Name: טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למד שיטה פשוטה וזולה לטיהור תאי גזע Prominin-1+ ממוח עכבר פוסט לידתי. הפרוטוקול מאפשר ייצור נוירוספירות והבחנה לשושלות עצביות שונות למחקר התפתחות המוח הקטן ומחלותיו.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לחברי המעבדה של אופל על הצעותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 1RO1 NS062051 ו 1RO1NS08251 (אופל P)

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך NIH של הטיפול והשימוש בחיות מעבדה (2011) ואושרו על ידי האוניברסיטה הצפון מערבי IACUC (פרוטוקול IS00011368).
1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכנת פתרון דיסוציאציה לרקמות עשוי מתמיסת פנול בצבע אדום המכיל מלוחים באגירה של dulbecco (dpbs) עם פפאין (100 u/ml), ציסטאין (0.2 מ"ג/ml) ו-dnase (250 u/ml).</li>
	<li>כדי להכין את הפתרון DNase לדלל 100 מ"ג של האבקה ליאופהולי של DNase I (בקבוק אחד) ב 50 mL של H2O. Mix היטב ולסנן את פתרון המניה. הכינו מניות 10 mL. לחלק צינור מניות אחד לתוך 0.5 mL בשימוש יחיד ali,. אחסן את השימוש היחיד בהאליב-80 ° c.</li>
	<li>הכנת ריאגנטים הפרדה מגנטית על ידי הכנת מאגר הטור המגנטי X: 0.5% הסרום הפרה אלבומין (BSA) ו 2 מילימטר EDTA פתרון.</li>
	<li>כדי להכין מדיה נוירוספירה, השתמש בינונית נוירובלית המכילה פניצילין/סטרפטומיצין עם L-גלוטמין ותוספת עם 2% B27, 20 ng/mL האדם רקומביננטי גידול באפידרמיס (EGF), ו 20 ng/mL האדם רקומביננטי בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ גורם (bFGF).</li>
	<li>כדי להכין מדיה בידול, להשתמש בינוני נוירובסיס ותוספת עם 10 ng/mL הבדיל טסיות גורם הגידול הנגזר (PDGF-AA) או 10 ng/mL לוקמיה גורם מעכבות (אבל) ו 2% B27.</li>
	<li>השתמש בקובץ מצורף אולטרה-נמוך 12 היטב (3.5 ס"מ2) ו-6 היטב (9.6 ס"מ2) לוחיות התרבות.</li>
</ol>2. חיתוך של המוח השני
<ol><li>גורי כלבלבים מורדם (P3-P7) עם מספריים כירורגיים.</li>
	<li>רסס את הראש המופרד של הגורים עם 70% אתנול.</li>
	<li>העבירו כל ראש לתוך מאכל ריק בגודל 10 ס מ לתרבות. הפרידו את העור באמצעות המספריים לחיתוך המיקרו, ולאחר מכן הסירו את הגולגולת על ידי הפעלת המספריים המשונן לאורך קו האמצע.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים #7, לקלף את עצמות הגולגולת מתחיל להיות מתוך גזע המוח. הרימו בזהירות את המוח באמצעות מרית, שמירה על המוח המלא שלם, והעבירו את המוח למנה טרייה סטרילית 10.0 ס מ המכילה 15 מ ל של תמיסת מלח קר הנקס מאוזנת (HBSS) פתרון.</li>
	<li>מניחים את המנה המכילה את המוח. תחת מיקרוסקופ לחיתוך באמצעות מלקחיים #5 עדינים, להסיר את קרום המוח ואת כלי הדם הגדולים מן המעי הגבוה ולהפריד את המוח מתוך גזע המוח באמצעות המרית.</li>
	<li>העבר את המוח החצי לתוך שפופרת צנטריפוגה 15 מ"ל המכילה 5.0 mL של פתרון HBSS קר קרח. לשטוף את המוח על ידי שטיפה ובקבוקי שלושה x עם 5.0 mL של HBSS. הערה: כל המוח השני צריך להיות ממוקם בצינור משלו לעיבוד נוסף.</li>
</ol>3. תא ההשעיה הכנה
