Name: Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Scopri un modello non invasivo di cheratopatia bullosa precoce utilizzando il laser Nd:YAG su occhi porcini. Questo metodo consente di studiare la perdita di cellule endoteliali corneale per nuove terapie.

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Ringraziamo Christine En e Jan A. M. Sochurek per il loro aiuto con metodi sperimentali.

Tutte le procedure relative al tessuto animale seguono le linee guida del Comitato locale per la cura e l'etica degli animali.
1. Preparazione della coltura degli organi e del trattamento laser
<ol><li>Ottenere occhi di porcina appena enucleated dal mattatoio locale. Mantenerli freschi (4 gradi centigradi) nel mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, integrato con L-glutamina, pyruvate di sodio, penicillina/streptomicina (1%), e siero di porcina (10%), d'ora in poi indicato in questo articolo come mezzo pieno.</li>
	<li>Rimuovere i tessuti extracellulari con le forbici e immergere gli occhi in 5% povidone-iodio-iodio soluzione oftalmica per 5 min prima di metterli in salina sterilizzata fosfato buffer (PBS) fino all'uso.</li>
	<li>Occhi dello schermo per le principali patologie del segmento anteriore, come cicatrici corneali, edema e altre opacità con un dispositivo di tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare gli occhi davanti a un'unità a lampada a taglio dotata di un laser Nd:YAG (Table of Materials), con una lunghezza d'onda di 1.064 nm e un diametro del punto focale di 10 m in aria. NOTA: Per un posizionamento ottimale viene utilizzato un apparecchio di tenuta stampato in 3D, progettato per tenere l'occhio fermo, senza mettere troppa pressione su di esso (Figura 1).</li>
	<li>Utilizzare un ingrandimento di 12x e deviare l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.</li>
	<li>Impostare l'energia dell'impulso (ad esempio, 1,6 mJ) e il punto di messa a fuoco (ad esempio, 0,16 mm) per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali.</li>
	<li>Posizionare una paracentesi di cornea chiara vicino al limbo e iniettare la viscoelastica (Tabella dei materiali) per stabilizzare la camera anteriore.</li>
	<li>Accisa la cornea centrale trattata al laser utilizzando una trephine da 8 mm.</li>
	<li>Collocare la cornea eccitata in un pozzo di una piastra di 12 pozze con il sito endoteliale rivolto verso l'alto e incubare il campione in 3 mL di mezzo pieno a 37 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni. NOTA: i potenziali agenti citoprotettivi possono essere aggiunti al mezzo durante questo passaggio.</li>
</ol>2. Preparazione all'istologia
<ol><li>Preparare il buffer di Sorensen con un pH di 7,4 contenente 19,6 mL di 133 mM KH2PO4 e 80,4 mL di 133 mM Na2HPO4.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo dal pozzo contenente cornea e fissare il tessuto per 20 min a temperatura ambiente (RT) utilizzando paraformaldeide senza metanolo (4%) nel buffer di Sorensen.</li>
	<li>Mettere il tessuto nel 20% di saccarosio in PBS fino a quando i lavandini tissutali (1 h) e poi nel 30% di saccarosio in PBS durante la notte a RT. Fare attenzione a evitare il contatto con le bolle e l'interfaccia della superficie dell'aria. Incorporare il tessuto nel composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) e conservarlo a -80 gradi centigradi.</li>
	<li>Tagliare le sezioni spesse 10 m con un criostato a -27 gradi centigradi. NOTA: Una spazzola per capelli cammello è utile per guidare la sezione emergente sopra la lama del coltello.</li>
	<li>Trasferire la sezione in un vetrino al microscopio toccando il vetrino al tessuto entro 1 min dal taglio per evitare il congelamento del tessuto. Conservare i vetrini a -80 gradi centigradi.</li>
</ol>3. Colorazione ematossia e eosina (H&E)
<ol><li>Sezioni asciutte all'aria per alcuni minuti per rimuovere l'umidità.</li>
	<li>Macchie con filtrato 0.1% Mayers ematossialina per 10 min in un tubo da 50 mL.</li>
	<li>In un barattolo Coplin, risciacquare in fresco in esecuzione ddH2O per 5 min e immergere in 0.5% eosin 10x.</li>
	<li>Immergere in ddH2O fino a quando l'eosinsa smette di striature e poi tuffo in 50% (10x) così come 70% (10x) EtOH.</li>
	<li>Equilibrate in 95% EtOH (30 s) e 100% EtOH (60 s) prima di immergersi in xilene più volte.</li>
	<li>Infine montare e coverslip il campione prima di prendere le immagini utilizzando un microscopio luminoso.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I risultati di questo studio pilota indicano che un laser Nd:YAG può essere utilizzato per ablamare selettivamente le cellule endoteliali corneali quando vengono scelti i parametri appropriati per la dose di energia e la posizione del punto di messa a fuoco.
Poiché la funzione endoteliale è importante per la trasparenza corneale e la salvaguardia della cornea dall'edema stromale, i modelli di disfunzione endoteliale svolgono un ruolo importante nello sviluppo di farmaci anti-edematosi o proced...

