Name: Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri strategie di biostampa 3D con idrogel GelMA per applicazioni biomediche e ingegneria tissutale. Questo metodo migliora la stampabilità e supporta la ricerca su terapie per danni agli organi.

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Questo lavoro è stato sponsorizzato dal National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703000), dalla National Nature Science Foundation of China (No.U1609207, 81827804), dal Science Fund for Creative Research Groups della National Natural Science Fondazione della Cina (n. 51821093).

1. Coltura cellulare
<ol><li>Preparare il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina / streptomicina, utilizzato per la coltura di cellule tumorali umane (MDA-MB-231) linee e linee di cellule endoteliali ombalimpibili umane (HUVEC).</li>
	<li>Preparare Il DMEM con L-glutamine (DMEM/F-12), integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, utilizzati per colture di linee di cellule staminali mesenchymale midollo osseo (BMSC).</li>
	<li>Impostare l'ambiente di coltura come 37 e 5% CO2. Cultura MDA-MB-231, HUVEC e BMSC, e passare le cellule in un rapporto 1:2 quando viene raggiunto il 90% di confluenza.</li>
</ol>2. Fabbricazione di microsfere Di GelMA
<ol><li>Stampare l'apparecchio come Figura 1A con acido polilattico (PLA) su una stampante FDM (Modello di deposizione fusa). Posizionare due elettrodi ad anello metallico nell'apparecchio.</li>
	<li>Collegare i due elettrodi ad anello metallico rispettivamente con pali a terra e positivi. Posizionare la piastra metallica collegata con l'alta tensione sotto l'elettrodo dell'anello e posizionare una piastra Petri con olio di silicio sulla piastra metallica come ricevitore di gocciolina.</li>
	<li>Sciogliere GelMA liofilizzato (5% w/v) e fenile al litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP, 0,5% w/v) nella saliina con fosfato di Dulbecco (DPBS) come bioink (10 mL). Filtrare il bioinchiostro con un filtro da 0,22 m per la sterilità e riscaldarlo in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 minuti.</li>
	<li>Staccare le celle MDA-MB-231 con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi. Centrifugare le cellule in un tubo centrifuminale da 15 mL a 100 x g per 5 min per ottenere un pellet cellulare.</li>
	<li>Togliete il super-acletterante. Mescolare il pellet cellulare con 1 mL di bioinchiostro preparato pipettandolo lentamente per prevenire la produzione di bolle.</li>
	<li>Mettere 1 mL di bioinchiostro (MDA-MB-231) in una siringa sterile da 3 mL. Alimentare il bioinchiostro con la forza dell'aria compressa (0,5 kPa). Mettere la siringa sull'apparecchio. NOTA: L'ambiente di stampa deve essere rigorosamente controllato ad una temperatura di 30 gradi centigradi e un'umidità del 50%.</li>
	<li>Accendere l'alimentazione ad alta tensione e impostare la tensione su 0-4 kV. Contemporaneamente, accendere la luce a lunghezza d'onda da 405 nm per incrociare le goccioline GelMA in 5 mL di olio di silicio.</li>
	<li>Versare la maggior parte dell'olio di silicio decantando la parabola Petri. Trasferire l'olio di silicio rimasto e le microsfere Di GelMA in un tubo centrifugo da 15 mL utilizzando un cucchiaio.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di DPBS e agitare uniformemente la miscela. Centrifugare il tubo a 100 x g per 5 min e rimuovere il liquido supernatante.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.9 3x.</li>
	<li>Estrarre le microsfere di GelMA con un cucchiaio e colture in DMEM in un piatto di Petri a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 3 giorni.</li>
	<li>Eliminare il mezzo e lavare le microsfere con DPBS. Fissare con 2 mL di 4% paraformaldeide (PFA) per 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Eliminare il PFA e lavare le microsfere con DPBS. Permeabilizzare con 2 mL dello 0,5% di surfactant nonionico (cioè Triton X-100) per 5 min a RT.</li>
	<li>Eliminare il surfactant nonionico e lavare le microsfere con DPBS. Macchiarli con 2 mL di tetramethylrhodamine (TRITC) phalloidin per 30 min nel buio a RT.</li>
	<li>Eliminare il TRITC e lavare le microsfere con DPBS. Colorali con 2 mL di 4-,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) per 10 min al buio a RT.</li>
	<li>Eliminare il DAPI e lavare le microsfere con DPBS. Cattura la morfologia con un microscopio a fluorescenza confocale.</li>
</ol>3. Fabbricazione di fibre GelMA
<ol><li>Preparare un ugello coassiale come illustrato nella Figura 2A. Fissare un ugello interno (25 G, OD - 510 m, ID - 250 m) e un ugello esterno (18 G, OD , 1200 m, ID - 900 m) con saldatura. Collegare un tubo di vetro (lunghezza 50 mm, diametro interno 1,2 mm) all'estremità dell'ugello coassiale.</li>
	<li>Sciogliere la polvere di alginato di sodio (Na-Alg) che viene sterilizzata sotto la luce ultravioletta (UV) per 30 min in acqua deionizzata al 2% (w/v).</li>
	<li>Preparare una soluzione sterile di bioinchiostro dopo il passaggio 2.3. Riscaldare il bioink GelMA e la soluzione Na-Alg in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 minuti.</li>
