Name: Rilevamento della migrazione e dellinfiltrazione dei neutrofili nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Impara a rilevare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili nei topi utilizzando l'air pouch assay e il modello di artrite indotta da adiuvante. Questi metodi supportano lo sviluppo di terapie mirate per malattie infiammatorie.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 81430099 e 31500704), cooperazione internazionale e progetti di scambio (numero di sovvenzione 2014DFA32950), e il programma di ricerca dell'Università di Pechino di medicina cinese ( sovvenzione BUCM-2019-JCRC006 e 2019-JYB-TD013).

Tutte le procedure sperimentali sono state riviste e approvate dall'Università di Pechino di Medicina Cinese Animal Care and Use Committee.
NOTA: sono stati utilizzati topi C57BL/6 (7-8 settimane).
1. Isolamento neutrofilo
<ol><li>Acquisizione di cellule essudati peritoneali<ol>
<li>Preparare fresco 10% soluzione peptone proteose in ddH2O. Calcolare il volume necessario in base al numero di topi. NOTA: Impostare il numero di mouse come N, (2N- 1) mL di soluzione deve essere dissolto e filtrato in anticipo.</li>
		<li>Spruzzare lo spazio di lavoro con 70% di etanolo. Utilizzare un iniettore di insulina per disegnare 1 mL di soluzione peptone e scaricare bolle.</li>
		<li>Condurre la prima iniezione intraperitoneale di 1 mL di soluzione peptone per mouse.<ol>
<li>Afferra il mouse in una posizione head-down con una mano. Disinfettare il punto di iniezione con batuffoli di cotone imbevuti di alcool. NOTA: La posizione di iniezione preferita si trova nell'aspetto laterale del quadrante inferiore sinistro o destro dell'addome.</li>
			<li>Infondere rapidamente i reagenti. Iniettare 1 mL nella cavità peritoneale di ogni topo con l'iniettore di insulina. NOTA: L'angolo tra l'ago e la pelle dovrebbe essere di circa 15-30 gradi per evitare di ferire l'intestino o altri organi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Consentire alla risposta infiammatoria di svilupparsi durante la notte. Dopo 12 h, condurre la seconda iniezione nello stesso modo della prima iniezione.</li>
		<li>Tre ore dopo la seconda iniezione, i topi completamente anestesi con 5% di isoflurane per 5 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min. Rimuovere i topi anestesi dalla camera e sacrificarli con la lussazione cervicale. NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate. NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere elaborati in una cappa di coltura tissutale.</li>
		<li>Spruzzare il mouse con 70% di etanolo. Posare il mouse su un tampone di plastica sterile e fissare gli arti con gli aghi.</li>
		<li>Utilizzare una serie sterile di strumenti chirurgici per fare un'incisione orizzontale (1 cm) al centro dell'addome inferiore. Sollevare la pelle dell'addome superiore con pinze e tagliare lungo la linea mediana dell'addome ed esporre la parete peritoneale intatta.</li>
		<li>Iniettare 5 mL di RPMI-1640 sterile mezzo completo nella cavità addominale con un ago 30 G x 1/2.Injectato Inserire l'ago attraverso la parete peritoneale con il bordo smussato dell'ago rivolto verso l'alto e iniettare l'intero volume.</li>
		<li>Agitare il pad orizzontalmente per 5 min. Massaggiare delicatamente l'addome più volte.</li>
		<li>Iniettare un ago da 23 G x 1 1/4" nello spazio laterale dell'addome. Estrarre il liquido addominale (5 mL) e raccoglierlo in un tubo di centrifuga di 50 mL. NOTA: Posizionare i tubi sul ghiaccio il prima possibile in caso di attivazione di neutrofili.</li>
		<li>Iniettare altri 5 mL di mezzo completo e ripetere la procedura per rimuovere le cellule rimanenti dal peritoneo. Mettere in comune il liquido peritoneale nel tubo di centrifugazione da 50 mL.</li>
		<li>Centrifugare il fluido peritoneale in pool a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Scartare il super-attardato. Risospendere le celle in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo. NOTA: Non vortice per evitare l'attivazione dei neutrofili.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento dei neutrofili<ol>
<li>Aggiungere 4 mL di mezzo sfumato di 70,2% di densità appena preparato (ad esempio, Percoll) in un tubo di centrifuga da 15 mL.</li>
		<li>Sovrappone con attenzione 4 mL di mezzo sfumato appena preparato al 54,8% di densità sul mezzo di pendenza densità 70,2% lentamente lungo il bordo del tubo con punte di pipetta affilate nel tubo di centrifuga di 15 mL. NOTA: Prestare attenzione per evitare di disturbare l'interfaccia tra il mezzo gradiente di densità del 54,8% e il mezzo di sfumatura di densità 70,2%.</li>
		<li>Sovrapponete con cura la sospensione cellulare peritoneale da 1 mL sopra lo strato medio di pendenza a densità 54,8% lentamente con punte pipette affilate (Figura 1A). NOTA: Prestare attenzione per evitare di disturbare l'interfaccia tra la sospensione cellulare e il mezzo di gradiente di densità del 54,8%.</li>
		<li>Centrifuga a 1.500 x g per 30 min a 22 gradi centigradi senza frenata.</li>
		<li>Raccogliere i neutrofili nell'interfaccia del mezzo gradiente di densità del 54,8% e dei livelli medi del gradiente di densità del 70,2% (Figura 1B) in un nuovo tubo.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo alle cellule raccolte e riutilizzare con attenzione le cellule pipettando delicatamente più volte. Centrifuga a 100 x g per 10 min a RT e rimuovere con attenzione il supernatante.</li>
		<li>Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggio 1.2.6) una volta.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di mezzo di coltura al pellet e rimettere in sospensione le cellule pipettando delicatamente più volte. Prendere un'aliquota 50 -L per contare le cellule utilizzando un analizzatore automatico di ematologia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analisi della migrazione neutrofilo
<ol><li>Misurare la migrazione dei neutrofili da parte dell'analisi di Transwell9 o dell'analisi della camera di zigzogo come descritto in precedenza10,11.</li>
</ol>3. Asdetto della sacca dell'aria
<ol><li>Prima iniezione d'aria<ol>
<li>Il giorno 0, i topi completamente anantroposi con il 5% di isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantengono l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min. NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate.</li>
		<li>Per ottenere un volume di aria sterilizzata, utilizzare un filtro da 0,22 m collegato a una siringa da 5 mL.</li>
		<li>Sollevare la pelle posteriore del topo anetizzato con una pinzetta e iniettare sottocutaneamente 3 mL di aria sterilizzata utilizzando un ago da 26 G x 3/8.Lift the back skin of the anthetitized mouse with traweezers and subcutaneously inject 3 mL of sterilized air using a 26 G x 3/8" needle.</li>
