Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

La maggior parte delle ricerche con liposomi si basa su tecniche audaci che assumono intrinsecamente tutti i liposomi come identici. Studiando singoli liposomi, si possono osservare disomogeneità significative. La singola tecnica liposoma qui presentata ci consente di studiare centinaia di liposomi contemporaneamente e rilevare le disomogeneità nelle loro dimensioni e composizione.

Il metodo può essere facilmente regolato per studiare altri sistemi a un singolo livello liposoma come le interazioni con le membrane proteiche. Tutto ciò di cui hai bisogno è il composto che studi per essere etichettato fluorescentmente. Con questo video, forniamo ai ricercatori lo strumento su come possono eseguire singoli studi liposomi.

Speriamo che sia chiaro che il saggio può essere facilmente modificato per studiare una serie di altri argomenti scientifici. Per iniziare, mescolare le scorte lipidiche preparate 138 microlitri di POPC e 120 microlitri di colesterolo in una fiala di vetro fresco. Quindi aggiungere 500 microlitri ciascuno dei due lipidi etichettati fluorescentmente e 50 microlitri di DSPE-PEG-biotina.

Allentare il coperchio del flaconcino di vetro e congelare il flaconcino in azoto liquido per uno o due minuti. Liofilizzare la miscela lipidica congelata durante la notte in un essiccatore di congelamento. Al mattino, aggiungere un millilitro di tampone D-sorbitolo da 200 millimolare ai lipidi secchi.

Riscaldare la miscela a 45 gradi Celsius ed esporla all'agitazione magnetica per almeno un'ora. Quindi congelare la sospensione lipidica immergere il flaconcino in azoto liquido e attendere che la sospensione sia completamente congelata. Successivamente, immergere la sospensione congelata in un bagno di riscaldamento a 55 gradi Celsius fino a quando la miscela non viene completamente scongelata.

Esporre la miscela a un totale di 11 cicli di congelamento-scongelamento. Successivamente, utilizzando un mini kit di estrusione, estrudere la sospensione liposoma una volta attraverso un filtro in policarbonato da 800 nanometri. Mescolare 1.200 microlitri di BSA e 120 microlitri di biotina BSA.

Aggiungere 300 microlitri della miscela ad ogni pozzo in uno scivolo da otto porri e incubare lo scivolo per 20 minuti a temperatura ambiente. Inclinare leggermente lo scivolo e dal bordo di ogni pozzo aspirare il mezzo. Aggiungere immediatamente 300 microlitri di tampone HEPES in ogni pozzo da lavare.

Lavare ogni bene otto volte in totale. Aggiungere 250 microlitri di streptavidina e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere gli otto lavaggi come descritto in precedenza.

Posizionare la diapositiva al microscopio e regolare il joystick del microscopio per concentrarsi sulla superficie della camera. Questo può essere facilmente fatto utilizzando l'aumento del segnale di riflessione laser dall'interfaccia del buffer di vetro come guida. In un tubo di microcentrifugo, aggiungere 10 microlitri del materiale liposoma diluito contenente 20 lipidi totali micromolari.

Trasferire 100 microlitri di tampone dalla camera al tubo di microcentrifugo, mescolare correttamente e trasferire i 110 microlitri nella camera. Mettere la camera al microscopio e utilizzare un microscopio rudimentale in grado di rilevare il segnale dai fluorofori liposomi per osservare i liposomi immobilizzati sulla superficie. Impostare il microscopio come descritto nel manoscritto.

Per l'immagine dei fluorofori DOPE ATTO488 e DOPE ATTO655 nei liposomi, immagini più canali. Assicurarsi che ogni canale sia stato immaginato in sequenza per evitare l'eccitazione incrociata. Ad esempio, prima scatta un'immagine eccitanti a 488 nanometri e leggendo l'emissione a 495-590 nanometri.

Successivamente, cambia le impostazioni e scatta un'altra immagine eccitanti a 633 nanometri ma leggendo l'emissione solo a 660-710 nanometri. Analizzare. Nel menu immagine, scegliete il colore e usate la funzione del canale unione per creare un composito dei due canali. Osservare se i liposomi visualizzati in due canali diversi mostrano una buona co-localizzazione o se si è verificata una deriva visibile.