	<li>Staccare le celle BMSCs con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi. Centrifugare le cellule in un tubo centrifuminale da 15 mL a 100 x g per 5 min per ottenere un pellet cellulare.</li>
	<li>Rimuovere il liquido supernatante. Mescolare il pellet cellulare con 2 mL di bioinchiostro GelMA preparato pipettandolo lentamente per prevenire la produzione di bolle.</li>
	<li>Mettere 2 mL di bioinchiostro (BMSC) in una siringa da 10 mL. Mettere 2 mL di soluzione Na-Alg in un'altra siringa (10 mL). Alimentarli con due pompe di siringhe, rispettivamente (qui, bioink a 50 m/min e Na-Alg soluzione a 350 m/min). NOTA: L'ambiente di stampa deve essere rigorosamente controllato ad una temperatura di 30 gradi centigradi e un'umidità del 50%.</li>
	<li>Accendere la luce di lunghezza d'onda da 405 nm per irradiare il tubo trasparente per incrociare le fibre GelMA. Utilizzare un piatto Petri con DPBS per ricevere le fibre.</li>
	<li>Estrarre le fibre gelMA con un cucchiaio da DPBS e colture per 3 giorni nel preparato DMEM / F-12 in 37 C e 5% CO2.</li>
	<li>Seguite i passi da 2,12 a 2,16 per preparare le fibre gelMA per l'osservazione morfologica con un microscopio a fluorescenza confocale.</li>
</ol>4. Fabbricazione di complesse strutture 3D GelMA
NOTA: La figura 3A mostra lo schizzo di fabbricazione delle complesse strutture 3D GelMA.
<ol><li>Pulire il biotipo DLP (Figura 3E) con il 75% di alcol ed esporlo all'irradiazione UV per 30 min per la sterilità.</li>
	<li>Sciogliere gelMA liofilizzato (10% w/v) e LAP (0,5% w/v) in DPBS. Aggiungere pigmento magenta commestibile nella soluzione (3% v/v) per migliorare la precisione di stampa.</li>
	<li>Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 m per la sterilità e riscaldarla in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 minuti.</li>
	<li>Costruisci i modelli 3D con un software CAD (Computer-Aided Design). Importare i documenti del modello nel software superiore (EFL) del biostampante DLP applicato.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di bioinchiostro preparato nella depressione del biostampante DLP.</li>
	<li>Impostare i parametri di stampa nel software superiore come segue: intensità della luce: 12 mW/cm2, durata dell'irradiazione e 30 s, e altezza della fetta è pari a 100 m. Avviare la stampa.</li>
	<li>Togliere la struttura stampata dal biotipografo e immergerla in DPBS in un piatto Petri.</li>
	<li>Scollegare le celle MDA-MB-231s con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 . Centrifuga cellule a 100 x g per 5 min in un tubo da 15 mL per ottenere un pellet cellulare.</li>
	<li>Rimuovere il liquido supernatante e mescolare il pellet cellulare con 2 mL di DMEM.</li>
	<li>Aggiungere 100 l di sospensione cellulare sulle strutture stampate. Coltivanoli per 3 giorni nel DMEM preparato a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.</li>
	<li>Seguite i passi 2.12-2.16 per preparare le complesse strutture 3D per l'osservazione morfologica con un microscopio a fluorescenza confocale.</li>
</ol>5. Fabbricazione di chip microfluidici basati su GelMA
NOTA: La figura 4A mostra lo schizzo di fabbricazione del chip microfluidico basato su GelMA.
<ol><li>Sciogliere gelata 10% (w/v) e LAP (0,5% w/v) in DPBS. Filtrare la soluzione GelMA con un filtro da 0,22 m per ottenere sterilità.</li>
	<li>Sterilizzare la polvere di gelatina sotto la luce UV per 30 min e aggiungerla alla soluzione GelMA-LAP preparata al punto 5.1 ad una concentrazione finale di gelatina del 5% (w/v). Riscaldare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 15 minuti.</li>
	<li>Progettare un gruppo di stampi (Figura 4B,C) con il software CAD e fabbricarli con resina fotopolimerica su una stampante DLP.</li>
	<li>Riempire completamente gli stampi con il bioink preparato.</li>
	<li>Mettete gli stampi in un frigorifero a 4 gradi per incrociare la gelatina per 30 min.</li>
	<li>Rimuovere gli stampi e deformare con una lama i fogli idrogel parzialmente (fisicamente) incrociati dagli stampi.</li>
	<li>Combinare i due fogli di idrogel demolded e legarli con l'aiuto di GelMA irradiando a 405 nm per 1 min.</li>
	<li>Staccare le celle HUVEC con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi. Centrifuga cellule in un tubo centrifuminale da 15 mL per ottenere un pellet cellulare a 100 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il liquido supernatante e mescolare il pellet cellulare con 2 mL di DMEM.</li>
	<li>Riempire completamente il microcanale iniettando la sospensione cellulare con un ugello e una siringa.</li>
	<li>Capovolgere il chip a testa in giù ogni 15 minuti durante i prossimi 3 h per ottenere una semina uniforme e completa delle cellule. Cultura le patatine nel piatto Petri per 3 giorni nel DMEM preparato a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.</li>
	<li>Seguite i passi da 2,12 a 2,16 per preparare i chip microfluidici per l'osservazione morfologica con un microscopio a fluorescenza confocale.</li>
</ol>

