Name: Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri l'isolamento di cellule epiteliali da tre regioni anatomiche della membrana amniotica umana per studiare eterogeneità e proprietà funzionali. Questo metodo consente applicazioni cliniche e modelli fisiopatologici avanzati.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La nostra ricerca è stata sostenuta dalle sovvenzioni dell'Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 e 21081) e del CONACYT (A1-S-8450 e 252756). Ringraziamo Jessica Gonzàlez Norris e Lidia Yuriria Paredes Vivas per il supporto tecnico.

Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico dell'Instituto Nacional de Perinatologa a Città del Messico (numero di registro 212250-21041). Tutte le procedure eseguite in questi studi erano conformi agli standard etici dell'Instituto Nacional de Perinatolog, della Dichiarazione di Helsinki e delle linee guida stabilite nello standard messicano ufficiale del Ministero della Salute.
1. Preparazione
<ol><li>Preparare una soluzione di 1x PBS con EDTA. A tale scopo, aggiungere 500 : L di 0,5 M di scorte EDTA in 500 mL di 1x PBS per una concentrazione finale di 0,5 mM EDTA.</li>
	<li>Preparare il supporto di coltura per HAEC. Prendere 450 mL di alto glucosio-DMEM, integrarlo con 5 mL di piravadi di sodio (100 mM), 50 mL di siero bovino fetale termale-inattivo qualificato per le cellule staminali, 5 mL di aminoacidi non essenziali (100x), 5 mL di antibiotico-antimicotico (100x), 5 mL di glutamine (200 m), 500 l di mercaptoetanolo (1.000x).</li>
	<li>Sterilizzare i contenitori per il trasporto e la lavorazione del tessuto: un contenitore in acciaio inossidabile con un coperchio per trasportare l'intera placenta dalla sala operatoria al laboratorio, un vassoio (20 cm x 30 cm x 8 cm) per lavare e rimuovere il sangue dall'intera placenta prima la dissezione della membrana amniotica, e un tagliere di plastica per separare la membrana amniotica nelle tre regioni.</li>
	<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (scalpel, forbici, pinze e morsetti), becher da 500 mL, garze di cotone e soluzione salina.</li>
</ol>2. Ottenere tessuto placentare
NOTA: Le membrane amniotiche sono state ottenute dalle donne a gestazione a termine (37-40 settimane), sotto indicazione della consegna cesarea, senza alcuna prova di lavoro attivo, e senza caratteristiche microbiologiche di infezione. Le procedure complete di isolamento e cultura sono state eseguite all'interno di un gabinetto di biosicurezza in condizioni sterili.
<ol><li>In sala operatoria, bloccare il cordone ombelicale per evitare il flusso sanguigno al resto del tessuto. Raccogliere l'intera placenta con il cordone ombelicale fissato nel contenitore sterile.</li>
	<li>Aggiungere 500 mL di soluzione salina al contenitore per idratare la placenta.</li>
	<li>Chiudere il contenitore e trasportare il tessuto al laboratorio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettere il contenitore con la placenta all'interno dell'armadietto della biosicurezza. NOTA: Nel caso in cui la dissezione non venga effettuata entro 15 min dalla raccolta della placenta, conservare il contenitore con la placenta sul ghiaccio fino alla lavorazione. Evitare più di 1 h di tempo trascorso tra l'ottenimento della placenta e l'inizio della dissezione.</li>
</ol>3. Separazione meccanica per regione della membrana amniotica
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili e a temperatura ambiente.
<ol><li>Rimuovere l'intera placenta dal contenitore e posizionarla sul vassoio con il cordone ombelicale rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Utilizzando una garza sterile di cotone, pulire i coaguli di sangue dalla superficie del chorion-amnion che copre la placenta.</li>
	<li>Identificare le tre regioni della membrana: l'amnione ombelicale che avvolge il cordone ombelicale, l'amnione placentare che copre la decidua basalis e la regione riflessa, che è il resto dell'amnione che non è attaccato alla placenta (Figura 1).</li>
	<li>Dissezio della regione dell'amnione ombelicale (Figura 2A).<ol>
<li>Utilizzando pinze dissetanti, tenere la porzione di membrana di amnione che copre la giunzione della placenta e del cordone ombelicale.</li>
		<li>Con un bisturi, sezionare la regione che circonda il cavo mentre si estende per separarlo dal chorion.</li>
		<li>Depositare il tessuto separato in un becher etichettato con 100 mL di soluzione salina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissezionare la regione dell'amnione placentare (Figura 2B).<ol>
<li>Con una garza di cotone sterile, rimuovere i coaguli di sangue dalla superficie del chorion-amnion che copre la placenta.</li>
		<li>Tenere la membrana sul confine tra la placenta e la regione riflessa con pinze di dissezione.</li>
		<li>Tagliare lungo la circonferenza della placenta con il bisturi.</li>
		<li>Separare l'amnione placenta dal chorion, facendo attenzione a non tagliare i vasi dalla placenta.</li>
		<li>Posizionare il tessuto separato in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separare il resto della membrana amniotica che non è attaccata alla placenta (cioè la parte riflessa) dal coro (Figura 2C).<ol>
<li>Raccogliere la regione riflessa in un altro becher etichettato con 300 mL di soluzione salina. NOTA: Aggiungere continuamente una soluzione salina durante la dissezione per evitare che il tessuto si secchi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lavare le membrane
