Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks
21 dicembre 2019
Presentato qui è un metodo per la biostampa 3D di gelatina methacryloyl.
La bionica a base di idrogel GelMA diventa molto popolare nella biostampa 3D. Tuttavia, la bassa viscosità ne limita la stampabilità. Qui stiamo condividendo strategie per la stampa di GelMA nel nostro laboratorio con altri ricercatori.
In questo video utilizziamo appieno le proprietà speciali di questo biomateriale e proponiamo diversi metodi di stampa per diverse strutture 3D che potrebbero contribuire ad ulteriori applicazioni biomediche. Per prendere i danni agli organi, ad esempio, è possibile utilizzare le implicazioni nella terapia corrispondente iniettando incorporamento o tracciando le strutture GelMA stampate. Non sarebbe facile sciogliere completamente il GelMA liofilizzato in breve tempo.
Per accelerare il processo di dissoluzione potrebbe essere utilizzato un miscelatore a vortice. Ogni biomateriale utilizzerà proprietà speciali intime di GelMA. Ho suggerito che un nuovo chemer dovrebbe fare correttamente una passeggiata di ciò che è fondamentale per il condizionamento durante la stampa.
I dettagli dell'operazione determinano il successo delle procedure di stampa. Ecco perché scegliamo una dimostrazione visiva da condividere con altri ricercatori. Per fabbricare le microsfere iniziare collegando i due elettrodi ad anello metallico con poli terrestri e positivi.
Posizionare la piastra metallica collegata con l'alta tensione sotto l'elettrodo ad anello e una piastra di Petri con olio di silicio sulla piastra metallica come ricevitore a goccia. Preparare il bio-inchiostro sciogliendo gelMA liofilizzato e LAP e DPBS filtrarlo attraverso il filtro da 0,22 micrometri per la sterilità, quindi scaldarlo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Staccare le celle MDA-MB-231 con tre millilitri dello 0,25% di tripina e della soluzione EDTA allo 0,02% per tre minuti a 37 gradi Celsius.
Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e centrifugarle a 100 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e mescolare le cellule con un millilitro di bio-inchiostro preparato tubazionando lentamente su e giù assicurandosi di evitare bolle d'aria. Aspirare un millilitro della miscela bio-inchiostro e cellulare in una siringa sterile da tre millilitri.
Alimentare il bio-inchiostro con la forza dell'aria compressa e mettere la siringa sull'apparecchio. Accendere la potenza ad alta tensione e impostare la tensione su zero su quattro kilovolt. Accendi contemporaneamente la luce a lunghezza d'onda di 405 nanometri per collegare le goccioline GelMA in cinque millilitri di olio di silicio.
Decantare la piastra di Petri per sbarazzarsi della maggior parte dell'olio di silicio e utilizzare un cucchiaio per trasferire l'olio rimanente e le microsfere in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di DPBS e agitare la miscela centrifugare il tubo a 100 volte G e rimuovere il supernatante. Trasferire le microsfere in una piastra di Petri con DMEM e culturerle a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre giorni.
Dopo tre giorni scartare il mezzo e lavare le microsfere con DPBS. Fissarli con due millilitri del quattro percento di PFA per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare la PFA e ripetere il lavaggio. Permeabilizzare le cellule con due millilitri dello 0,5% di tensioattivo non ionico per cinque minuti a temperatura ambiente scartare il tensioattivo e lavare le microsfere con DPBS.
Successivamente macchiare le cellule con TRITC-phalloidin per 30 minuti, quindi DAPI per 10 minuti al buio scartando i coloranti e lavando le sfere con DPBS dopo ogni colorazione. Immagini le microsfere con un microscopio a fluorescenza confocale. Sciogliere la polvere di alginato di sodio sterilizzata in acqua deionizzata con un rapporto peso/volume del due per cento.
Preparare la soluzione sterile di bioinchiostrato come descritto in precedenza, quindi riscaldare il bioinchiore e l'alginato di sodio in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Tripinare e centrifugare i bSPC secondo la procedura precedentemente descritta per le cellule MDA-MB 231, quindi rimuovere il liquido supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 2 millilitri del bioinchiostrato GelMA. Aspirare due millilitri della miscela di cellule a bioinchiostrato in una siringa da 10 millilitri e due millilitri della miscela di alginato di sodio in un'altra siringa.
Alimentare le soluzioni con due pompe per siringhe bio-inchiostro a 50 micrometri al minuto e alginato di sodio a 350 micrometri al minuto. Accendere la luce a lunghezza d'onda di 405 nanometri per irradiare il tubo trasparente e collegare le fibre GelMA. Utilizzare una piastra di Petri per ricevere le fibre e raccoglierle con un cucchiaio.