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<li>Sugimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+bio-blood-vessels+constructed+using+a+tissue-specific+bioink+and+3D+coaxial+cell+printing+technique%3A+a+novel+therapy+for+ischemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease.</a> Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo descrive diverse strategie per fabbricare strutture 3D GelMA, vale a dire microsfere Di GelMA, fibre GelMA, strutture complesse GelMA e chip microfluidici basati su GelMA. GelMA ha promettenti capacità di biocompatibilità e formazione ed è ampiamente utilizzato nel campo della biofabbricazione. Le strutture della microsfera sono adatte per il rilascio controllato di farmaci, la coltura dei tessuti e l'iniezione negli organismi per un'ulteriore terapia21,<sup class="xref"...

Si ritiene che gli idrogel siano un materiale adatto nel campo della biofabbricazione1,2,3,4. Tra questi, la gelatina methacryloyl (GelMA) è diventata uno dei biomateriali più versatili, inizialmente proposto nel 2000 da Van Den Bulcke et al.5. GelMA è sintetizzata dalla reazione diretta della gelatina con anidrato methacril (MA). La gelatina, idrolizzata dal collagene mammifero, è composta da motivi bersaglio della matrice metalloproteinasi (MMP). Così, i modelli di tessuto tridimensionale in vitro (3D) stabiliti da GelMA possono idealmente imitare le interazioni tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM) in vivo. Inoltre, le sequenze di acido arginina-glicina-aspartico (RGD), che sono assenti in alcuni altri idrogel come gli alginati, rimangono sulle catene molecolari di GelMA. Questo permette di realizzare l'attaccamento di cellule incapsulate all'interno delle reti idrogel6. Inoltre, la capacità di formazione di GelMA è promettente. I gruppi di methacrilmide sulle catene molecolari di GelMA reagiscono con il fotoinitiatore in condizioni di reazione mite e formano legami covalenti dopo l'esposizione all'irradiazione leggera. Pertanto, le strutture stampate possono essere rapidamente incrociate per mantenere le forme progettate in modo semplice.
Sulla base di queste proprietà, una serie di campi utilizzano GelMA per eseguire varie applicazioni, come l'ingegneria tissutale, l'analisi citologia di base, lo screening farmacologico e il biosensing. Di conseguenza, sono state dimostrate anche varie strategie di fabbricazione7,8,9,10,11,12,13,14. Tuttavia, è ancora difficile effettuare la biostampa 3D basata su GelMA, che è dovuta alle sue proprietà fondamentali. GelMA è un materiale sensibile alla temperatura. Durante il processo di stampa, la temperatura dell'atmosfera di stampa deve essere rigorosamente controllata per mantenere lo stato fisico del bioinchiostro. Inoltre, la viscosità di GelMA è generalmente inferiore rispetto ad altri idrogel comuni (ad esempio, alginato, chitosano, acido ialuronico, ecc.). Tuttavia, altri ostacoli si trovano ad affrontare quando si costruisce architetture 3D con questo materiale15.
Questo articolo riassume diversi approcci per la biostampa 3D di GelMA proposta dal nostro laboratorio e descrive i campioni stampati (ad esempio, la sintesi di microsfere Di GelMA, fibre GelMA, strutture complesse GelMA e chip microfluidici basati su GelMA). Ogni metodo ha funzioni specializzate e può essere adottato in diverse situazioni con requisiti diversi. Le microsfere GelMA sono generate da un modulo elettroassistito, che forma una forza elettrica esterna aggiuntiva per ridurre la dimensione delle goccioline. In termini di fibre di GelMA, sono estruso da un ugello biostampa coassiale con l'aiuto di alginato di sodio viscoso. Inoltre, la creazione di strutture 3D complesse si ottiene con un biostampa digitale di elaborazione della luce (DLP). Infine, viene proposta una strategia di collegamento due volte per costruire chip microfluidici basati su GelMA, combinando idrogel GelMA e chip microfluidici tradizionali. Si ritiene che questo protocollo sia una sintesi significativa delle strategie di biostampa Di GelMA utilizzate nel nostro laboratorio e possa ispirare altri ricercatori in campi relativi.