		<li>Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità di respirazione. Monitorare i topi per assicurarsi che siano in vita fino a quando iniziano a muoversi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seconda iniezione d'aria<ol>
<li>Il giorno 3, iniettare altri 3 mL di aria sterilizzata nella tasca dell'aria precedentemente stabilita per sostenere la sacca d'aria come descritto nella sezione 3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattamento<ol>
<li>Il giorno 6, 6 h prima del sacrificio, iniettare diversi trattamenti nella sacca dell'aria. Iniettare 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) come controllo negativo. Iniettare 1 mL di 1 G/mL LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale.</li>
		<li>Topi completamente anestesizzare con 5% isoflurane per 3 min in una camera di anestesia a gas ad una velocità di 2 L/min, e mantenere l'anestesia di ogni topo in una singola unità respiratoria con 2% di isoflurane ad una velocità di 0,5 L/min. Preparare il buffer di lavaggio secondo il tavolo dei materiali. NOTA: La profondità sufficiente dell'anestesia è garantita pizzicando le dita dei pipi' prima di spostare i topi dalla camera all'unità di respirazione singola. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei dei dadi sono pizzicate.</li>
		<li>Per ogni sacca d'aria, lavare la sacca dell'aria con 1 mL di tampone di lavaggio e raccogliere l'essenza infiammatoria in un tubo di centrifuga di 15 mL. Lavare la sacca dell'aria con 2 mL di lavaggio tampone 2x e raccogliere l'estuoso infiammatorio nello stesso tubo di centrifuga.</li>
		<li>Centrifuga a 100 x g per 10 min a RT. Scartare il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio. Contare le cellule per quantificare il rapporto neutrofilo utilizzando l'analizzatore automatico di ematologia. NOTA: Vedere risultati rappresentativi nella figura 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Induzione del modello murino di artrite adiuvante (AA)
<ol><li>Sospendere l'adiuvante di Freund (CFA) completa vorticendo almeno 5 s, quindi disegnare 100 - L di sospensione in un iniettore di insulina. NOTA: Si consiglia di utilizzare un CFA completamente nuovo negli esperimenti per garantire la sterilità.</li>
	<li>Anestesizzare i topi come descritto nel passaggio 3.1.1.</li>
	<li>Contrassegnare la zampa prescelta e iniettare 20 L di CFA nello spazio dell'articolazione della caviglia. Iniettare 20 - L di sospensione in quattro punti periarticolari sulla zampa prescelta (80 - L in totale).</li>
	<li>Rimuovere i topi dall'unità di respirazione e mettere i topi trasformati in una nuova camera. Monitorare i topi per assicurarsi che stiano respirando fino a quando non riacquistano la capacità di muoversi.</li>
	<li>Ogni 3 giorni, valutare il diametro articolare misurando il diametro dell'articolazione della caviglia utilizzando un indicatore di spessore della tasca (Figura 3A).</li>
	<li>Ogni 3 giorni, valutare la gravità dell'artrite in base al criterio di punteggio dell'artrite (Figura 3C): 0, normale, nessuna prova di erestesia e gonfiore; 1, l'artrite mipiù, l'eritema e il lieve gonfiore confinati al tarsals o all'articolazione della caviglia; 2, artrite moderata, eritthema e gonfiore lieve che si estende dalla caviglia ai tarsali; 3, grave artrite, eritema e gonfiore moderato che si estende dalla caviglia alle articolazioni metatarsche; 4, l'artrite più grave, l'eritema e il grave gonfiore comprendono la caviglia, il piede e le cifre, o l'ankylosi dell'arto.</li>
</ol>5. Colorazione immunostochimica delle sezioni articolari
<ol><li>Isolamento congiunto<ol>
<li>Sacrificare il topo nella sezione 4 utilizzando la lussazione cervicale dopo l'anestesia con isoflurane. Spruzzare il mouse con 70% di etanolo.</li>
		<li>Rimuovere la pelle e parte del muscolo dalla gamba posteriore con pinzette e forbici. Spruzzare l'articolazione con il 70% di etanolo e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta.</li>
		<li>Fissare l'articolazione della caviglia in 4% paraformaldeide per 2 giorni a RT. Decalcify l'articolazione in 10% EDTA per 1 mese a RT e cambiare il medio settimanale.</li>
		<li>Incorporare il tessuto in paraffina e preparare sezioni di tessuto spesso 4 m.<ol>
<li>Mettere il tessuto in uno stampo marcato con un certo volume di paraffina liquida. Raffreddare brevemente.</li>
			<li>Impostare lo spessore a 4 m e tagliare le fette su un microtoma. Galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua a 43 gradi centigradi.</li>
			<li>Montare le sezioni sugli scivoli e mettere i vetrini in forno a 70 gradi per 2 ore. Per un uso futuro, conservare i vetrini a -20 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Safranin O e colorazione verde veloce delle sezioni articolari NOTA: le seguenti fasi di colorazione vengono eseguite in RT.<ol>
<li>Posizionare i vetrini dal passo 5.1.4.3 in un rack ed eseguire i seguenti lavaggi per reidratare a RT: xilene per 5 min (3x), 100% etanolo per 2 min (2x), 95% etanolo per 2 min (2x), 70% etanolo per 2 min, e 50% etanolo per 15 min.</li>
		<li>Macchie in soluzione verde veloce 0.1% per 5 min.</li>
		<li>Macchie nello 0,1% safranin O soluzione di colorazione per 20 min. Immergere i vetrini nei seguenti lavamenti: 95% etanolo per 2 min (2x), 100% etanolo per 2 min (2x) e xilene per 2 min (2x).</li>
		<li>Montare le sezioni di tessuto e osservare i tessuti al microscopio. NOTA: Vedere immagini rappresentative nella Figura 4A.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione immunoistochimica per visualizzare i neutrofili<ol>
<li>Cuocere le sezioni di paraffina per 2 h a 78 gradi centigradi. Mettere i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti lavamenti per reidratarsi a RT: xilene per 15 min (2x), 100% etanolo per 5 min (2x), 95% etanolo per 5 min, 80% etanolo per 5 min, H2O per 3 min e PBS per 3 min. NOTA: Non lasciare asciugare i vetrini in qualsiasi momento durante questo passaggio.</li>
		<li>Aggiungere una goccia di buffer di permeabilizzazione per coprire il tessuto. Incubare le sezioni in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x). Evitare di sciacquare il tessuto direttamente.</li>
		<li>Eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore utilizzando una caldaia a pressione.<ol>
<li>Disporre i vetrini in un rack. Immergere i vetrini nella caldaia a pressione riempita con buffer di recupero.</li>
			<li>Mettere la caldaia a pressione su un forno a microonde. Impostare il forno a microonde a 600 W e riscaldare i vetrini per 10 min.</li>
