Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Gli attuali modelli di malattia per la perdita di cellule endoteliali corneali si concentrano sulla distruzione dell'endotelio e più probabilmente rappresentano le fasi finali della malattia quando il trapianto corneale è inevitabile. Sono ora disponibili nuovi trattamenti con cellule staminali o terapia genica, tuttavia, che potrebbero essere più utili per le prime fasi della malattia, i cui modelli sono carenti. La chirurgia intraoculare non invasiva per fotodisrruzione utilizzando un laser Nd:YAG è diventata una procedura di routine per gli oftalmologi.

Dopo aver ottenuto occhi suini appena enucleati dal mattatoio locale, posizionare i campioni in quattro gradi Celsius mezzo pieno. Utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti extracellulari e immergere gli occhi in una soluzione oftalmica di iodio al 5%povidone per cinque minuti. Quindi, posizionare i campioni disinfettati in PBS sterile a temperatura ambiente.

Utilizzando un dispositivo di tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, scherma gli occhi per le principali patologie del segmento anteriore come cicatrici corneali, edema e altre opacità. Dopo lo screening, posizionare gli occhi davanti a un'unità di lampada a slittamento dotata di un laser Nd:YAG con una lunghezza d'onda di 1.064 nanometri e un diametro del punto focale di 10 micrometri nell'aria. Selezionate l'ingrandimento 12X e deviate l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.

Dopo aver impostando l'energia dell'impulso e il punto di messa a fuoco sui parametri appropriati per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali corneali, applicare diversi colpi laser al tessuto. Quindi, al microscopio sezionato, posizionare una paracentesi di cornea chiara vicino al limbo e iniettare viscoelastico per stabilizzare la camera anteriore. Quindi utilizzare una trefina di otto millimetri per asportare la cornea centrale trattata al laser e posizionare la cornea isolata in un pozzo di un lato endoteliale a piastre di 12 po 'verso l'alto.

Una volta raccolte tutte le cornee, aggiungere tre millimetri di mezzo pieno per ogni campione e incubare i campioni per un massimo di tre giorni a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con paraformaldeide al 4% priva di metanolo nel tampone di Sorensen per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, posizionare i campioni fissi in saccarosio al 20% in PBS per circa un'ora fino a quando le cornee affondano.

Trasferire i campioni in saccarosio al 30% in PBS durante la notte prima di incorporare i tessuti in una temperatura di taglio ottimale per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare un criostato impostato su meno 27 gradi Celsius per ottenere sezioni spesse 10 micrometri dei tessuti congelati che raccolgono ogni sezione su uno scivolo al microscopio entro un minuto dall'acquisizione. Quindi conservare le diapositive a meno 80 gradi Celsius fino alla colorazione.

Per la colorazione di ematossilina ed eosina, asciugare all'aria le sezioni congelate per diversi minuti per rimuovere l'umidità prima di macchiare con ematossilina filtrata dello 0,1% Mayer per 10 minuti in un tubo da 50 millilitri. Al termine dell'incubazione, sciacquare gli scivoli in acqua doppia distillata per cinque minuti in una cuvetta. Successivamente, immergere le diapositive nello 0,5% eosin 10 volte, seguite da risciacquo a immersione in acqua distillata doppia fino a quando l'eosina smette di strisciare.

Immergere le diapositive risciacquate 10 volte in 50%etanolo e 10 volte in 70%etanolo. Dopo l'ultimo dip di etanolo del 70%, equilibrare le sezioni in 95%etanolo per 30 secondi, seguite da 60 secondi in etanolo al 100% prima di diversi tuffo in xilene. Quindi montare i campioni con coverlip prima di ottenere immagini al microscopio luminoso.

Due immagini fotone e microscopia luminosa devono essere valutate in modo indipendente come nessun danno, troppi danni o una corretta quantità di danni. Sulla base di queste valutazioni, una mappa termica può quindi essere calcolata per selezionare la giusta costellazione di parametri laser per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali corneali con danni minimi al tessuto circostante. Analisi precedenti hanno determinato che il punto focale del laser deve essere di almeno 0,15 millimetri dietro l'endotelio corneale per l'energia dell'impulso più bassa testata.

Per energie di impulso superiori a 2,9 millijoule, la distanza focale più lunga testata è ancora troppo vicina all'endotelio. Vari agenti citoprotettivi possono essere testati mentre i campioni asportati sono in coltura. Se si sono dimostrati efficaci, possono essere aggiunti alla soluzione di irrigazione per il trattamento.