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; m membrana filtrante</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(4-amidinofenil)-6-indolecarbamidina dicloridrato (DAPI)</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter 3D</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luce a lunghezza d'onda 405nm</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ugello coassiale</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio a fluorescenza confocale</td><td>OLYMPUS FV3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bioprinter per l'elaborazione digitale della luce (DLP)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampante DLP</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium con L-glutammina (DMEM/F-12)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFL Software</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Sigma-Aldrich, Shanghai, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gelatina metacriloil (GelMA)</td><td>SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Istituto</td><td>di ricerca sulla produzione intelligente di SuZhou, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenil-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td>Istituto di ricerca sulla produzione intelligente di SuZhou, SuZhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alginato di sodio (Na-Alg)</td><td>Sigma-Aldrich, Shanghai, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falloidina TRITC</td><td>Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Co., Ltd., Shanghai, Cina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolli di biostampa 3d di gelatin abasecryloyl hydrogel based bioinks

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

La gelatina methacryloyl (GelMA) è diventata un biomateriale popolare nel campo della biostampa. La derivazione di questo materiale è la gelatina, che è idrolizzata dal collagene mammifero. Così, le sequenze di acido arginina-glicina-aspartico (RGD) e i motivi bersaglio della matrice metalloproteinasi (MMP) rimangono sulle catene molecolari, che aiutano a raggiungere l'attaccamento e la degradazione delle cellule. Inoltre, le proprietà di formazione di GelMA sono versatili. I gruppi di methacrilmide permettono a un materiale di diventare rapidamente incrociato sotto irradiazione leggera in presenza di un fotoinitiatore. Pertanto, ha molto senso stabilire metodi adatti per sintetizzare strutture tridimensionali (3D) con questo materiale promettente. Tuttavia, la sua bassa viscosità limita la stampabilità di GelMA. Qui sono presentati metodi per realizzare la biostampa 3D di idrogel GelMA, vale a dire la fabbricazione di microsfere Di GelMA, fibre GelMA, strutture complesse GelMA e chip microfluidici basati su GelMA. Vengono discusse le strutture risultanti e la biocompatibilità dei materiali e dei metodi di stampa. Si ritiene che questo protocollo possa fungere da ponte tra i biomateriali applicati in precedenza e GelMA, oltre a contribuire alla creazione di architetture 3D basate su GelMA per applicazioni biomediche.