La trasparenza della cornea è essenziale per la trasmissione della luce alla retina e ai suoi fotorecettori1. A questo proposito, uno stato relativo di disidratazione è fondamentale per mantenere le fibre di collagene all'interno dello stroma corneale correttamente allineate. Questa omeostasi è mantenuta da cellule endoteliali corneali (CEC) situate sulla membrana del Descemet (DM)2. L'endotelio è lo strato corneale più interno. Ha un'importante barriera e funzione di pompaggio, che è fondamentale per la trasparenza corneale3. A differenza dell'epitelio, l'endotelio non è in grado di auto-rinnovarsi4. Pertanto, qualsiasi danno cellulare causato da malattie o traumi stimola le cellule endoteliali rimanenti ad ingrandire e migrare, a coprire i difetti risultanti e a mantenere la funzionalità corneale5. Tuttavia, se la densità CEC scende al di sotto di una soglia critica, lo scompenso dell'endotelio porta ad un edema, con conseguente visione e disagio offuscati o anche dolore grave4. Nonostante la disponibilità di farmaci per alleviare i sintomi, attualmente l'unico trattamento definitivo in questi casi è il trapianto di cornea, che può essere eseguito sotto forma di un trapianto endoteliale a tutto spessore o un trapianto endoteliale lamellare. Quest'ultima procedura è disponibile come keratoplastica endoteliale a membrana (DMEK) di Descemet e come keratoplastica endoteliale di Descemet (DSAEK)6. Tuttavia, la protezione della CEC rimanente e il miglioramento della loro sopravvivenza potrebbe essere un obiettivo alternativo, che necessita di un modello di malattia adeguato per testare potenziali farmaci terapeutici.
Gli attuali modelli di malattia da perdita CEC si concentrano sulla distruzione dell'endotelio attraverso l'iniezione di agenti tossici (ad esempio, il cloruro di benzalkonium) nella camera anteriore o per abrasione meccanica delle cellule utilizzando una tecnica di descemetorhexis invasiva7,8. Mentre questi modelli sono ben consolidati, esistono svantaggi come la risposta infiammatoria generale e danni collaterali imprecisi. Pertanto, questi modelli hanno maggiori probabilità di rappresentare le fasi finali della malattia, quando le opzioni chirurgiche di cui sopra sono inevitabili.
Con i progressi nelle strategie di trattamento cellulare come le cellule staminali e la terapia genica, l'applicazione di queste terapie cellulari potrebbe essere utile nelle prime fasi della perdita di CEC9. Successivamente, abbiamo bisogno di un modello che rappresenti queste fasi precedenti della malattia in modo più adeguato. A questo proposito, i modelli di coltura cellulare sono migliorati nell'ultimo decennio, ma sono ancora limitati nella loro validità, in quanto le cellule in vitro non possono avvicinarsi alla replica delle complesse interazioni che si verificano tra i diversi tipi di cellule all'interno della cornea10. Pertanto, i modelli ex vivo e in vivo sono ancora molto richiesti e migliorare quelli esistenti è del massimo interesse.
Chirurgia intraoculare non invasiva da fotodisruption utilizzando un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser è diventato una procedura di routine per oftalmologi in tutto il mondo dalla sua introduzione alla fine del 11 anni11. La fotodisruption si basa sull'assorbimento della luce non lineare che porta alla formazione di plasma, alla generazione di onde acustiche d'urto e alla creazione di bolle di cavitazione, ogni volta che il sito di applicazione si trova in un ambiente liquido12. In generale, questi processi contribuiscono all'effetto previsto di un taglio preciso dei tessuti. Tuttavia, possono anche essere la fonte di danni collaterali non necessari che limitano il confinamento locale della chirurgia laser13.
La previsione degli effetti meccanici risultanti è notevolmente migliorata attraverso la caratterizzazione del corso di propagazione e cavitazione dell'onda d'urto. Il nostro obiettivo è quello di indirizzare la CEC con il minor danno possibile al tessuto circostante per fornire un modello di malattia sperimentale non invasivo assistito dal laser per le prime fasi della perdita di CEC. A questo scopo, è necessario determinare le energie di impulso ottimali e le posizioni dei punti focali del laser.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Glucosio medio - alto</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per occhi</td><td>Self</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd:YAG</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Siero suino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Tomografo</td> <td>a coerenza ottica nel dominio spettraleHeidelberg Engineering</td><td>Spectralis Piastra per</td><td></td></tr><tr>coltura tissutale Microscopio a due fotoni <td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td><td>a 12 pozzetti</td></tr><tr><td></td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Viscoelastic OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

