Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Con l'uso di questo protocollo i ricercatori possono identificare nuovi esomi o vescicola extracellulari a base di vescicola e microcellulare a base tissutale per il cancro avanzato alla prostata. Isolare l'RNA sia dai tessuti F-F-B che dalle vescicole extracellulari è spesso impegnativo in quanto la maggior parte di esso è de creato o è in quantità limitata Questa particella elaborerà diversi metodi per ottimizzare gli ingressi R-N-A e le librerie C-D-N-A per genere i dati gratuiti e di alta qualità più specifici per il sequenziamento di prossima generazione. Il sequenziamento di nuova generazione offre la piattaforma più completa per comprendere l'alterazione della molecola nel tumore che è alla base della progressione tumorale questa particella è ottimizzata con il campione clinico di cancro alla prostata e può fornire nuove informazioni sulla biologia sottostante del cancro alla prostata aggressivo avanzato.

L'ottimizzazione delle librerie C-D-N-A da materiale a basso input è un passaggio cruciale per un'esecuzione di sequenziamento di successo, è quindi molto importante generare librerie C-D-N-A di alta qualità per ottenere risultati accurati. Dopo aver eseguito la micro dissezione dei tessuti come fatto in precedenza, procedere all'isolamento delle file di disgelo di E-V derivate dal siero di campioni di siero del paziente a quattro gradi celsius. Trasferire 110 micro litri di campione di siero scongelato su un tubo e girare a duemila volte G per trenta minuti.

Eleggere il super naden per il successivo isolamento E-V o esosoma e scartare il pellet di debree. A 30 microlettrici di reagente di isolamento esosoma del siero al super natent. Un incubarlo di quattro gradi Celsius per trenta minuti.

Gira a 10.000 volte G per dieci minuti. Eleggere attentamente il super nadent E-V senza disturbare il pellet in un tubo separato da 1,5 millilitri e conservare meno 80 gradi Celsius per l'analisi futura. Quindi sospendere di nuovo il pellet E-V in 70 micro litri di P-B-S preparati in acqua priva di nucleasi.

Dopo aver isolato l'R-N-A totale dai tessuti micro sezionati e aver purificato gli E-V utilizzando kit commerciali, eseguire la preparazione della libreria in cinque micro litri di un campione R-N-A normalizzato da quaranta nanogrammi per micro litro a un micro litro di tre adattatori primi. Prerifoscere il ciclore termico a 70 gradi Celsius e incubare il campione per due minuti. Trasferire immediatamente i campioni sul ghiaccio.

In un tubo separato mescolare due micro litri di tampone di legatura, un micro litro di inibitore della RNasi e un micro litro di T4 RNA ligasi due, un mutante di cancellazione. Mescolare la biancheria da letto a torta su e giù. Quindi aggiungere quattro micro litri del mix al tubo con l'adattatore primario R-N-A 3 sul ghiaccio.

Preriscaldare il ciclore termico a 28 gradi Celsius. E posizionare il tubo nel ciclore termico per incubare per un'ora. Successivamente, aggiungere un micro litro di soluzione di arresto nel tubo mantenendo il campione sul ciclore termico.

Incubare a 28 gradi Celsius per altri 15 minuti. Quindi rimuovere immediatamente il tubo e tenere sul ghiaccio. In un tubo separato aggiungere un microlitro di cinque adattatori primi.

Trasferimento a un ciclore termico che è stato preriscaldato a 70 gradi Celsius. E incubare per due minuti. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio per evitare il reannealing degli adattatori.

Aggiungere un micro litro da dieci millimoli A-T-P al tubo di D natura cinque adattatori primi. Mescolare il pedding torta bye e aggiungere un micro litro di T4 R-N-A ligasi al mix. Pedding torta mix bye.

Trasferire tre microlitri di questa miscela sul tubo contenente i tre adattatori primi legati R-N-A. Posizionare il tubo sul ciclore termico che è stato preriscaldato a 28 gradi Celsius e incubare per un'ora. Successivamente trasferire immediatamente il tubo sul ghiaccio e procedere ulteriormente con i campioni o conservare a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.

Per eseguire R-T-P-C-R, utilizzare sei micro liger di ogni adattatore legato R-N-A e aggiungerne un micro liger di primer R-N-A R-T. Trasferire il tubo sul ciclore termico preriscaldato a 70 gradi Celsius e incubare per due minuti. Trasferire il tubo sul ghiaccio.

In un tubo separato mescolare due micro litri di 5X, tampone di filamento, 5 micro litri di 12,5 milimoler DNTP, un micro litro di DTT 100 milimolare, un micro litro dell'inibitore di R-N-A e un micro litro di trascrittasi inversa. Aggiungere cinque microlitri di questo mix all'RNA legato dell'adattatore e trasferirlo al ciclore termico che è stato preriscaldato a 50 gradi Celsius per incubare per un'ora. Dopo un'ora trasferire immediatamente sul ghiaccio l'adattatore legato il DNA gratuito.

In un tubo separato, mescolare 25 microlitri di mix PCR, due micro litri di primer PCR RNA, due micro litri di indice del primer PCR RNA e 8,5 microlitri di acqua libera dell'RNA. Aggiungere 37,5 microlitri di questo mix a 12,5 microlitri della CDNA legata dell'adattatore. Trasferire il tubo sul ciclore termico che è stato preriscaldato a 98 gradi celsius.

Programmare il ciclore termico come suggerito nel protocollo del produttore con il numero di ciclo modificato in 15. Dopo il completamento, mantenere il campione a quattro gradi celsius. Procedere o conservare a meno 80 gradi celsius per un uso futuro.