Durante la fabbricazione delle microsfere GelMA, le goccioline GelMA sono state separate dalla forza di campo elettrico esterna. Quando le goccioline sono cadute nell'olio di silicio ricevente, sono rimaste a forma standard di sferoide senza code. Questo perché le goccioline GelMA erano in una fase acquosa, mentre l'olio di silicio era in una fase di olio. La tensione superficiale che si è formata tra le due fasi ha causato le goccioline GelMA mantenere una forma standard sferoide. In termini di microsfere cariche di cel...

Presentato qui è un metodo per la biostampa 3D di gelatina methacryloyl.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

La bionica a base di idrogel GelMA diventa molto popolare nella biostampa 3D. Tuttavia, la bassa viscosità ne limita la stampabilità. Qui stiamo condividendo strategie per la stampa di GelMA nel nostro laboratorio con altri ricercatori.In questo video utilizziamo appieno le proprietà speciali di questo biomateriale e proponiamo diversi metodi di stampa per diverse strutture 3D che potrebbero contribuire ad ulteriori applicazioni biomediche. Per prendere i danni agli organi, ad esempio, è possibile utilizzare le implicazioni nella terapia corrispondente iniettando incorporamento o tracciando le strutture GelMA stampate. Non sarebbe facile sciogliere completamente il GelMA liofilizzato in breve tempo.Per accelerare il processo di dissoluzione potrebbe essere utilizzato un miscelatore a vortice. Ogni biomateriale utilizzerà proprietà speciali intime di GelMA. Ho suggerito che un nuovo chemer dovrebbe fare correttamente una passeggiata di ciò che è fondamentale per il condizionamento durante la stampa.I dettagli dell'operazione determinano il successo delle procedure di stampa. Ecco perché scegliamo una dimostrazione visiva da condividere con altri ricercatori. Per fabbricare le microsfere iniziare collegando i due elettrodi ad anello metallico con poli terrestri e positivi.Posizionare la piastra metallica collegata con l'alta tensione sotto l'elettrodo ad anello e una piastra di Petri con olio di silicio sulla piastra metallica come ricevitore a goccia. Preparare il bio-inchiostro sciogliendo gelMA liofilizzato e LAP e DPBS filtrarlo attraverso il filtro da 0,22 micrometri per la sterilità, quindi scaldarlo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Staccare le celle MDA-MB-231 con tre millilitri dello 0,25% di tripina e della soluzione EDTA allo 0,02% per tre minuti a 37 gradi Celsius.Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugarle a 100 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e mescolare le cellule con un millilitro di bio-inchiostro preparato tubazionando lentamente su e giù assicurandosi di evitare bolle d'aria. Aspirare un millilitro della miscela bio-inchiostro e cellulare in una siringa sterile da tre millilitri.Alimentare il bio-inchiostro con la forza dell'aria compressa e mettere la siringa sull'apparecchio. Accendere la potenza ad alta tensione e impostare la tensione su zero su quattro kilovolt. Accendi contemporaneamente la luce a lunghezza d'onda di 405 nanometri per collegare le goccioline GelMA in cinque millilitri di olio di silicio.Decantare la piastra di Petri per sbarazzarsi della maggior parte dell'olio di silicio e utilizzare un cucchiaio per trasferire l'olio rimanente e le microsfere in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di DPBS e agitare la miscela centrifugare il tubo a 100 volte G e rimuovere il supernatante. Trasferire le microsfere in una piastra di Petri con DMEM e culturerle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre giorni.Dopo tre giorni scartare il mezzo e lavare le microsfere con DPBS. Fissarli con due millilitri del quattro percento di PFA per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare la PFA e ripetere il lavaggio. Permeabilizzare le cellule con due millilitri dello 0,5% di tensioattivo non ionico per cinque minuti a temperatura ambiente scartare il tensioattivo e lavare le microsfere con DPBS.Successivamente macchiare le cellule con TRITC-phalloidin per 30 minuti, quindi DAPI per 10 minuti al buio scartando i coloranti e lavando le sfere con DPBS dopo ogni colorazione. Immagini le microsfere con un microscopio a fluorescenza confocale. Sciogliere la polvere di alginato di sodio sterilizzata in acqua deionizzata con un rapporto peso/volume del due per cento.Preparare la soluzione sterile di bioinchiostrato come descritto in precedenza, quindi riscaldare il bioinchiore e l'alginato di sodio in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Tripinare e centrifugare i bSPC secondo la procedura precedentemente descritta per le cellule MDA-MB 231, quindi rimuovere