<ol><li>לאחר לשטוף האחרון, להוסיף 5 מ ל של פתרון הדיסוציאציה המבוססת על רקמת הרקמה (מבוסס על עבודה קודמת13,18) כי כבר טרום מחומם עד 37 ° c. מודטת את הרקמה במשך 15 דקות ב 37 ° c באמבט מים. לאט לערבב את התוכן על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה 3x – 5x כל 3 דקות או באמצעות מערבל מיקסר או ביד.</li>
	<li>הכינו קוטר רחב (פיפטה זכוכית רגיל) וקוטר צר של פסטר פיפטה (אש מלוטשת על ידי חימום מעל מבער בונזן) כמתואר בעבר19.</li>
	<li>לשטוף את רקמת 3x עם 5 מ ל של פתרון HBSS, הימנעות אובדן של הרקמה תוך היין באמצעות יד.</li>
	<li>הסר את הכביסה HBSS האחרונה ולהוסיף 5 מ ל של פתרון DPBS המכיל 250 μL של פתרון DNase לרקמות. הנתק את הרקמה על ידי triturating 10x – 15x באמצעות הקוטר הרחב של פסטר. בצע צעד זה בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות.</li>
	<li>לאחר מכן מיקמים את השתייה במשך 10 דקות נוספות ב-37 ° c באמבט המים, ערבוב על ידי היפוך ויישור הצינור.</li>
	<li>השתמש בקוטר מופחת הצינורות פסטר כדי להוסיף עוד קצוצות רקמות 10x. אם יישארו חתיכות גדולות של רקמה, לחצו את חתיכות הרקמה נגד תחתית הצינור עם קצה של הפיפטה בעדינות ולהמשיך ללטף עד התאים להגיע השעיה קנס.</li>
	<li>מודטת את הרקמה ב 37 ° c עבור 10 דקות נוספות, חוזר על שלבי ערבוב הקודם.</li>
</ol>4. אימונוולבלינג של תאי גזע
<ol><li>הניחו את שפופרות הצנטריפוגה על הקרח והשתמשו בפתרונות קירור לשלבים הבאים. מסננים את התאים הנתק באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר לתוך צינור הצנטריפוגה 50 mL. למעלה את המסנן עם 10.0 mL של פתרון HBSS כדי להבטיח כי תאים עוברים את רשת השינוי בפתרון זה נוסף.</li>
	<li>העבר את התאים המסוננים לתוך שפופרת הצנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה את השעיית התא ב-300 x g במשך 10 דקות ב -4 ° c. מחליש וזורקים את סופרנטנט לחלוטין על ידי בזהירות באמצעות שואב אבק.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב-160 μL של מאגר טורים מגנטי. כדי להשיג את ההשעיה תא יחיד לפני תיוג מגנטי, לעבור תאים דרך רשת 30 יקרומטר ניילון כדי להסיר את הגושים תאים, אשר יכול אחרת לסתום את העמודה.</li>
	<li>הוסף 40 μL של anti-prominin-1 מיקרוחרוזים לכל 15 מ ל שפופרת, לערבב, ו דגירה במקרר במשך 15 דקות כדי הנוגדן לאגד prominin-1-ביטוי תאים.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.0 – 2.0 מ ל של מאגר העמודה X ו צנטריפוגה ב 300 X g עבור 10 דקות.. מרוב הסופר-על</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 1.0 mL של מאגר העמודות X. הערה: אם גושים קטנים נראים לאחר השעיה של גלולה עם 1.0 mL של מאגר העמודה X, הם צריכים להיות מוסרים בקפידה באמצעות קצה של פיפטה פסטר, אחרת הגושים האלה יכולים לחסום את הטור המגנטי במהלך מיון התא.</li>
</ol>5. הכנה לעמוד מגנטי, מיון תאים וציפוי
הערה: הפרדה מגנטית מתנאי גנוטיפ שונים (מחלה לעומת שליטה) יש לבצע באותו זמן, שכן כל עיכוב עלול להשפיע על מורפולוגיה נוירוספירה.