			<li>Dopo l'ebollizione, tenere gli spogli nella caldaia a raffreddare a 90 gradi centigradi. Estrarre i vetrini e sciacquarli in PBS per 3 min (3x).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quench endogena attività perossidasi in appena preparato 3% H2O2 a 15 min. Sciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).</li>
		<li>Delineare un grande cerchio intorno al campione con una penna idrofobica, evitare di toccare il campione. Blocco con 3% di albumina di siero bovino (BSA) in una camera controllata dall'umidità a 37 gradi centigradi per 60 min.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di blocco. Aggiungete rapidamente 50 -L di anticorpo primario diluito pbS ad ogni sezione. Quindi, incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 4 gradi durante la notte. NOTA: per diversi anticorpi vengono utilizzati rapporti di diluizione diversi (1:25 per MPO e 1:20 per NE).</li>
		<li>Il secondo giorno, estrarre il vassoio e lasciarlo riposare a RT per 30 min. Quindi, risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).</li>
		<li>Aggiungere al tessuto 50 - L di anticorpi secondari diluiti PBS. NOTA: Sono stati applicati diversi rapporti di diluizione: 1:1,000 per MPO e 1:1.500 per NE.</li>
		<li>Incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi centigradi per 30 min. Quindi, risciacquare i vetrini in PBS per 3 min (3x).</li>
		<li>Sviluppare in diluito 3,3'-diaminobenzidina (DAB) soluzione per 5 min. Tieni d'occhio la reazione in caso di sviluppo di un colore scuro. Sciacquare gli scivoli in acqua distillata.</li>
		<li>Controsta gli scivoli in ematossino per 10 s. Sinsegli s in acqua del rubinetto per 5 min.</li>
		<li>Risciacquare in alcool acido soluzione di differenziazione superveloce alcool per 3 s. Quindi risciacquare nell'acqua del rubinetto per 10 min.</li>
		<li>Immergere i vetrini nei seguenti lavamenti a RT: 80% etanolo per 5 min, 95% etanolo per 5 min, 100% etanolo per 5 min e xilene per 15 min (2x). Fissare il coperchio con la soluzione di montaggio. Osservare il tessuto al microscopio. NOTA: Vedere immagini rappresentative nella figura 4B.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+in+severe+congenital+neutropenia%3A+emerging+insights+into+life+and+death+of+human+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes.</a> Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNuzzi%2C+PA+%22Adhesion+Protein+Protocols%22">Adhesion Protein Protocols</a>. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).</li>
<li>Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Recruitment%3A+From+Model+Systems+to+Tissue-Specific+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns.</a> Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).</li>
<li>Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balancing+act+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The balancing act of neutrophils.</a> Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).</li>
<li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li>
<li>Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophils+in+auto-immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human neutrophils in auto-immunity.</a> Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e745(2008).</li>
<li>Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+transendothelial+migration%3A+updates+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives.</a> Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).</li>
<li>Kouspou, M. M., Price, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cellular+migration+using+a+two-chamber+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology.</a> Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).</li>
<li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5 (12), e15309(2010).</li>
<li>Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+trunk+neural+crest+cell+migration+using+a+modified+Zigmond+chamber+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3330(2012).</li>
<li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neutrophil%27s+Role+During+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), eaat4579(2018).</li>
<li>Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+priming+by+neutrophil+extracellular+traps+links+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses.</a> Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).</li>
<li>Puga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell-helper+neutrophils+stimulate+the+diversification+and+production+of+immunoglobulin+in+the+marginal+zone+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen.</a> Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).</li>
<li>Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase%3A+A+new+player+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity.</a> Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).</li>
<li>Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase+from+polymorphonuclear+leukocyte+in+articular+cartilage+and+synovial+fluids+of+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).</li>
<li>Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).</li>
<li>Luo, Y., Dorf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).</li>
<li>Carlson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophil+lipocalin+is+a+unique+marker+of+neutrophil+inflammation+in+ulcerative+colitis+and+proctitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis.</a> Gut. 50 (4), 501-506 (2002).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanshinone+IIA+ameliorates+chronic+arthritis+in+mice+by+modulating+neutrophil+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities.</a> Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).</li>
<li>Forster, R., Sozzani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+aspects+of+leukocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging aspects of leukocyte migration.</a> European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-Mediated+Delivery+of+Dexamethasone+Palmitate-Loaded+Liposomes+Decorated+with+a+Sialic+Acid+Conjugate+for+Rheumatoid+Arthritis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment.</a> Pharmaceutical Research. 36 (7), 97(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Protocolli dettagliati di neutrofili altamente purificati dal sangue periferico7, midollo osseo e tessuti18 sono stati disponibili per lungo tempo. Qui adottiamo un metodo per isolare i neutrofili dal liquido peritoneale19 in cui i neutrofili maturi rimangono inattivati per ulteriori studi anti-infiammatori e antiossidanti.
Abbiamo usato l'esperimento della sacca d'aria per esplorare l'infiltrazione indotta da LPS dei neut...