Per purificare il DNA legato in omaggio, aggiungere dieci microlitri del colorante di caricamento del DNA a ogni campione di DNA gratuito. E a dieci microlitri di quest'ultimo ad alta risoluzione e RNA personalizzato quest'ultimo. Eseguire 30 microlitri di ciascun campione in due corsie separate adiacenti l'una all'altra nel gel di poliacrilammide TBE al sei%.

Con RNA personalizzato quest'ultimo e quest'ultimo ad alta risoluzione, lo spazio intermedio tra i due diversi campioni. Far funzionare il gel in un buffer X TBE a 145 volt per circa 30-40 minuti. Tenere traccia della parte inferiore blu della tintura di carico.

Fermare l'elettroforesi quando si avvicina al fondo del gel. Trasferire il gel in un tampone X TBE con 5 microgrammi per millimetro di bromuro di etidio. Visualizzare il gel in un transilluminatore e tagliare il gel con precisione tra la coppia di basi 145 e i marcatori a coppia di base 160 e leggermente sopra il marcatore della coppia di basi 145 per evitare la contaminazione con il dimero dell'adattatore.

Un passaggio critico è la CDNA legata di purificazione che viene eseguita tagliando il gel proprio mentre i dimeri degli adattatori corrono molto persi per il marchio desiderato. Trasferire i pezzi di gel in tubi di rottura del DNA tenuti in tubi di raccolta di due millimetri. Gira a 20 mila volte G per due minuti.

E aggiungere trecento micro litri di acqua priva di RNasi e permettergli di ruotare delicatamente su un rocker durante la notte a temperatura ambiente. Per eseguire la precipitazione del DNA il giorno successivo trasferire il contenuto del tubo in tubi filtranti da 5 micron. Gira 600 volte G per rigorosamente dieci secondi.

Quindi aggiungere due microlitri di glicogeno trenta microlitri di tre acetati di sodio molare, 1X di vernice a pellet e 975 microlitri di etanolo al 100% per eluire il DNA. Gira a 17.000 volte G a 4 gradi Celsius per 20 minuti. Scartare il supernatante e aggiungere il 75% di etanolo per lavare il pellet.

Dopo aver filato a 17 mila volte G a quattro gradi celsius per cinque minuti scartare il supernatante e incubare i tubi a 37 gradi Celsius su un blocco termico evaporare completamente l'etanolo. Sospendere di nuovo il pellet con 12 microlitri di cloruro di tricide tricitere millimolare a PH 8,5. Successivamente eseguire un controllo di qualità della libreria diluendo il DNA purificato e gratuito dieci volte e utilizzando un microlitro del CDNA diluito per funzionare su un bioanalizzatore.

Assicurarsi che la dimensione gratuita del prodotto del DNA corrisponda alla gamma del piccolo RNA nell'elettroferogramma tra 136 e 160 coppie di basi. Calcolare la molarità totale per ogni campione. Normalizzare ogni campione a 2 nanomolari usando il tricloruro a PH 8,5.

Tenere le librerie mescolando volumi uguali di ogni due campioni nanomolari in un singolo tubo PCR a duecento microliter. Denaturazione e sequenza seguendo i passaggi descritti nel manoscritto. In questo studio la biblioteca è stata preparata dopo l'isolamento dell'RNA ed è stato eseguito un controllo di qualità.

La dimensione del prodotto per il micro Rnase legato dell'adattatore corrispondeva a circa 136-160 coppie di basi per ogni campione. Le sezioni evidenziate mostrano la gamma del gel che è stato asportato con precisione per la piccola libreria di RNA di preparazione. Questa figura mostra l'elettroforesi gel e gli elettroferogrammi per la libreria di DNA gratuita purificata.

Tessuto FFPE micro sezionato e EV derivati dal siero. Le metriche rappresentative di una piccola esecuzione di sequenziamento dell'RNA dimostrano la densità del cluster prevista, il punteggio Q, la percentuale di filtro di passaggio del cluster e i tassi stimati di resa ed errore per i tessuti FFP micro sezionati e gli EV derivati dal siero. Il punteggio Q in entrambi i campioni mostrava un valore superiore a tre che indicava il 99,9% dell'accuratezza della chiamata di base.

E i tassi di errore erano tutti al di sotto di uno. Ogni fase della preparazione della libreria deve essere eseguita con cura e i tubi devono essere immediatamente trasferiti sul ghiaccio dopo ogni incubazione. Un passaggio critico del protocollo è tagliare il gel proprio per assicurarsi di avere una libreria CDNA priva di dimero e pura.

La generazione della libreria CDNA richiede l'ottimizzazione per un'esecuzione di sequenziamento di alta qualità. Comprendere questo protocollo aiuterà gli spettatori a estrapolare questi dettagli minuti ad altri prepration della libreria di sequenziamento da campioni sorgente limitati suggeriscono vescicole siere ed extracellulari. Questa tecnica ci ha aiutato a identificare nuove micronasi associate all'aggressività tumorale e alla resistenza alla terapia nei pazienti con cancro alla prostata metastatica.

Queste tecniche possono estrapolare ad altri tipi di malattie che possono aiutare nella scoperta di nuovi biomarcatori. Poiché questa tecnica utilizza materiali biologici come il siero derivato dalla striazione e campioni di tessuto, si dovrebbero prendere le precauzioni appropriate. Inoltre, il bromuro di etidio è un agente cancerogeno noto e dovrebbe essere maneggiato con molta attenzione utilizzando questo protocollo.