I laser Nd:YAG sono stati utilizzati per eseguire interventi chirurgici intraoculari non invasivi, come la capsulotomia da diversi decenni. L'effetto incisivo si basa sulla rottura ottica al fuoco laser. Vengono generate onde d'urto acustiche e bolle di cavitazione, causando la rottura del tessuto. Le dimensioni delle bolle e le ampiezza di pressione variano a seconda dell'energia dell'impulso e della posizione del punto focale. In questo studio, gli occhi di porcina enucleati sono stati posizionati di fronte a un laser Nd:YAG disponibile in commercio. Sono state testate le energie di impulso variabili e le diverse posizioni dei punti focali posteriori alla cornea. Le lesioni risultanti sono state valutate dalla microscopia a due fotoni e dall'istologia per determinare i migliori parametri per un distacco esclusivo delle cellule endoteliali corneali (CEC) con un danno collaterale minimo. I vantaggi di questo metodo sono l'ablazione precisa della CEC, la riduzione dei danni collaterali e, soprattutto, il trattamento senza contatto.

Usando la procedura qui presentata, abbiamo trattato gli occhi con un laser Nd:YAG, valutando diverse energie di impulso (1,0,6 mJ) e posizioni dei punti focali (distanza dalla superficie posteriore della cornea: 0,0,2 mm) per trovare i parametri ottimali. Sono state valutate repliche multiple (n n e 3) per ogni costellazione dei parametri laser (12 x 21).
Oltre al protocollo di cui sopra, l'esemplare è stato analizzato con un microscopio a due fotoni prima della fissazione e della colorazione...

Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Gli attuali modelli di malattia per la perdita di cellule endoteliali corneali si concentrano sulla distruzione dell'endotelio e più probabilmente rappresentano le fasi finali della malattia quando il trapianto corneale è inevitabile. Sono ora disponibili nuovi trattamenti con cellule staminali o terapia genica, tuttavia, che potrebbero essere più utili per le prime fasi della malattia, i cui modelli sono carenti. La chirurgia intraoculare non invasiva per fotodisrruzione utilizzando un laser Nd:YAG è diventata una procedura di routine per gli oftalmologi.Dopo aver ottenuto occhi suini appena enucleati dal mattatoio locale, posizionare i campioni in quattro gradi Celsius mezzo pieno. Utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti extracellulari e immergere gli occhi in una soluzione oftalmica di iodio al 5%povidone per cinque minuti. Quindi, posizionare i campioni disinfettati in PBS sterile a temperatura ambiente.Utilizzando un dispositivo di tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, scherma gli occhi per le principali patologie del segmento anteriore come cicatrici corneali, edema e altre opacità. Dopo lo screening, posizionare gli occhi davanti a un'unità di lampada a slittamento dotata di un laser Nd:YAG con una lunghezza d'onda di 1.064 nanometri e un diametro del punto focale di 10 micrometri nell'aria. Selezionate l'ingrandimento 12X e deviate l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.Dopo aver impostando l'energia dell'impulso e il punto di messa a fuoco sui parametri appropriati per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali corneali, applicare diversi colpi laser al tessuto. Quindi, al microscopio sezionato, posizionare una paracentesi di cornea chiara vicino al limbo e iniettare viscoelastico per stabilizzare la camera anteriore. Quindi utilizzare una trefina di otto millimetri per asportare la cornea centrale trattata al laser e posizionare la cornea isolata in un pozzo di un lato endoteliale a piastre di 12 po 'verso l'alto.Una volta raccolte tutte le cornee, aggiungere tre millimetri di mezzo pieno per ogni campione e incubare i campioni per un massimo di tre giorni a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con paraformaldeide al 4% priva di metanolo nel tampone di Sorensen per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, posizionare i campioni fissi in saccarosio al 20% in PBS per circa un'ora fino a quando le cornee affondano.Trasferire i campioni in saccarosio al 30% in PBS durante la notte prima di incorporare i tessuti in una temperatura di taglio ottimale per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare un criostato impostato su meno 27 gradi Celsius per ottenere sezioni spesse 10 micrometri dei tessuti congelati che raccolgono ogni sezione su uno scivolo al microscopio entro un minuto dall'acquisizione. Quindi conservare le diapositive a meno 80 gradi Celsius fino alla colorazione.Per la colorazione di ematossilina ed eosina, asciugare all'aria le sezioni congelate per diversi minuti per rimuovere l'umidità prima di macchiare con ematossilina filtrata dello 0,1% Mayer per 10 minuti in un tubo da 50 millilitri. Al termine dell'incubazione, sciacquare gli scivoli in acqua doppia distillata per cinque minuti in una cuvetta. Successivamente, immergere le diapositive nello 0,5% eosin 10 volte, seguite da risciacquo a immersione in acqua distillata doppia fino a quando l'eosina smette di strisciare.Immergere le diapositive risciacquate 10 volte in 50%etanolo e 10 volte in 70%etanolo. Dopo l'ultimo dip di etanolo del 70%, equilibrare le sezioni in 95%etanolo per 30 secondi, seguite da 60 secondi in etanolo al 100% prima di diversi tuffo in xilene. Quindi montare i campioni con coverlip prima di ottenere immagini al microscopio luminoso.Due immagini fotone e microscopia luminosa devono essere valutate in modo indipendente come nessun danno, troppi danni o una corretta quantità di danni. Sulla base di queste valutazioni, una mappa termica può quindi essere calcolata per selezionare la giusta costellazione di parametri laser per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali corneali con danni minimi al tessuto circostante. Analisi precedenti hanno determinato che il punto focale del laser deve essere di almeno 0,15 millimetri dietro l'endotelio corneale per l'energia dell'impulso più bassa testata.Per energie di impulso superiori a 2,9 millijoule, la distanza focale più lunga testata è ancora troppo vicina all'endotelio. Vari agenti citoprotettivi possono essere testati mentre i campioni asportati sono in coltura. Se si sono dimostrati efficaci, possono essere aggiunti alla soluzione di irrigazione per il trattamento.