<ol><li>הכן את העמודים המגנטיים על-ידי הצבתו בעמדה המגנטית החשופה לשדה המגנטי. שטוף את העמודה פעם אחת עם 500 μL של מאגר X על-ידי החלת מאגר שנוטף לתוך שפופרת צנטריפוגה כדי להיות מושלך. הערה: הכן מאגר טורים מגנטי טרי X עבור כל ניסוי; אם לא, אז התשואה תא גזע יהיה נמוך.</li>
	<li>החל את השעיית התא המתויג על העמודה. לאסוף את הפרח דרך המכיל תאים בלתי מסומנים המורכבים בעיקר המוח עצבי/גליה מעורבים תאים לתוך טרי 15 מ ל צינורות (איור 1A).</li>
	<li>שטוף את העמודה 3x עם 500 μL של מאגר X (כל כביסה אורכת כ-2 – 4 דקות). הערה: המוח העצבי/glial התרבות המעורבת מועשר בנוירונים בעלי מוח מסיבי מסוגל לשמש כתוצר לוואי שימושי של צעד זה טיהור.</li>
	<li>הסר את העמודה מהשדה המגנטי ומקום בשפופרת 1.5 mL. להוסיף 1.0 mL של התרבות בינונית (נוירוספירה בינונית) אל העמודה ולדחוף את הבוכנה לתוך הטור כדי לרוקן את התאים המתויג עם prominin-1 חרוזים לתוך הצינור החדש 1.5 mL הבז.</li>
	<li>כדי לשפר את הטוהר של התאים prominin-1 התווית, להעביר את התאים הללו מעל העמודה השנייה שלאחר השלבים 5.1 – 5.4.</li>
	<li>. תספור את התאים באמצעות הומוטומטר התשואה אופייני הוא 107 תאים לכל מוח משכל. לוח התאים על לוחות מצורף אולטרה נמוך (6 או 12 היטב, בהתבסס על הצפיפות הדרושה לניסויים במורד הזרם).</li>
</ol>6. המשך ההתיישנות של נוירוספירות ובידול
<ol><li>צלחת prominin-1-בתאי גזע בעלי התווית על מצורף אולטרה נמוך 12 לוחות היטב בינונית נוירוספירה (5,000 תאים/טוב).</li>
	<li>לאחר 7 – 10 ימים, התאים להפריד להניב כדור בצורת נוירוספירות צף (נוירוספירות ראשוני). הערה: בניסוי זה, נוירוכדורים משניים המתרחבים במספרים נוצרים לשימוש נוסף. אוכלוסיות נוירוספירה העיקרי אינם משמשים ניסויים אלה, שכן הם עשויים להכיל תאים מזהם כי אין להם מאפייני תא גזע והוא יכול לקבץ יחד עם נוירוספירות.</li>
	<li>עבור העברת הזדקנות, להעביר את הנוירוספירות העיקרי יחד עם מדיית התרבות באמצעות 1.0 mL מקבל טיפים ל 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה סטרילית. גלולה הנוירוספירות על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 5 מ ל של מדיה דיסוציאציה של רקמות המכיל פפאין או 0.05% טריפסין פתרון. מודקון ב 37 ° c עבור 10 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות. להשהות את התאים ב 5 מ ל של נוירוספירה בינונית ולנתק את התאים מכנית באמצעות הפיפטה פלסטיק פסטר וליטוף לאט למעלה ולמטה 10x.</li>
	<li>לוחית התאים (שוב) במדיה נוירוספירה כפי שמתואר קודם לכן. לאחר 7 – 10 ימים בתרבות, הצלחת צריכה להיות מועשרת עם נוירוספירות משניות. הערה: תרבויות אלה יכול להיות החוצה עד 8x עם יעילות טובה, לאחר איזה גודל נוירוספירה נוטה להיות קטן יותר מרמז על ירידה בהתפשטות.</li>
	<li>לספור את התאים על ההאבל ואת הצלחת המספר האופטימלי לניסויים עתידיים על ליזין פולי-D-מצופים (6 או 12 בארות).</li>
	<li>כדי להבדיל את התאים גזע, לאסוף נוירוספירות מן המעבר השני לשמיני על ידי צנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן, למעט הוספת בידול בינוני לתוך הגלולה. הערה: לאחר 7 ימים של מבחנה, התאים גזע להבדיל לנוירונים, astrocytes, ו oligodendrocytes הפוך, כפי שמתואר על ידי כתמים עם סמן עצבי β-III טובולין, הסמן astrocytic GFAP, ו אוליגודנדרוציטים maker O4.</li>
</ol>

<ol><li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+modulation+of+the+reward+circuitry+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Sathyanesan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+connections+between+cerebellar+development%2C+behaviour+and+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).</li>
<li>Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+encode+the+expectation+of+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells encode the expectation of reward.</a> Nature. 544, 96-100 (2017).</li>
<li>Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Astrocytes+in+the+Development+of+the+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum.</a> Cerebellum. , (2019).</li>
<li>Seto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+identity+transition+from+Purkinje+cell+progenitors+to+GABAergic+interneuron+progenitors+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum.</a> Nature Communication. 5, 3337(2014).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450(2014).</li>