Trasferire le fibre in un piatto con DMEM / F12 e culturerle per tre giorni a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica. Dopo aver coltivato le cellule seguire le indicazioni precedentemente descritte per osservare le fibre sotto un microscopio a fluorescenza confocale. Sciogliere gelMA liofilizzato e LAP e DPBS e aggiungere pigmento commestibile magenta nella soluzione per migliorare la precisione di stampa.
Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micrometri per la sterilità e scaldarla in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Costruisci i modelli 3D con il software CAD e importa i documenti del modello nel software superiore del biostampa DLP applicato. Aggiungere dieci millilitri del biochi inchiostro preparato al trogolo del biostampa.
Impostare i parametri di stampa in base alle indicazioni del manoscritto, quindi iniziare a stampare. Al termine rimuovere la struttura stampata dal biostampa e immergerla in DPBS in una piastra di Petri. Staccare e pellet le celle MDA-MB 231 come descritto in precedenza.
Resuspend loro con due millilitri di DMEM e aggiungere la sospensione alla struttura stampata. Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al cinque per cento per tre giorni, quindi preparare le strutture per l'osservazione con un microscopio a fluorescenza confocale come descritto in precedenza. Preparare una soluzione LAP dal peso del 10% al volume e dello 0,5% da peso a volume, quindi filtrarla attraverso un filtro da 0,22 micrometri.
Sterilizzare la polvere di gelatina sotto la luce UV per 30 minuti e aggiungerla alla soluzione GelMA LAP con un rapporto peso/volume del cinque percento. Scaldare la miscela in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 15 minuti. Riempire gli stampi con il bio-inchiostro preparato e metterli in un frigorifero di quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Utilizzare una lama per rimuovere i fogli idrogel parzialmente incrociati dagli stampi. Combina fogli di idrogel stampati in 2D e incollali con GelMA irradiando a 405 nanometri per un minuto. Gli HUVEC staccati e pellet mescolano le cellule con due millilitri di DMEM e iniettano la sospensione nel microcanale con l'ugello e la siringa.
Per le prossime tre ore capovolgere il chip ogni 15 minuti per ottenere posti a sedere in cella uniformi e completi. Coltura i trucioli in una piastra di Petri per tre giorni in DMEM a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al cinque per cento, quindi prepararli per l'osservazione morfologica. Quando le goccioline GelMA caddero nell'olio di silicone ricevente mantennero una forma sferoide standard senza code.
Le celle incapsulate che sperimentano la forza di campo elettrica ad alta tensione hanno mantenuto la loro capacità di diffusione che ha verificato la biocompatibilità del metodo di fabbricazione elettro-assistita. Una stampante bio DLP è stata scelta per fabbricare strutture GelMA con forme più complesse come l'orecchio del naso e la camera multicamera. HUVEC seminati attaccati ai materiali GelMA e distribuiti sulla superficie delle strutture GelMA incrociate dimostrando che questa applicazione ha un potenziale per l'ingegneria tissutale.
Una strategia di cross-linking due volte è stata utilizzata per fabbricare chip microfluidici basati su GelMA. I trucioli con vari microcanali sono stati costruiti progettando diversi stampi su richiesta e gli HUVEC sono stati seminati nei canali e attaccati alla parete del canale formando la forma macroscopica del vaso. La sorgente ad alta tensione viene applicata quando si fabbricano microsfere.
I ricercatori devono esaminare il circuito prima e non toccare i millibar esposti che proteggono gli operatori o rendono le cellule da un danno da cortocircuito. La base d'acqua ad ultrasuoni potrebbe essere un'altra scelta per accelerare la velocità meritevole. Sicuramente questo contributo ha riassunto i metodi di biostamma 3D di GelMA nel nostro laboratorio.
I ricercatori potrebbero fare riferimento al video e migliorare o espandere le strategie di stampa per soddisfare ulteriori requisiti biomedici.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la biostampa 3D di gelatina metacriloilata (GelMA). Vengono discusse strategie per migliorare la stampabilità della GelMA, fondamentale per numerose applicazioni biomediche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biostampa 3D
- Biomateriali
- Ingegneria biomedica
Sfondo
- I gel idrogelificati a base di GelMA stanno guadagnando popolarità nella biostampa 3D.
- La bassa viscosità della GelMA ne limita la stampabilità.
- Sono necessarie strategie per migliorarne l'applicazione nei settori biomedici.
- Le possibili applicazioni includono la terapia per danni agli organi.
Scopo dello studio
- Condividere strategie di stampa efficaci per il GelMA.
- Esplorare le proprietà specifiche del GelMA per diverse strutture 3D.