I neutrofili sono i globuli bianchi più abbondanti e rappresentano il 50-70% dell'intera popolazione di globuli bianchi negli esseri umani1. I neutrofili sono uno dei principali soccorritori durante l'infiammazione acuta. I neutrofili possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine rilasciate dalle cellule residenti nei tessuti2,3,4, che è mediata dalle interazioni tra molecole di adesione cellulare sulla superficie di neutrofili e cellule endotelio vascolare 5. I neutrofili sono fondamentali per la difesa dell'ospite e svolgono un ruolo nelle reazioni infiammatorie patologiche a causa della loro potente capacità di danneggiare i tessuti attraverso il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e altre molecole dannose per i tessuti3,6.
Studi precedenti hanno descritto diversi protocolli di isolamento dei neutrofili da topi o esseri umani. Oh e t. ha dimostrato un metodo di separazione del gradiente di densità per isolare i neutrofili umani dal sangue umano intero7. Tuttavia, l'isolamento di neutrofili sufficienti dal sangue di topo è difficile a causa del piccolo volume di sangue. In alternativa, un gran numero di neutrofili di topo puro e vitale può essere suscitato dal liquido peritoneale del topo, e questi neutrofili purificati possono essere utilizzati ex vivo per esaminare diversi aspetti delle funzioni cellulari ex vivo, tra cui l'infiltrazione dei neutrofili, la migrazione, il chemiotaxi, l'esplosione ossidativa, la citochina e la produzione di trapextra extrafilaretiche neutrofila (NET)8. Transwell saggi9 o saggi della camera di zigmond10,11 possono essere utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili in vitro. Il modello della sacca d'aria viene utilizzato per valutare la migrazione e l'infiltrazione di neutrofili in vivo. Il modello sottocutaneo della sacca d'aria è un comodo modello animale in vivo per studiare la migrazione delle cellule infiammatorie.
Tradizionalmente, i neutrofili erano considerati eliminatori patogeni nelle fasi acute dell'infiammazione. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che i neutrofili sono cellule complicate che svolgono una notevole varietà di funzioni specializzate. I neutrofili possono regolare molti processi come lesioni e riparazioni acute, tumorigenesi, risposta autoimmune e infiammazione cronica12,13. Neutrophils anche modulare le risposte immunitarie adattative e può regolare le cellule B e le cellule T14,15. La sostanziale carenza di neutrofili porta alla mortalità o alla grave immunodeficienza nell'uomo e l'esaurimento dei neutrofili nei topi porta alla fatalità, mentre l'attivazione o il reclutamento eccessivo di neutrofili negli organi causa diverse malattie immunitarie, come l'artrite reumatoide (RA) e lupus erythematosus (SLE)6. I neutrofili sono le cellule più abbondanti nel fluido sinoviale dei pazienti affetti da RA. Neutrophils producono quantità eccessive di mieloperossia (MPO) e elastasi neutrofili (NE) attraverso la degradazione, che esacerba l'erosione della cartilagine. MPO è un enzima perossidasi espresso principalmente nei granuli dei neutrofili16. NE è associato alla distruzione della cartilagine articolare17. MPO e NE potrebbero essere utilizzati per valutare lo stato della migrazione dei neutrofili e dell'infiltrazione nel tessuto dei pazienti affetti da RA.
Questo articolo fornisce tre metodi convenzionali per valutare la migrazione di neutrofili normali indotti sia in vivo che in vitro, così come l'infiltrazione di neutrofili patologici in un modello di infiammazione specifico dell'articolazione del topo.