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Questo video mostra una procedura laser assistita non invasiva per danneggiare selettivamente le cellule endoteliali corneali nell'occhio suino. Il modello ex vivo sviluppato del danno alle cellule endoteliali può essere utilizzato per studiare le malattie dell'endotelio corneale.

Ablazione selettiva laser-assistita di cellule endoteliali corneali suine: una tecnica per indurre una lesione endoteliale corneale suina focalizzata per studi ex vivo

Neovascolarizzazione (NV) della cornea può complicare molteplici patologie visive. Utilizzando un modello di lesione alcali-un'ustione controllata, un livello quantificabile di NV corneale può essere prodotta per lo studio meccanicistico di NV corneale e valutazione di potenziali terapie per i disordini neovascolare.

Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Nel trapianto endoteliale viene proposta una procedura completamente laser. La tecnica chirurgica si basa sull'utilizzo di un laser a femtosecondi per preparare il tessuto donatore. La tecnica di saldatura laser viene quindi utilizzata per fissare l'endotelio del donatore nella posizione corretta.

Un &quot;All-laser&quot; Endothelial Transplant

Qui, presentiamo il protocollo di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser (CNV) di topo, un modello sperimentale che ricrea i segni distintivi vascolari della degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD). Una volta padroneggiato, può indurre in modo affidabile ed efficace la CNV come sistema modello per testare varie misure sperimentali.

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

Una cultura primarie di cellule endoteliali corneali bovini è stato utilizzato per studiare il meccanismo di transizione corneale endoteliale-mesenchimale. Inoltre, un corneale endotelio modello cryoinjury ratto è stato utilizzato per dimostrare corneale endoteliale transizione-mesenchimali in vivo.

In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Descemet's Stripping Only è una procedura sperimentale in cui i pazienti con guttae corneale centrale derivanti dalla distrofia corneale endoteliale di Fuchs hanno la membrana di Descemet spogliata per le cellule periferiche per rigenerare lo strato endoteliale. Presentiamo una nuova metodologia che simula il DSO nelle cornee umane distrofiche ex vivo con guarigione accelerata stimolata da eFGF1 (NM141).

Un modello di coltura di organi corneali umani dello stripping di Descemet solo con guarigione accelerata stimolata dal fattore di crescita dei fibroblasti ingegnerizzato 1

Questo protocollo descrive un metodo per indurre una lesione alcalina corneale e limbare accurata e riproducibile in un modello murino. Il protocollo è vantaggioso in quanto consente una lesione uniformemente distribuita alla cornea e al limbus del topo altamente curvi.

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Scopri un modello non invasivo di cheratopatia bullosa precoce utilizzando il laser Nd:YAG su occhi porcini. Questo metodo consente di studiare la perdita di cellule endoteliali corneale per nuove terapie.

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

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