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili a temperatura ambiente.
<ol><li>Scartare separatamente la soluzione salina di ogni regione della membrana.</li>
	<li>Aggiungere 100 mL di soluzione salina fresca alla regione ombelicale.</li>
	<li>Aggiungere 300 mL di soluzione salina fresca rispettivamente alle regioni placentari e riflesse.</li>
	<li>Mescolare le membrane con l'aiuto di piscio di dissezione per rimuovere i residui di sangue.</li>
	<li>Eliminare la soluzione salina.</li>
	<li>Ripetere i lavamenti e l'agitazione almeno 3x fino a quando le membrane sono traslucide.</li>
	<li>Posizionare ed estendere le membrane sulla scheda per pulire con garza sterile i coaguli di sangue che non sono stati rimossi con i lavatori. NOTA: È molto importante rimuovere il maggior numero possibile di eritrociti, poiché la loro presenza influisce sulla funzione della trypsin e sulla fattibilità delle successive colture cellulari.</li>
</ol>5. Digestione enzimatica delle membrane provenienti da diverse regioni
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.
<ol><li>Tagliare le regioni riflesse e placentari in due o tre frammenti.</li>
	<li>Non tagliare la regione ombelicale.</li>
	<li>Posizionare i frammenti di ogni regione in tubi di centrifuga. Aggiungere 20 mL dello 0,5% di trypsin/EDTA alle regioni riflesse e placentari e di 5 mL dello 0,5% trypsin/EDTA rispettivamente all'area ombelicale. NOTA: È importante tagliare le regioni riflesse e placentari in pezzi più piccoli perché devono essere completamente immerse nella soluzione trypsin.</li>
	<li>Agitare leggermente i tubi di centrifuga per 30 s. Scartare la metapsina.</li>
	<li>Aggiungere 30 mL di nuovo 0,5% trypsin/EDTA alle regioni riflesse e placentari e 15 mL di nuovo 0,5% trypsin/EDTA rispettivamente nella regione ombelicale.</li>
	<li>Posizionare i tubi in un rotatore all'interno dell'incubatrice.</li>
	<li>Incubare con rotazione (20 giri/) per 40 min a 37 gradi centigradi. NOTA: Se non è disponibile un rotatore di tubi, agitare leggermente i tubi manualmente ogni 10 min.</li>
	<li>Trasferire le soluzioni trypsin/cell da ogni regione in nuovi tubi di centrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 2 volte il volume dei supporti HAEC preriscaldati a 37 gradi centigradi per tubo per inattivare l'enzima.</li>
	<li>Conservare la prima digestione sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi di 5,6 x 5,8 per un secondo periodo di digestione.</li>
	<li>Per ogni regione, tenere un'estremità della porzione di amnione utilizzando pinze dissetanti, e con un'altra coppia stringere lungo il tessuto per rimuovere file di cellule epiteliali che non si staccavano completamente durante i precedenti periodi di incubazione.</li>
	<li>Raccogliere la seconda digestione in un altro set di tubi di centrifuga e inattivare con 2 volte il volume dei supporti HAEC.</li>
	<li>Scartare le membrane digerite in un contenitore di rischio biologico.</li>
</ol>6. Isolamento dell'HAEC
NOTA: La procedura deve essere eseguita all'interno di un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.
<ol><li>Centrifugare tutti i tubi a 200 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Scartare il supernatante e aggiungere 10 mL di supporti HAEC preriscaldati (a 37 gradi centigradi) per tubo e pipet delicatamente per disaggregare ogni pellet.</li>
	<li>Combinare le sospensioni cellulari delle due digestione in un singolo tubo per ogni regione della membrana.</li>
	<li>Filtrare le sospensioni cellulari utilizzando più di 100 ceppi cellulari m per rimuovere i detriti della matrice extracellulare e ottenere singole cellule.</li>
	<li>Preparare tre aliquote con 90 litri di trippan blu in un tubo di microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 10 litri di ciascuna sospensione cellulare per regione di membrana nei tubi di microcentrismo e mescolare.</li>
	<li>Contare le cellule con un emocitometro al microscopio del campo luminoso.</li>
</ol>7. Cultura dell'HAEC
<ol><li>Semina l'HAEC delle tre regioni separatamente ad una densità di 3 x 104 cellule/cm2 con supporti HAEC preriscaldati, integrati con 10 ng/mL del fattore di crescita epidermico umano (EGF).<ol>
<li>Semina le cellule in piastre da 100 mm per mantenerle in vitro o in 24 pozze per l'analisi immunochimica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare i piatti a 37 gradi centigradi in condizioni di norma (5% CO2)in un'incubatrice umidificata.</li>
	<li>Aggiungere EGF ogni giorno e cambiare il supporto ogni terzo giorno. NOTA: Le cellule diventeranno confluenti dopo 4/6 giorni.</li>
	<li>Utilizzare le cellule per l'immunohistochimica convenzionale, l'analisi di smistamento cellulare, criopreservazione, estrazione di RNA e proteine, o per continuare il passaggio.</li>
</ol>8. Passaggio di HAEC
<ol><li>Rimuovere il supporto HAEC e lavare 2x con soluzione PBS/EDTA 0.01M.</li>
	<li>Incubare con una soluzione PBS/EDTA 0,01M per 15 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Rimuovere il PBS/EDTA e aggiungere 1,5 mL di 0,5% trypsin/EDTA.</li>
	<li>Incubare per 5/8 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Inattivare l'enzima con due volumi di supporti HAEC.</li>
	<li>Raccogliere la soluzione mista e centrifugare per 5 min a 200 x g.</li>
	<li>Contare le celle e continuare con i passaggi successivi o utilizzare le cellule per ulteriori analisi.</li>
</ol>