<table><tbody><tr><td>Soluzione Fast Green allo 0,1%</td><td>Solarbio</td><td>8348b</td><td>Trasferire 20 mg di grane veloce FCF in un flaconcino in un altro becher da 100 mL. Aggiungere 20 mL di H2O nel becher e sciogliere la macchia mescolando per ottenere una soluzione verde rapida allo 0,1% e filtrarla con un filtro Nalgene PES 75mm</td></tr><tr><td>0,1% Safranin O Soluzione colorante</td><td>Solarbio</td><td>8348a</td><td>Trasferire 20 mg di colorante di safranina O in una fiala in un becher da 100 ml. Aggiungere 20 mL di H2O nel becher e sciogliere la macchia mescolando per ottenere una soluzione colorante di safranina O allo 0,1% e filtrarla con un filtro Nalgene PES da 75 mm</td></tr><tr><td>Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) da 0,5 M, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>324506</td><td>sterile</td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% metanolo</td> Beijing <td>Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga in polipropilene conico da 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4" Ago</td><td>BD</td><td>305120</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8" Ago</td><td>BD</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>3% albumina sierica bovina (BSA)</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 0,3 g di BSA in 10 mL di PBS</td></tr><tr><td>3% H2O2</td><td></td><td></td><td>Miscelare 1 mL 30% H2O2 con metanolo con 9 mL di metanolo</td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina (DAB)</td><td>kit ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2" Ago</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 mL</td><td>BD</td><td>Z683574</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica in polipropilene da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr>Miscela di<td>etanolo al 50% 500 mL di etanolo</td><td></td><td></td><td>al 100% con 500 mL di dH2O</td></tr><tr><td>54,8% di Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 2,74 mL SIP con 2,26 mL 1&volte; PBS, da fermo</td></tr><tr><td>70% Miscela di etanolo</td><td></td><td></td><td>700 mL 100% etanolo con 300 mL dH2O</td></tr><tr><td>70,2% Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 3,51 mL SIP con 1,49 mL 1&volte; PBS, da fermo</td></tr><tr><td>Miscela di etanolo all'80%</td><td>800 mL di etanolo al 100% con 200 mL di dH2O</td>Miscela di etanolo al 95% 950 mL di etanolo al 100% con 50 mL di dH2O Soluzione di differenziazione superveloce dell'alcol Beyotime C0165S ANTICORPI Anti-mieloperossidasi Anticorpo Abcam <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ab208670</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-neutrofili elastasi</td><td>Abcam</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore ematologico automatico</td><td>Sysmex</td><td>XS-800i</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adiuvante completo di Freund, 10 mg/ml</td><td>sigma</td><td>1002036152</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>CITOGLAS</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di spessore a quadrante</td><td>Mitutoyo</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microtubes, 1,5 mL</td><td>Sigma</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS) Premium</td><td>PAN</td><td>P30-1302</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia gassosa</td><td>ZS Dichuang</td><td>ZS-MV-IV</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra H& L (HRP)</td><td>PPLYGEN</td><td>C1309</td><td>Questo è l'anticorpo secondario utilizzato nella colorazione immunoistochimica.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israele</td><td>02-016-1A</td><td>Soluzione sterile</td></tr><tr><td>per colorazione con ematossilina</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9609</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L3012</td><td></td></tr><tr><td>MEDIA E INTEGRATORI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safranin modificata O-fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td><td>Solarbio</td><td>G1371</td><td></td></tr><tr><td>N-formil-Met-Leu-Phe (fMLP)</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina soluzione, 100&volte;</td><td>Invitrogen</td><td>1514022</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>10245207</td><td>Gradiente di densità medio</td></tr><tr><td>Miscela tampone</td><td></td><td></td> di permeabilizzazione <td>100 &mu; L Triton X-100 con 1 L dH2O per ottenere lo 0,01% di</td></tr><tr><td>soluzione salina tampone fosfato Triton X-100 (PBS), 1&volte;</td><td></td><td></td><td>Miscelare 90% ddH2O con 10% (v/v) 10&volte; PBS,</td></tr> soluzione <tr><td>salina tampone fosfato autoclavato (PBS), 10&volte;</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 16 g di NaCl, 0,4 g di KCl, 2,88 g di Na2HPO4&middot; 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (anidro) in 200 mL ddH2O, regolare pH 7,4, autoclavato</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteoso Peptone</td><td>Oxoid</td><td>1865317</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td> <td>di recuperoMiscelare 18 mL di tampone di recupero A con 82 mL di tampone di recupero B, aggiungere dH2O a 1000 mL, regolare il pH a 6,0</td></tr><tr><td>Tampone di recupero A Stock per IHC</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 4,2 g di acido citrico (C6H5O7&middot; H2O) in 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>Tampone di recupero B Stock per IHC</td><td></td><td></td><td>Sciogliere 5,88 g di citrato trisodico diidrato (C6H5Na3O7&middot; 2H20) in 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Complete Medium</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640 medium è integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.</td></tr><tr><td>Shu Rui U40 Ago per iniezione di insulina sterile monouso 1 mL</td><td>BD</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>CITOGLAS</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>SOLUZIONE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acido corto (SIP)</td><td></td><td></td><td>Mescolare il 90% (v/v) di percoll con il 10% (v/v) 10&times; PBS, rimanere fermi per 20 minuti</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio nel saggio</td><td></td><td></td> della sacca d'aria <td>Diluire da 0,5 M EDTA a 10 mM con HBSS</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