il liquido supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 2 millilitri del bioinchiostrato GelMA. Aspirare due millilitri della miscela di cellule a bioinchiostrato in una siringa da 10 millilitri e due millilitri della miscela di alginato di sodio in un'altra siringa.Alimentare le soluzioni con due pompe per siringhe bio-inchiostro a 50 micrometri al minuto e alginato di sodio a 350 micrometri al minuto. Accendere la luce a lunghezza d'onda di 405 nanometri per irradiare il tubo trasparente e collegare le fibre GelMA. Utilizzare una piastra di Petri per ricevere le fibre e raccoglierle con un cucchiaio.Trasferire le fibre in un piatto con DMEM / F12 e culturerle per tre giorni a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica. Dopo aver coltivato le cellule seguire le indicazioni precedentemente descritte per osservare le fibre sotto un microscopio a fluorescenza confocale. Sciogliere gelMA liofilizzato e LAP e DPBS e aggiungere pigmento commestibile magenta nella soluzione per migliorare la precisione di stampa.Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micrometri per la sterilità e scaldarla in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Costruisci i modelli 3D con il software CAD e importa i documenti del modello nel software superiore del biostampa DLP applicato. Aggiungere dieci millilitri del biochi inchiostro preparato al trogolo del biostampa.Impostare i parametri di stampa in base alle indicazioni del manoscritto, quindi iniziare a stampare. Al termine rimuovere la struttura stampata dal biostampa e immergerla in DPBS in una piastra di Petri. Staccare e pellet le celle MDA-MB 231 come descritto in precedenza.Resuspend loro con due millilitri di DMEM e aggiungere la sospensione alla struttura stampata. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al cinque per cento per tre giorni, quindi preparare le strutture per l'osservazione con un microscopio a fluorescenza confocale come descritto in precedenza. Preparare una soluzione LAP dal peso del 10% al volume e dello 0,5% da peso a volume, quindi filtrarla attraverso un filtro da 0,22 micrometri.Sterilizzare la polvere di gelatina sotto la luce UV per 30 minuti e aggiungerla alla soluzione GelMA LAP con un rapporto peso/volume del cinque percento. Scaldare la miscela in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Riempire gli stampi con il bio-inchiostro preparato e metterli in un frigorifero di quattro gradi Celsius per 30 minuti.Utilizzare una lama per rimuovere i fogli idrogel parzialmente incrociati dagli stampi. Combina fogli di idrogel stampati in 2D e incollali con GelMA irradiando a 405 nanometri per un minuto. Gli HUVEC staccati e pellet mescolano le cellule con due millilitri di DMEM e iniettano la sospensione nel microcanale con l'ugello e la siringa.Per le prossime tre ore capovolgere il chip ogni 15 minuti per ottenere posti a sedere in cella uniformi e completi. Coltura i trucioli in una piastra di Petri per tre giorni in DMEM a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al cinque per cento, quindi prepararli per l'osservazione morfologica. Quando le goccioline GelMA caddero nell'olio di silicone ricevente mantennero una forma sferoide standard senza code.Le celle incapsulate che sperimentano la forza di campo elettrica ad alta tensione hanno mantenuto la loro capacità di diffusione che ha verificato la biocompatibilità del metodo di fabbricazione elettro-assistita. Una stampante bio DLP è stata scelta per fabbricare strutture GelMA con forme più complesse come l'orecchio del naso e la camera multicamera. HUVEC seminati attaccati ai materiali GelMA e distribuiti sulla superficie delle strutture GelMA incrociate dimostrando che questa applicazione ha un potenziale per l'ingegneria tissutale.Una strategia di cross-linking due volte è stata utilizzata per fabbricare chip microfluidici basati su GelMA. I trucioli con vari microcanali sono stati costruiti progettando diversi stampi su richiesta e gli HUVEC sono stati seminati nei canali e attaccati alla parete del canale formando la forma macroscopica del vaso. La sorgente ad alta tensione viene applicata quando si fabbricano microsfere.I ricercatori devono esaminare il circuito prima e non toccare i millibar esposti che proteggono gli operatori o rendono le cellule da un danno da cortocircuito. La base d'acqua ad ultrasuoni potrebbe essere un'altra scelta per accelerare la velocità meritevole. Sicuramente questo contributo ha riassunto i metodi di biostamma 3D di GelMA nel nostro laboratorio.I ricercatori potrebbero fare riferimento al video e migliorare o espandere le strategie di stampa per soddisfare ulteriori requisiti biomedici.