<ol><li>Shahbazi, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+human+embryo+in+the+absence+of+maternal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).</li>
<li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelium+%28HAE%29+as+a+possible+source+of+stem+cells+%28SC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gaceta+Medica+de+Mexico%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC).</a> Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).</li>
<li>Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Amnion+Epithelial+Cells+According+to+Current+Good+Manufacturing+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).</li>
<li>Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+S+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).</li>
<li>Garcia-Castro, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Pluripotency+in+Human+Amniotic+Epithelial+Cells+and+Their+Differentiation+to+Progenitor+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons.</a> PLoS One. 10 (12), 0146082(2015).</li>
<li>Garcia-Lopez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+markers+in+tissue+and+cultivated+cells+in+vitro+of+different+regions+of+human+amniotic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium.</a> Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).</li>
<li>Yang, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells+in+a+serum-free+system+and+their+safety+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacological+Sinica%22%5BJournal%5D)">Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation.</a> Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).</li>
<li>Zou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA32+silences+WWP2+expression+to+maintain+the+pluripotency+of+human+amniotic+epithelial+stem+cells+and+beta+isletlike+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).</li>
<li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+ephemeral+human+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Capturing the ephemeral human pluripotent state.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).</li>
<li>Niknejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+amniotic+membrane+for+potential+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).</li>
<li>Miki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+characteristics+and+the+therapeutic+potential+of+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003(2018).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+proliferation%2C+migration+and+angiogenic+properties+of+human+amniotic+epithelial+and+mesenchymal+stem+cells+and+their+effects+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).</li>
<li>Hammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amnion+epithelial+cells%2C+in+contrast+to+trophoblast+cells%2C+express+all+classical+HLA+class+I+molecules+together+with+HLA-G%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).</li>
<li>Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. 268-318 (1995).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+metabolic+activity+in+placental+and+reflected+regions+of+the+human+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane.</a> Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-143+regulation+of+prostaglandin-endoperoxidase+synthase+2+in+the+amnion%3A+implications+for+human+parturition+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term.</a> PLoS One. 6 (9), 24131(2011).</li>
<li>Han, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+gene+expression+profiling%3A+novel+evidence+for+biological+heterogeneity+of+the+human+amnion%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion.</a> Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+induces+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+amniotic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells.</a> Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).</li>
<li>Canciello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+prevents+epithelial-mesenchymal+transition+of+ovine+amniotic+epithelial+cells+and+enhances+their+immunomodulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3761(2017).</li>
<li>Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Epithelial+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Amniotic Epithelial Cell Culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).</li>
<li>Singh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+network+crosstalk+in+human+pluripotent+cells%3A+a+Smad2%2F3-regulated+switch+that+controls+the+balance+between+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Focal+Adhesion+Kinase+Signaling+by+Integrin+alpha6beta1+Supports+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal.</a> Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).</li>
<li>Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+regional+distribution+of+aquaporins+in+amnion+of+normal+and+gestational+diabetic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies.</a> Physiological Reports. 3 (3), 12320(2015).</li>
<li>Avila-Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amniotic+epithelial+cells+as+feeder+layer+to+derive+and+maintain+human+embryonic+stem+cells+from+poor-quality+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos.</a> Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo implementato un nuovo protocollo per isolare l'HAEC dalle membrane di termine. Si differenzia dai rapporti precedenti in quanto ogni membrana è stata divisa nelle sue tre regioni anatomiche prima dell'isolamento per analizzare le cellule da ciascuna di esse.
Uno dei passaggi più critici nel protocollo è il lavaggio della membrana per rimuovere tutti i coaguli di sangue, perché possono interferire con l'attività della trypsin quando si separano le cellule epiteliali. La mancata esecuzio...