I neutrofili sono un membro importante del sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella difesa dell'ospite contro agenti patogeni e reazioni infiammatorie patologiche. Neutrophils possono essere reclutati in siti di infiammazione attraverso la guida di citochine e chemiochine. L'infiltrazione schiacciante dei neutrofili può portare a danni indiscriminati ai tessuti, come l'artrite reumatoide (RA). Neutrophils isolato dall'estuoper peritoneale rispondono a un chemioattraente definito, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro nei saggi della camera Transwell o zigzag. L'esperimento della sacca d'aria può essere utilizzato per valutare la chemiotassi dei neutrofili verso il lipopolissaccharide (LPS) in vivo. Il modello murino dell'artrite adiuvante (AA) è spesso usato nella ricerca RA, e la colorazione immunostochimica di sezioni congiunte con anticorpi anti-mieloperossia (MMP) o elagasi anti-neutrofili (NE) è un metodo ben consolidato per misurare infiltrazione neutrofila. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire terapie promettenti che prendono di mira la migrazione dei neutrofili.

Le cellule di essutazione peritoneale sono state raccolte dal liquido di lavaggio dei topi. Le celle sono state risospese in 1 mL di RPMI-1640 mezzo completo, sovrapposte a due fasi (54,8%/70,2%) sfumatura di densità discontinua (Figura 1A) e centrifugate a 1.500 x g per 30 min. Neutrophils (-95%, 1 x 107 neutrofili/topo) sono state recuperate dall'interfaccia inferiore (Figura 1B</str...

Qui, presentiamo tre metodi per valutare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili sia in vivo che in vitro. Questi metodi possono essere utilizzati per scoprire promettenti terapie mirate alla migrazione dei neutrofili.

Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Questo metodo cerca di descrivere tre metodi frequentemente utilizzati per valutare la migrazione dei neutrofili normali in vivo e in vitro, nonché l'infiltrazione di neutrofili patologici nel modello di artrite del topo. Riteniamo che questo metodo potrebbe essere utile per altri ricercatori in questo campo. Questo protocollo contiene i dettagli metodologici per valutare la capacità migratoria dei neutrofili nei siti di infiammazione utilizzando il test della busta d'aria e l'artrite indotta da adiuvanti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia dell'artrite confrontando il gruppo di modelli con il gruppo di trattamento. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sulle malattie infiammatorie e può essere applicato alla malattia infiammatoria intestinale. A dimostrare la procedura saranno Qingyi Lu e Haixu Jiang, studenti post-laurea del nostro laboratorio.Dopo l'anestesia dei topi il giorno zero, utilizzare un filtro da 0,22 micron collegato a una siringa da cinque millilitri per ottenere un volume di tre millilitri di aria sterilizzata. Sollevare la pelle posteriore del topo anestetizzato con una pinzetta e utilizzare per via sottocutanea un ago da 26 calibro per 3/8 pollici per iniettare tre millilitri dell'aria sterilizzata. Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità respiratoria e metterli in una gabbia ben impostata.Monitora i topi per assicurarti che siano vivi fino a quando non iniziano a muoversi. Il terzo giorno, iniettare altri tre millilitri di aria sterilizzata nella tasca dell'aria precedentemente stabilita per sostenere la busta d'aria. Il sesto giorno, iniettare diversi trattamenti nella busta d'aria.Iniettare un millilitro di PBS come controllo negativo e iniettare un millilitro di un microgrammo per millilitro LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale. Dopo sei ore, sacrifica i topi. Per ogni sacchetto d'aria, iniettare un millilitro di tampone di lavaggio per lavare la busta d'aria e raccogliere l'essudato infiammatorio in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Quindi lavare la busta d'aria con due millilitri di tampone di lavaggio due volte e raccogliere l'essudato infiammatorio nello stesso tubo di centrifuga. Centrifuga a 100 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di tampone di lavaggio.Contare le cellule per quantificare il rapporto neutrofilo utilizzando l'analizzatore di ematologia automatica. Sospendere l'adiuvante completo di Freund vortice di almeno cinque secondi, quindi disegnare 100 microlitri di sospensione in un iniettore di insulina. Dopo l'anestetismo, contrassegnare la zampa scelta e iniettare 20 microlitri del coadiuvante completo di Freund dall'iniettore in quattro punti periarticolari sullo spazio dell'articolazione della caviglia.Metti i topi lavorati nella nuova camera. Monitora i topi per assicurarti che respirino fino a quando non riacquistano la capacità di muoversi. Ogni tre giorni, utilizzare uno spessore tascabile per misurare il diametro dell'articolazione della caviglia.Inoltre, valutare la gravità dell'artrite in base al criterio di punteggio dell'artrite. Zero è normale. Nessuna prova di eritema e gonfiore.Uno è l'artrite più lieve. Eritema e lieve gonfiore confinato ai tarsali o all'articolazione della caviglia. Due è l'artrite moderata.Eritema e lieve gonfiore che si estende dalla caviglia ai tarsali. Tre è la grave artrite. Eritema e gonfiore moderato che si estende dalla caviglia alle articolazioni metatarsali.Quattro è l'artrite più grave. L'eritema e il forte gonfiore comprendono la caviglia, il piede e le cifre, o anchilosi dell'arto. Dopo aver sacrificato il mouse, rimuovere la pelle e parte del muscolo dalla gamba posteriore con pinzette e forbici.Spruzzare l'articolazione con il 70% di etanolo e rimuovere il resto dei muscoli utilizzando un tovagliolo di carta. Fissare l'articolazione della caviglia in paraformaldeide al 4% per due giorni a temperatura ambiente. Quindi decalcificare il giunto in EDTA al 10% per un mese a temperatura ambiente e cambiare il mezzo settimanale.Dopo un mese, posizionare il tessuto in uno stampo marcato con un certo volume di paraffina liquida a circa 60 gradi Celsius per incorporare il tessuto. Raffreddare brevemente. Impostare lo spessore sul microtomo a quattro micrometri e tagliare le fette.Quindi galleggiare le sezioni in un bagno d'acqua di 43 gradi Celsius per un breve periodo per espandere le sezioni. Montare le sezioni su scivoli e mettere gli scivoli nel forno a 70 gradi Celsius per due ore. Per un uso futuro, conservare le diapositive a meno 20 gradi Celsius.Quindi, posizionare le diapositive in un rack ed eseguire lavaggi in xilene ed etanolo secondo il manoscritto per reidratare a temperatura ambiente. Infine, lavare in acqua corrente del rubinetto per tre minuti. Quindi macchiare la soluzione verde veloce dello 0,1% per cinque minuti.Risciacquare in acido acetico all'1% per 10 secondi e macchiare in soluzione di colorazione 0,1%Safranin O per 20 minuti. Successivamente, immergere le diapositive nelle soluzioni di lavaggio dello xilene e dell'etanolo secondo il manoscritto. Montare le sezioni di tessuto sullo stadio dell'oggetto e osservare i tessuti al microscopio.Per visualizzare i neutrofili, eseguire la colorazione immunoistochimica cuocendo prima le sezioni di paraffina per due ore a 78 gradi Celsius. Posizionare le diapositive in un rack ed eseguire i lavaggi di xilene, etanolo, acqua e PBS secondo il manoscritto per reidratarsi a temperatura ambiente. Quindi aggiungere una goccia di tampone di permeabilizzazione per coprire il tessuto.Incubare le sezioni in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Evitare di risciacquare direttamente il tessuto.Successivamente, eseguire il recupero dell'epitopo dell'antigene indotto dal calore. Disporre le diapositive in un rack. Immergere le diapositive nella caldaia a pressione riempita con tampone di recupero.Mettere la caldaia a pressione nel forno a microonde e impostare il forno a microonde a 600 watt e riscaldare gli scivoli per 10 minuti. Dopo l'ebollizione, mantenere le diapositive nella caldaia raffreddare a 90 gradi Celsius. Esezioni le diapositive e sciacquarle in PBS per tre minuti tre volte.Per placare l'attività endogena della perossidasi, immergere i vetrini in perossido di idrogeno appena preparato al 3% a temperatura ambiente per 15 minuti. Risciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Delineare un grande cerchio intorno al campione con una penna idrofobica.Evitare di toccare il campione. Aggiungere al campione da 50 a 100 microlitri di albumina di siero bovino al 3% per bloccare e posizionare i campioni in una camera controllata dall'umidità a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi rimuovere la soluzione di blocco.Aggiungere rapidamente 50 microlitri di anticorpi primari diluiti PBS a ciascuna sezione. Incubare gli scivoli in un vassoio controllato dall'umidità a quattro gradi Celsius durante la notte. Il secondo giorno, eserti dal vassoio e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Aggiungere 50 microlitri di anticorpi secondari diluiti PBS ai tessuti. Incubare i vetrini in un vassoio controllato dall'umidità a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi sciacquare le diapositive in PBS per tre minuti tre volte. Sviluppare in soluzione DAB diluita per cinque minuti. Evitare lo sviluppo di un colore scuro causato dalla reazione eccessiva del DAB.Risciacquare gli scivoli in acqua distillata. Controsostenere le diapositive in ematossilina per 10 secondi e sciacquare gli scivoli in acqua del rubinetto per cinque minuti. Risciacquare in alcol acido soluzione di differenziazione super veloce per tre secondi, quindi risciacquare in acqua del rubinetto per 10 minuti.Immergere le diapositive nei lavaggi di etanolo e xilene a temperatura ambiente secondo il manoscritto. Fissare il coperchio con la soluzione di montaggio. Osservare il tessuto al microscopio.In questo studio, sono stati eseguiti esperimenti di sacchetto d'aria per indagare il reclutamento di neutrofili stimolato dall'LPS in vivo. I sottoinsiemi di leucociti negli essudati della busta d'aria erano molto più alti che nel controllo. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo di artrite indotta da coadiuvanti ha mostrato un edema significativo nella zampa.Il diametro dell'articolazione della caviglia è aumentato e il punteggio di artrite è aumentato costantemente. Il danno alla cartilagine è la sindrome rappresentativa dell'artrite reumatoide. La sfida CFA ha indotto una grande quantità di infiltrazione di leucociti, significativa erosione della cartilagine e iperplasia sinoviale.Mpo in qualsiasi livello di espressione sono marcatori rappresentativi di infiltrazione neutrofila che sono stati significativamente upregolati nella sezione articolare. Assicurarsi che l'aria sia iniettata nella pelle, ma non nel muscolo. Possiamo anche studiare la formazione di trappole extracellulari neutrofile mediante colorazione immunoistochimica delle sezioni del tessuto articolare della caviglia con anti-p84 o Questi metodi possono essere utilizzati per studiare altre malattie infiammatorie come la malattia infiammatoria intestinale.

