Identificazione di nuovi regolatori della traspirazione vegetale mediante screening termico su larga scala in Helianthus Annuus

Questo protocollo utilizza la termografia per identificare nuovi composti in grado di regolare la traspirazione delle piante. Questa tecnica è versatile per quanto riguarda le specie vegetali che possono essere testate, la natura del composto e il tipo di imaging. Per impostare le piante per la coltivazione, aggiungere prima uno strato di vermiculite fine dello spessore di quattro centimetri ai vassoi di piante standard da 10 per 20 pollici senza fori e posizionare i portapei a due centimetri di distanza nei vassoi.

Riempire i portasementi con vermiculite e posizionare un seme di girasole puntato verso il basso in ogni supporto in modo che metà del seme rimanga esposto. Quando tutti i semi sono stati placcati, coprili con altri due centimetri di vermiculite fine e nebbia con acqua dall'alto. Dopo un'ora, coprire i vassoi con coperchi e posizionare le piante in una camera di crescita in una serra.

Per impostare il sistema idroponico, riempire un contenitore di dimensioni adeguate adatto alla coltivazione idroponica delle piante con acqua distillata e aggiungere fertilizzante idroponico generale come indicato dal produttore. Quindi utilizzare pompe aria e acqua per aerare la soluzione idroponica risultante con movimento costante. Per preparare i galleggianti idroponici, tagliare un foglio di schiuma di polistirolo espanso spessa due centimetri alle dimensioni del contenitore e utilizzare lo strumento di combustione del legno per creare fori di diametro da uno a due centimetri nella schiuma.

Quindi posizionare i galleggianti nel sistema idroponica. Cinque giorni dopo la semina, estrarre delicatamente le piantine dalla vermiculite. Posizionare immediatamente le piantine in un contenitore d'acqua per 30 minuti per rimuovere la vermiculite in eccesso e ammorbidire i pericarpi rimanenti.

Quando le radici primarie emergenti sono visibili, rimuovere i pericarpi a mano se necessario. Trasferire le piantine all'interno dei portasementi nei galleggianti in schiuma di polistirolo preparati nel sistema idroponico. Far crescere le piante in idroponica per due giorni.

Lasciare che le sostanze chimiche della piccola libreria composta si scongelno a temperatura ambiente. Etichettare sei microtubi a due millilitri senza cappuccio per il trattamento di controllo negativo, tre tubi per il trattamento ABA e gli ultimi 60 tubi per l'analisi degli effetti delle 20 sostanze chimiche di interesse per il triplicato. Aggiungere 10 microlitri di ciascuna sostanza chimica in ciascuna provetta, 10 microlitri di 10 millimolare ABA e solfossido di dimetile nei tre tubi ABA e 10 microlitri di solfossido di dimetile nei sei tubi di controllo.

Quindi mescolare con cura 990 microlitri di idrossido di potassio MES da 10 millimolare in ogni tubo. Posizionare i tubi in un rack di tubi con il controllo positivo e negativo e tubi sperimentali distribuiti uniformemente all'interno del rack per tenere conto della distorsione correlata alla posizione. Per configurare la termocamera, montare prima la fotocamera su un supporto per copia e collegare tutti i cavi a un laptop.

Accendere la fotocamera prima di accendere il laptop e aprire il software di analisi della termografia. Per regolare i parametri di registrazione, capondere il mouse sul pulsante Registra per consentire la selezione dell'icona chiave inglese in Impostazioni record e selezionare la modalità e le opzioni di record appropriate. Per il trattamento delle piantine, sollevare con cura il portasementi e immergere rapidamente la radice nel piatto poco profondo contenente acqua.

Tagliare la radice primaria di ogni piantina sott'acqua da 0,8 a un centimetro sotto l'estremità più basale del portasementi per prevenire la capitazione e inserire la pianta appena tagliata in un unico tubo di sostanze chimiche. Una volta trasferite tutte le piantine, posizionare le piante sotto la termocamera e confermare che tutte le piante si trovano all'interno del campo visivo della telecamera. Per mettere a fuoco la fotocamera sulla superficie dei cotyledon, premete Ctrl Alt A e fate clic su Registra filmato .

Si aprirà una nuova finestra che conferma la registrazione. Dopo una o due ore, interrompere la registrazione. Per l'analisi dei dati, aprite i file seq corretti e sospendete il filmato.

Fare clic sull'icona aggiungi un cursore di misura di interesse tre per tre pixel e spostare il mouse al centro di un cotiledone della prima pianta. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'immagine per etichettare il cotiledone. Etichettare il secondo cotiledone del primo impianto allo stesso modo.

Quando tutte le piante sono state etichettate con due cursori, fare clic sull'icona modifica aree di interesse e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Hold e scorrere per selezionare tutte le aree di interesse. Quindi, rotolare il mouse sull'icona del visualizzatore statistico e selezionare il plottaggio temporale. Si aprirà una nuova finestra.

Esegui il filmato, un grafico si riempirà con i dati. Quindi nella finestra del grafico fare clic sulla doppia freccia per aprire un nuovo menu e fare clic sull'icona salva per salvare i dati. L'uso della tintura rossa erytrosina B dimostra la capacità delle sostanze chimiche di essere visibilmente assorbite attraverso una radice tagliata nei cotyledon di una piantina di girasole entro 10 minuti.

Quando le piante vengono trattate con ABA, viene rilevato un aumento della temperatura delle foglie nei cotyledon di girasole entro 30 minuti che è associato alla diminuzione dell'apertura stomatale e alla conduttanza stomatale. Inoltre, si osserva un aumento della temperatura fogliare 15 minuti dopo il trattamento con ABA micromolare e 20 minuti dopo il trattamento con cinque ABA micromolare che dimostrano che la misurazione della temperatura fogliare mediante imaging termico è un buon proxy per misurare l'apertura stomatale e la conduttanza. In questo esperimento rappresentativo, un trattamento statistico standard basato sul punteggio consente l'identificazione di sostanze chimiche che promuovono la chiusura o l'apertura stomatale.

Per misurare gli effetti dei composti sulla traspirazione, è importante coltivare piante in condizioni ottimali di luce, umidità e temperatura. Questo protocollo può essere applicato alla maggior parte dei dicot. Può anche essere utilizzato per valutare l'effetto di nuovi composti sulle prestazioni fotosintetiche, ad esempio misurando la fluorescenza della clorofilla.