- Contribuire allo sviluppo di applicazioni biomediche.
Metodi Utilizzati
- Sfruttamento delle proprietà uniche del GelMA.
- Sviluppo di diversi metodi di stampa.
- Strategie per l'inclusione o il tracciamento di strutture stampate.
- Risoluzione delle difficoltà nella dissoluzione del GelMA liofilizzato.
Risultati principali
- Dimostrate tecniche di stampa efficaci per il GelMA.
- Illustrate potenziali applicazioni in terapia.
- Identificate sfide nella dissoluzione del GelMA.
- Fornite indicazioni per ulteriori ricerche nella biostampa 3D.
Conclusioni
- Metodi migliorati per la biostampa 3D del GelMA possono potenziare le applicazioni biomediche.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per ottimizzare la stampabilità del GelMA.
- Potenziale per contributi significativi alla terapia d'organo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La biostampa 3D di idrogeli GelMA permette la fabbricazione di strutture complesse contenenti cellule, per applicazioni nell'ingegneria tissutale e nella medicina rigenerativa. Il protocollo affronta le sfide legate alla stampabilità mediante la formazione di gocce assistita da campo elettrico, l'estruzione di fibre e la modellazione basata su DLP, consentendo la produzione riproducibile di microsfere, fibre e chip microfluidici. Questi metodi aumentano l'affidabilità predittiva dei modelli preclinici fornendo impalcature biocompatibili e regolabili che imitano i segnali della matrice extracellulare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi delle interazioni cellula-matrice attraverso i motivi sensibili a RGD e MMP nel GelMA, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici dei bersagli terapeutici.
- Valore operativo: Fornisce formati standardizzati di microsfere e fibre per lo screening ad alto rendimento del comportamento cellulare in risposta a stimoli biofisici controllati.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Genera microambienti tridimensionali quantificabili per valutare la migrazione cellulare, la vitalità e la morfogenesi in risposta a perturbazioni farmacologiche o genetiche.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi mediante formulazioni di GelMA fotoincrociabili con UV, caratterizzate da rigidità e velocità di degradazione regolabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la fabbricazione di chip microfluidici perfondibili rivestiti con HUVEC, consentendo modelli di tessuti vascolarizzati per studi sul trasporto e sulla tossicità dei farmaci.
- Valore operativo: Consente la produzione scalabile di architetture 3D complesse (ad esempio, naso, orecchio, camere multiple) per la validazione preclinica di terapie rigenerative.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro integra la preparazione del bio-ink, l'incapsulamento cellulare e il reticolaggio assistito da tensione o luce per produrre costrutti di idrogel funzionali adatti alla valutazione biologica successiva.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi relative all'adesione mediata dagli integrini e al rimodellamento dipendente dalle proteasi in contesti tridimensionali.
- Screening: Permette la fabbricazione riproducibile di microsfere e fibre di idrogel per lo screening standardizzato di composti in matrici tridimensionali fisiologicamente rilevanti.
- Analisi: Fornisce letture strutturali e fluorescenti (ad esempio, imaging confocale di actina e nuclei) per quantificare le risposte cellulari in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico generando chip microfluidici vascolarizzati che modellano la formazione e la funzione di microvasi umani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare adattabile a diversi tipi cellulari e geometrie, riducendo lo sforzo di sviluppo ripetuto nei vari progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la validazione degli obiettivi consentendo la valutazione funzionale delle cellule in idrogeli degradabili e adesivi che riproducono caratteristiche chiave del microambiente.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a una formulazione standardizzata del bio-ink, alla filtrazione sterile e a parametri di reticolazione controllati.
- Valore strategico: Riduce i tempi di riduzione del rischio biologico fornendo modelli predittivi in fase precoce dell'integrazione tissutale e della vascolarizzazione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi di medicina rigenerativa consentendo un'iterazione rapida delle progettazioni degli scaffold e delle interazioni cellula-materiale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chimica degli idrogel, preparazione sterile degli inchiostri biologici e sistemi di reticolazione elettrici o ottici.
- Necessita di strumentazione come alimentatori ad alta tensione, pompe per siringhe, sorgenti di luce a 405 nm e biostampanti DLP.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo la viscosità dell'inchiostro biologico, la densità cellulare e la durata della reticolazione, al fine di garantire riproducibilità tra laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi cellulari (ad esempio, MDA-MB-231, bMSCs, HUVECs) e per la cinetica di gelificazione a diverse concentrazioni di GelMA.
- Include limitazioni pratiche, come la bassa viscosità del GelMA che richiede metodi ausiliari (ad esempio, stampa elettrofluidodinamica, coestrusione con alginato) per mantenere la fedeltà della forma.