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Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Questo video mostra l'imaging in vivo per studiare le dinamiche di reclutamento dei neutrofili in un sito di infezione in un topo transgenico immunocompromesso con neutrofili che esprimono GFP. Comporta l'iniezione di batteri luminescenti per causare un'infezione. Ciò porta al reclutamento di neutrofili nel sito di infezione, il cui tracciamento viene effettuato mediante imaging.

Monitoraggio delle dinamiche di reclutamento dei neutrofili e della carica batterica nel sito di infezione in un modello murino

Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

La migrazione transeteliale neutrofila in risposta all'infezione batterica della mucosa contribuisce alla lesione epiteliale e alla malattia clinica. È stato sviluppato un modello in vitro che combina agenti patogeni, neutrofili umani e strati cellulari epiteliali umani polarizzati coltivati su filtri transwell per facilitare le indagini verso lo svelamento dei meccanismi molecolari che orchestrano questo fenomeno.

In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Abbiamo sviluppato un modello in vitro che imita un componente importante della risposta infiammatoria acuta durante l'infezione della vescica con uropatogeni Escherichia coli. Il transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili consente la valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili umana attraverso vescica epiteli, coltivate su supporti permeabili, in risposta a infezioni batteriche o di sostanze chemoattractant.

La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la presenza di neutrofili in sezioni di istologia fisso/permeabilizzate e valutare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati dal vivo. In particolare, il peptide di40 MUB associa la lattoferrina presente nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. L'esposizione del contenuto granello tramite permeabilizzazione o l'attivazione del neutrofilo permette per la marcatura dei neutrofili.

Il Peptide di40 MUB per uso nella rilevazione eventi infiammatori mediato dai neutrofili

Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell'orecchio di topi anestetizzati.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

Impara a rilevare la migrazione e l'infiltrazione dei neutrofili nei topi utilizzando l'air pouch assay e il modello di artrite indotta da adiuvante. Questi metodi supportano lo sviluppo di terapie mirate per malattie infiammatorie.

Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

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