Le cellule dell'epitelio amniotico umano (HAEC) hanno origine durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, a circa otto giorni dopo la fecondazione. Nascono da una popolazione di cellule epiteliali squamose dell'epiblasto che derivano dallo strato più interno della membrana amniotica1. Così, HAEC sono considerati resti di cellule pluripotenti dall'epiblast che hanno il potenziale di differenziarsi nei tre strati germinali dell'embrione2. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per isolare queste cellule dalla membrana amniotica al termine di gestazione per caratterizzare le loro presunte proprietà legate alla pluripotenza in un modello culturale in vitro3,4.
Di conseguenza, è stato scoperto che HAEC presentano tratti caratteristici delle cellule staminali pluripotenti umane (HPSC), come gli antigeni superficiali SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; il nucleo dei fattori di trascrizione pluripotenza OCT4, SOX2 e NANOG; e il marcatore di proliferazione KI67, suggerendo che si stanno rinnovando5,6,7. Inoltre, queste cellule sono state sfidate utilizzando protocolli di differenziazione per ottenere cellule positive per marcatori specifici del lignaggio dei tre strati germinali (ectodermi, mesoderm ed endoderm)4,5,8, così come nei modelli animali di malattie umane. Infine, HAEC esprimono l'E-cadherin, che dimostrano che mantengono una natura epiteliale molto simile all'HPSC5,9.
Oltre alla loro origine embrionale, gli HAEC hanno altre proprietà intrinseche che le rendono adatte a diverse applicazioni cliniche, come la secrezione di molecole antinfiammatorie e antibatteriche10,11, fattori di crescita e citochina rilasciano12, nessuna formazione di teratomi quando vengono trapiantati in topi immunodeficienti in contrasto con HPSC2, e tolleranza logica perché esprimono HLA-G, che diminuisce il rischio di trapianto13.
Tuttavia, i rapporti precedenti hanno ipotizzato che l'amnione umano sia una membrana omogenea, senza considerare che possa essere suddivisa anatomicamente e fisiologicamente in tre regioni: placentale (l'amnione che copre la decidua basalis),ombelicale (la parte che avvolge il cordone ombelicale), e riflessa (il resto della membrana non attaccata alla placenta)14. È stato dimostrato che le regioni placentarie e riflesse dell'amnion mostrano differenze nella morfologia, nell'attività mitocondriale, nel rilevamento delle specie reattive dell'ossigeno15, sull'espressione miRNA16e nell'attivazione delle vie di segnalazione17. Questi risultati suggeriscono che l'amnione umano è integrato da una popolazione eterogenea con funzionalità diverse che dovrebbero essere prese in considerazione per ulteriori studi condotti in modelli in situ o in vitro. Mentre altri laboratori hanno progettato protocolli per l'isolamento di HAEC da tutta la membrana, il nostro laboratorio ha stabilito un protocollo per isolare, coltura e caratterizzare le cellule provenienti da diverse regioni anatomiche.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti per coltura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM</td></tr><tr><td>EGF umano ricombinante senza animali</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>15240062</td><td>100X</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>12430054</td><td>Integrato con EDTA ad alto contenuto di glucosio e HEPES</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9260G</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Cellule staminali embrionali FBS, qualificato</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>10439024</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>11140050</td><td>100X</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>10010023</td><td>1X</td></tr><tr><td>Soluzione salina (cloruro di sodio 0,9%)</td><td>qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>11360070</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 0,05%</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td><forte> Materiale monouso</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Cell Strainer</td><td>Corning/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura trattato TC da 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC a 24 pozzetti</td><td>Corning/Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti multipli trasparenti con trattamento TC a 6 pozzetti</td><td>Corning/Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da centrifuga sterile non pirogeno</td><td>di qualsiasi marca</td><td></td><td>con conico fondo</td></tr><tr><td>Punte sterili apirogene da 1.000 &; micro; l, 200 & micro; l e 10 &micro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garze</td><td></td><td></td><td></td>di cotone sterili</tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili da 5, 10 e 25 mL di</td><td>qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici sterili</td><td>di qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina</td><td></td><td></td><td></td>di sicurezza biologica</tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Riempitrice/dispensatrice</td><td></td><td></td><td></td>motorizzata per pipette</tr><tr><td>Becher sterili da 500 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tagliere</td><td></td><td></td><td></td>sterile in plastica</tr><tr><td>Bisturi, forbici, pinze, pinze sterili Contenitore</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>sterile in acciaio inox</td></tr><tr><td>Vassoio</td><td></td><td></td><td></td>sterile</tr><tr><td>Rotatore di provette</td><td>MaCSmix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi e kit</td><td></td><td></td><td>Antibody ID</td></tr><tr><td>Anti-E-caderina</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>RRID:AB_3975</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Santa Cruz</td><td>23900</td><td>RRID:AB_627859)</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>Peprotech</td><td>500-P236</td><td>RRID:AB_1268274</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>RRID:AB_44517</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td>RRID:AB_2286686</td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare</td><td>anti-SSEA-4</td><td>4755</td><td>RRID:AB_1264259</td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare</td><td>anti-TRA-1-60</td><td>4746</td><td>RRID:AB_2119059</td></tr><tr><td>Capra Anti-Topo Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>RRID:AB_2534088</td></tr><tr><td>Capra Anti-Coniglio Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11036</td><td>RRID:AB_10563566</td></tr><tr><td>Kit di test Tunel</td><td>Abcam</td><td>66110</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Diversi protocolli sono stati riportati nella letteratura per l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali amniotiche umane (HAEC). Tuttavia, questi presuppongono che l'epitelio amniotico sia uno strato omogeneo. L'amnione umano può essere diviso in tre regioni anatomiche: riflesse, placentare e ombelicali. Ogni regione ha diversi ruoli fisiologici, come in condizioni patologiche. Qui, descriviamo un protocollo per sezionare il tessuto amnione umano in tre sezioni e mantenerlo in vitro. Nella coltura, le cellule derivate dall'amnione riflesso mostravano una morfologia cuboidale, mentre le cellule delle regioni placentarie e ombelicali erano squamose. Ciò nonostante, tutte le cellule ottenute hanno un fenotipo epiteliale, dimostrato dall'immunorilevamento dell'E-cadherin. Pertanto, poiché le regioni placentari e riflesse in situ differiscono nei componenti cellulari e nelle funzioni molecolari, potrebbe essere necessario che gli studi in vitro considerino queste differenze, poiché potrebbero avere implicazioni fisiologiche per l'uso dell'HAEC biomedica e la promettente applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa.