Per rilevare le particelle, aprite il menu plugin, scegliete ComDet e fate clic su rileva particelle. In ComDet verificare che le impostazioni siano corrette e premere OK. Dopo aver eseguono l'analisi, vengono visualizzate due finestre popup con risultati e riepilogo. La tabella dei risultati contiene il rapporto di intensità tra i due canali.

Esportare i risultati della tabella dati contenente i dati di co-localizzazione. Adattare l'istogramma del rapporto di intensità con una funzione gaussiana ed estrarre la deviazione media e standard. La deviazione media e standard può essere utilizzata per calcolare il grado di disomogeneità.

Preparare una formulazione liposoma che è stata estrusa più volte attraverso un filtro da 50 nanometri. Calibrare le dimensioni dei liposomi confrontando l'intensità della fluorescenza con i dati sulle dimensioni di DLS. Con le stesse impostazioni sperimentali del microscopio di prima, immagini i liposomi di calibrazione.

Tracciare un istogramma a intensità della radice quadrata dell'intensità di fluorescenza dei liposomi di calibrazione. Montare l'istogramma con una distribuzione normale del log ed estrarre l'intensità media di fluorescenza dei liposomi di calibrazione come media geometrica. Per determinare la relazione tra l'intensità della radice quadrata e la dimensione liposoma, calcolare il fattore di correzione dividendo il diametro liposoma medio ottenuto dalle misure dinamiche di scattering della luce con la media geometrica dell'intensità della radice quadrata.

Calcolare i valori di intensità della radice quadrata per i liposomi nell'esperimento di disomogeneità compositiva e convertire questi due diametri moltiplicandosi con il fattore di correzione. Tracciare il valore del rapporto di intensità in funzione del diametro per i liposomi di disomogeneità compositiva, ottenendo così l'inomogenezza in funzione delle dimensioni liposomiche per una popolazione di liposomi che vanno da circa 50 nanometri a 800 nanometri. In questo protocollo, il successo dell'immobilizzazione superficiale dei liposomi è stato immediatamente evidente dopo l'aggiunta della soluzione liposoma alla camera indicata dalle macchie di intensità limitata di diffrazione.

Si consiglia di immobilizzare abbastanza liposomi per ottenere una densità da 300 a 400 liposomi per fotogramma. Una densità inferiore rende l'analisi dei dati più dispendiosa in termini di tempo, mentre una densità più elevata rende difficile distinguere singoli liposomi. Se l'intero campo visivo non è a fuoco corretto, la piastra campione potrebbe inclinarsi.

Inoltre, se i liposomi sembrano grandi e sfocati, questo indica che il tampone nella camera potrebbe essere evaporato e la superficie asciugata. Gli istogrammi del rapporto di intensità in genere rivelano una distribuzione gaussiana attorno a un valore del rapporto medio. Se si osservano forti deviazioni da una distribuzione gaussiana, indica un problema di sensibilità di rilevamento che suggerisce che un sottoinsieme di liposomi che mostrano un segnale più debole sono stati esclusi.

Dopo aver adeguato l'istogramma del rapporto di intensità con una funzione gaussiana, un grado di disomogeneità di 0,23 è stato tradotto al 32% della popolazione che differisco di oltre il 23% dal rapporto molare medio dell'insieme. La quantificazione dell'incertezza sperimentale è stata 0.1. Il test non migliorerà mai dei materiali che usi, quindi i liposomi unilaminari di alta qualità sono essenziali.

Quindi, quando li prepari, non tagliare angoli come lasciare fuori i cicli di congelamento-scongelamento. Immagini scadenti porteranno a un'elevata incertezza sperimentale e ti faranno sopravvalutare l'disomogeneità, quindi prenditi il tempo per acquisire buone immagini in-focus. Quello che il saggio fondamentalmente fa è studiare la densità superficiale dell'etichetta fluorescente.

Se questa etichetta fluorescente è su un lipide percolato, questo test può essere utilizzato per testare di qualità i liposomi per la somministrazione di farmaci. La configurazione è stata applicata per studiare come i peptidi si legano alle membrane e percepiscano la curvatura. Questo ha dato ai ricercatori intuizioni uniche sui segnali molecolari che governano come i peptidi sono ordinati all'interno delle cellule.