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Il video mostra il processo di creazione di un costrutto biostampato in 3D utilizzando astrociti sospesi in una soluzione bioink. Il costrutto biostampato, dopo la reticolazione, facilita l'adesione degli astrociti e la loro diffusione, formando un tessuto simile a quello neurale.

Un metodo per la biostampa 3D di astrociti corticali murini

Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l'utilizzo in applicazioni di screening in vitro.

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.

Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks a forma di liquido (gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate.

Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

Qui riportiamo un metodo di bioprinting 3D di astrociti corticali murini per biofabbricare tessuti neurali simili per studiare la funzionalità degli astrociti nel sistema nervoso centrale e i meccanismi che coinvolgono le cellule gliali nelle malattie e nei trattamenti neurologici.

Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l'ingegneria del tessuto neurale

Questo protocollo descrive una tecnica di stampa 3D per fabbricare strutture simili all'osso depositando un inchiostro di fosfato di calcio in un supporto granulare a base di gelatina. Gli analoghi ossei stampati sono depositati in forma libera, con flessibilità per la raccolta diretta della stampa o la reticolazione all'interno di una matrice cellulare vivente per costrutti multifasici.

Bioprinting omnidirezionale ceramico in sospensioni caricate di cellule per la generazione di analoghi ossei

La lavorazione a taglio durante la formazione di idrogel provoca la produzione di sospensioni di microgel che si tagliano sottili ma si ristrutturano rapidamente dopo la rimozione delle forze di taglio. Tali materiali sono stati utilizzati come matrice di supporto per la bioprinting di strutture complesse e cariche di cellule. Qui vengono descritti i metodi utilizzati per produrre il letto di supporto e i bioink compatibili.

Gel fluidi di agarosio formati dalla lavorazione a taglio durante la gelificazione per la bioprinting 3D sospesa

Questo articolo descrive i protocolli per la fabbricazione di microgel di gelatina metacriloile ad alta produttività utilizzando dispositivi microfluidici, la conversione di microgel in polvere risostenibile (micro-aerogel), l'assemblaggio chimico di microgel per formare scaffold di idrogel granulare e lo sviluppo di bioink granulari di idrogel con microporosità conservata per il bioprinting 3D.

Scaffold di idrogel granulare di gelatina metacrilico: fabbricazione di microgel ad alta produttività, liofilizzazione, assemblaggio chimico e bioprinting 3D

Questo articolo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili per studiare l'irrigidimento della matrice extracellulare e l'attivazione dei fibroblasti.

Idrogel fotoregistrabili in bioprinting 3D per studiare l'attivazione dei fibroblasti

Questo studio introduce un nuovo bagno di sospensione sub-microgel di κ-carragenina, che mostra notevoli proprietà di transizione reversibile di inceppamento-sbloccaggio. Questi attributi contribuiscono alla costruzione di tessuti e organi biomimetici nel bioprinting 3D incorporato. La stampa di successo di tessuti simili al cuore/all'esofago con alta risoluzione e crescita cellulare dimostra applicazioni di bioprinting e ingegneria tissutale di alta qualità.

Bioprinting incorporato di strutture simili a tessuti utilizzando il terreno sub-microgel di κ-carragenina

Scopri strategie di biostampa 3D con idrogel GelMA per applicazioni biomediche e ingegneria tissutale. Questo metodo migliora la stampabilità e supporta la ricerca su terapie per danni agli organi.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

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