Gli HAEC sono stati isolati da ciascuna delle tre regioni anatomiche della membrana amniotica e coltivati individualmente in vitro. Dopo 48 h di coltura, le cellule con un fenotipo epiteliale aderito alla superficie della piastra, anche se i media contenevano anche detriti cellulari e cellule galleggianti, che sono stati rimossi una volta che il mezzo è stato cambiato (Figura 3).
Durante l'elaborazione della cultura primaria (passaggio zero, P0), potrebbero sorger...

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule epiteliali da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana per determinarne l'eterogeneità e le proprietà funzionali per una possibile applicazione nei modelli clinici e fisiopatologici.

Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'eterogeneità e le proprietà funzionali delle cellule epiteliali amniotiche umane isolate dalla membrana amniotica. Mentre i protocolli precedenti isolavano le cellule dalla membrana co-amniotica senza discernere tra le regioni, il nostro protocollo consente la coltura della popolazione cellulare isolata da tre distinte regioni anatomiche. Per separare la membrana amniotica per regione, in un armadio di biosicurezza in condizioni sterili, identificare l'amnio ombelicale che avvolge il cordone ombelicale, l'amnio placentare che copre la decidua basalis e la regione riflessa, che è considerata il resto dell'amnione che non è attaccato alla placenta.Per sezionare la regione di amnione ombelicale, utilizzare le forcep di sezionamento per trattenere la porzione della membrana amnonica che copre la giunzione della placenta e del cordone ombelicale e utilizzare un bisturi per sezionare la regione che circonda il cordone, mentre si allunga per separare la regione dal corione. Quindi, depositare il tessuto separato in un becher etichettato con 100 millilitri di soluzione salina. Per sezionare la regione di amnozione placentare, utilizzare una garza di cotone sterile per rimuovere i coaguli di sangue dalla superficie del corione / amnione che copre la placenta.E utilizzare le forcep di sezionazione per afferrare la membrana sul bordo tra la placenta e la regione riflessa. Utilizzare un bisturi per tagliare lungo la circonferenza della placenta e separare l'amnione placentare dal corione, facendo attenzione a non tagliare alcun recipiente dalla placenta. Posizionare il tessuto separato in un altro becher etichettato con 300 millilitri di soluzione salina.E separare il resto della membrana amniotica che non è attaccata alla placenta dal corione. Quindi, posizionare la regione riflessa in un altro becher etichettato con 300 millilitri di soluzione salina. Per lavare le membrane, utilizzare una pinzetta per posizionarle su una superficie sterile per essere in grado di scartare la soluzione salina da ogni contenitore di tessuto.Riposizionare le membrane nel contenitore e aggiungere 100 millilitri di soluzione salina fresca alla regione ombelicale e 300 millilitri di soluzione salina fresca alle regioni placentare e riflesse. Utilizzare le forcep di sezionamento per mescolare le membrane per rimuovere eventuali residui di sangue e posizionare le membrane sulla superficie sterile per poter scartare le soluzioni saline. Quindi, lavare le membrane almeno altre due volte, come appena dimostrato, fino a quando i tessuti non sono traslucidi.Per la digestione enzimatica delle diverse regioni della membrana amniotica, tagliare le regioni riflesse e placentari in due o tre frammenti. E posizionare i frammenti e la regione ombelicale in singoli tubi di centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri dello 0,5% di tripsiderina-EDTA a ciascun tubo di frammenti di tessuto della regione riflessa e placentare e cinque millilitri dello 0,5% di tripside-EDTA al tubo contenente il tessuto della regione ombelicale.Agitare delicatamente i tubi per 30 secondi. Quindi posizionare le membrane su una superficie