e addominali diventano visibili. Utilizzando forbici a punta smussata, asportare accuratamente i linfonodi senza danneggiare l'arteria mesenterica superiore sottostante e posizionare il linfonodo in un tubo da 15 ml contenente 5 ml di PBS sterile. Quando tutti i linfonodi sono stati raccolti, posizionare un linfonodo per cryomold a faccia in giù sulla base di ogni stampo e aggiungere un mezzo di temperatura di taglio ottimale sufficiente per coprire i tessuti.

Dopo il congelamento a scatto, utilizzare un criostato per acquisire sezioni spesse da 5 a 8 micrometri a 22 gradi Celsius e raccogliere le sezioni su vetrini al microscopio. Le criosezioni di buona qualità da fette consecutive dello stesso linfonodo sono fondamentali per ridurre al minimo le differenze tra le fette e facilitare tassi di adesione cellulare coerenti. Per l'etichettatura delle cellule tumorali, raccogliere le cellule di interesse da una coltura cellulare opportunamente messa in scena e sospendere le cellule a 1 x 10 alle 6 cellule per concentrazione di mL e mezzo privo di siero.

Trasferire 1 ml di cellule in un nuovo tubo conico da 15 ml ed etichettare le cellule con 2 microgrammi per mL DiI(C18) per dieci minuti a 37 gradi Celsius, con agitazione delicata a cinque minuti per evitare la sedimentazione cellulare. Al termine dell'incubazione, pelletare le cellule per centrifugazione e lavare le cellule etichettate due volte con 10 mL di mezzo fresco privo di siero per rimuovere qualsiasi colorante in eccesso. Dopo il secondo lavaggio, sospendere nuovamente le cellule a 1 x 10 fino alle 6 cellule per mL di mezzo privo di siero, integrato con una concentrazione di albumina sierice bovina dello 0,1%.

Procedendo delle cellule tumorali etichettate sulle sezioni del tessuto dei linfonodi raccolte, lavare delicatamente le sezioni due volte in PBS, seguite da reidratazione in PBS fresco per quindici minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, bloccare qualsiasi legame non specifico con albumina siere bovina al 2,5% per trenta minuti a 37 gradi Celsius, prima di utilizzare un batuffolo di cotone per asciugare gli scivoli. Utilizzare una penna idrofobica per disegnare una barriera intorno a ogni sezione e aggiungere 100 microlitri di cellule etichettate su ogni linfonodo circondato.

Dopo una o due ore a 37 gradi Celsius in una camera umidificata, rimuovere eventuali celle di non aderenza con quattro lavaggi delicati in PBS e fissare le restanti cellule di fluorescenza aderenti con formaldeide al 3,7% in PBS per quindici minuti a temperatura ambiente. Per la quantificazione dell'indice adesivo, utilizzare l'obiettivo 10x su un microscopio a fluorescenza per ottenere singole immagini TIFF di ogni sezione nei campi fluorescenti luminosi e rossi. Quindi, denomina e salva le immagini in modo sistematico prima di aprire le immagini nelle Fiji.

Dopo aver impostando la scala, utilizzate lo strumento poligonale per selezionare l'area di interesse da quantificare. Selezionare questa opzione per quantificare l'area del linfonodo. I dati saranno espressi in millimetri quadrati.

Quindi, selezionare Plugin, Analizza, Contatore celle e fare clic sulla foto da quantificare. Fare clic su Inizializza e selezionare Tipo contatore. Quindi, fai clic sulle celle nella foto.

L'indice di adesione del linfonodo sarà espresso come il numero di cellule tumorali aderenti per area coperta da linfonodi. Per inizializzare la foto successiva, apri la foto successiva e ripeti la quantificazione come dimostrato. Come osservato, la morfologia delle cellule aderenti è di forma arrotondata e le cellule sono eterogeneamente disperse in tutto il linfonodo di interesse.

L'indice di adesione dei linfonodi è da due a tre volte superiore nelle linee cellulari negative del cancro al seno NDRG4, rispetto a quello misurato per le corrispondenti cellule positive NDRG4. Questa procedura può essere adattata per aiutare i tassi di adesione in altri tessuti bersaglio metastatici, come cervello o polmoni, per valutare i siti preferenziali secondari di adesione per le cellule tumorali inseminate. Ricorda che sia i tessuti freschi che i tessuti congelati dovrebbero essere considerati pericolosi per il rischio biologico e devono essere maneggiati con adeguate precauzioni di biosicurezza.