sterile, scartando la soluzione di tripina-EDTA e sostituirla con 30 millilitri di fresco 0,5% di tripsiderina-EDTA per i frammenti di tessuto della regione riflessa e placentare e 15 millilitri di fresco 0,5%Tripside-EDTA per il tessuto della regione ombelicale. Quindi posizionare i tubi in un rotatore all'interno di un incubatore per una rotazione di 40 minuti a 20 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, trasferire l'intero volume della soluzione cellulare in nuovi tubi conici. E aggiungere due volte il volume di cellule AE umane di 37 gradi Celsius medie ad ogni tubo sul ghiaccio. Digerire eventuali frammenti di tessuto rimanenti nei tubi originali con fresco 0,5% di tripside-EDTA, come appena dimostrato.Alla fine della seconda digestione, utilizzare un paio di forcelle dissezionanti per tenere un'estremità della porzione di amniion e una seconda coppia di forcelle di sezionamento per spremere lungo il tessuto rimanente per rimuovere eventuali file di cellule epiteliali che non si sono completamente staccate durante i precedenti periodi di incubazione. Quindi, rimuovere le membrane per poter trasferire la seconda soluzione di digestione in un secondo set di tubi di centrifuga. E inattivare gli enzimi di digestione con due volte il volume del mezzo cellulare AE umano fresco di 37 gradi Celsius sul ghiaccio.Per l'isolamento delle cellule AE umane, sedimentare le cellule per centrifugazione. E rimescolare il pellet in ogni tubo con 10 millilitri di mezzo cellulare AE umano fresco di 37 gradi Celsius. Tirare ogni coppia di digestione in un unico tubo e filtrare le sospensioni attraverso filtri da 100 micrometri per rimuovere eventuali detriti della matrice extracellulare.Dopo il conteggio, seminare le cellule AE umane da ciascuna delle tre regioni in singole piastre di 100 millimetri a una concentrazione di tre volte 10-quarta cella per centimetro al quadrato in mezzo cellulare AE umano di 37 gradi Celsius, integrata con 10 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico umano. Quindi, incubare le colture a 37 gradi Celsius in condizioni normossiche in un incubatore umidificato fino all'analisi a valle dell'interesse. Dopo 48 ore di coltura, le cellule AE umane con un fenotipo epiteliale aderiscono alla superficie della piastra, mentre il supernatante contiene detriti cellulari e cellule galleggianti che possono essere rimosse una volta cambiato il mezzo.Si consiglia di scartare le colture ed elaborare un'altra membrana identificando la presenza di contaminazione batterica, etitrociti eccessivi a causa di un lavaggio insufficiente delle membrane, delle cellule carenti o non aderenti o delle cellule con una morfologia fibroblastica. La morfologia delle cellule AE umane dipende dall'origine delle cellule, poiché le cellule della zona riflessa dimostrano una morfologia cuboidale e crescono in un monostrato acciottolato, e le cellule delle regioni placentare e ombelicali sono piatte e squamose. L'immunofluorescenza contro l'E-cadherina rivela che le colture primarie e le sottoculture mantengono il loro fenotipo epiteliale, suggerendo che non vi è contaminazione di un altro tipo di cellula.Inoltre, le cellule sono vitali, come evidenziato dalla loro espressione del marcatore di proliferazione Ki-67. Sebbene le sottopopolazioni dall'amnione differiscano nella loro morfologia e funzione, l'espressione e la presenza del nucleo dei fattori di pluripotenza non cambia nelle cellule AE umane derivate dalle regioni placentari e riflesse. Poiché le cellule epiteliali amniotiche umane sono una possibile fonte di cellule staminali pluripotenti, possiamo sfidarle attraverso una linea di protocolli di definizione specifici per chiarire se queste cellule di ogni regione hanno potenzialità diverse.Prima di un protocollo iniziato, rivedere la storia medica del paziente per essere sicuri che il tessuto non mostri caratteristiche microbiologiche dell'infezione.

in-vitro-culture-epithelial-cells-from-different-anatomical-regions

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Cellule epiteliali nasali, ottenuti attraverso superficiale raschiare la biopsia di volontari umani, vengono ampliati e trasferite su inserti di coltura tissutale. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono coltivate a interfaccia liquido aria, ottenendo colture di cellule ciliate e non ciliate. Colture di cellule epiteliali nasali differenziate offrono modelli sperimentali validi per lo studio della mucosa respiratoria.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule epiteliali amniologiche umane (hAEC) utilizzando reagenti privi di prodotti animali in conformità con le attuali linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (cGMP).

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

Questo studio presenta un metodo standardizzato e convalidato per l'isolamento e la coltura del mouse principale stromale endometriale e cellule epiteliali, che può essere utilizzato in un sistema di co-coltura per studiare in decidualizzazione vitro.

Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632

I recenti progressi nei protocolli di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo consentono la derivazione graduale di tipi di cellule specifiche per organo. Qui, forniamo passaggi dettagliati per il mantenimento e l'espansione delle cellule basali delle vie aeree derivate da iPSC e la loro differenziazione in un epitelio mucociliare in colture di interfaccia aria-liquido.

Generazione di colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali delle vie aeree da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, dimostriamo come le cellule epiteliali coltivate con fibroblasti nel sistema a due strati basato su membrana nanofibrosa possano aderire e crescere stabilmente sulla membrana.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Scopri l'isolamento di cellule epiteliali da tre regioni anatomiche della membrana amniotica umana per studiare eterogeneità e proprietà funzionali. Questo metodo consente applicazioni cliniche e modelli fisiopatologici avanzati.

Cultura in vitro di cellule epiteliali provenienti da diverse regioni anatomiche della membrana amniotica umana

Esplora altri video