<li>Koziol, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+paper%3A+the+cerebellum%27s+role+in+movement+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Consensus paper: the cerebellum's role in movement and cognition.</a> Cerebellum. 13, London, England. 151-177 (2014).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Toren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133-positive+hematopoietic+stem+cell+%22stemness%22+genes+contain+many+genes+mutated+or+abnormally+expressed+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD133-positive hematopoietic stem cell "stemness" genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia.</a> Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominin+1+marks+intestinal+stem+cells+that+are+susceptible+to+neoplastic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation.</a> Nature. 457, 603-607 (2009).</li>
<li>Man, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Role+for+the+DNA+Sensor+AIM2+in+Stem+Cell+Proliferation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer.</a> Cell. 162, 45-58 (2015).</li>
<li>Fleming, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Purkinje+neuron+acts+as+a+central+regulator+of+spatially+and+functionally+distinct+cerebellar+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors.</a> Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).</li>
<li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+flow+cytometric+analysis+of+central+nervous+system+tissue+reveals+novel+functional+relationships+among+cells+expressing+CD133%2C+CD15%2C+and+CD24%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+ataxin1+disrupts+cerebellar+development+in+spinocerebellar+ataxia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).</li>
<li>Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+neurons+from+CNS+stem+cells+proliferate+in+response+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).</li>
<li>Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+differentiation+in+human+CNS+stem+cell+progeny+by+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor.</a> Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).</li>
<li>Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+with+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+Promoter+Activity+Transiently+Generate+GABA+Interneurons+in+the+Postnatal+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum.</a> Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).</li>
<li>Parmigiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+Bipotency+of+Astroglial-Like+Cerebellar+Progenitors+along+the+Interneuron+and+Glial+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages.</a> Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).</li>
<li>Wojcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cell+replenishment+postinjury+by+adaptive+reprogramming+of+Nestin%28%2B%29+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors.</a> Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).</li>
<li>Yang, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP1+is+involved+in+replenishment+of+granule+cell+precursors+following+injury+to+the+neonatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum.</a> Developmental Biology. 1606 (19), 30207(2019).</li>
<li>Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebellum%2C+sensitive+periods%2C+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebellum, sensitive periods, and autism.</a> Neuron. 83, 518-532 (2014).</li>
<li>Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+down+and+one+to+go%3A+modeling+medulloblastoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups.</a> Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133+is+a+positive+marker+for+a+distinct+class+of+primitive+human+cord+blood-derived+CD34-negative+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells.</a> Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).</li>
</ol>

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Prominin-1-ביטוי המוח בתאי גזע מתגוררים בחומר הלבן פוטנציאליים במהלך 3 השבועות הראשונים של החיים לאחר הלידה. התפשטות שלהם נשלטת בחוזקה על ידי מסלול קיפוד סוניק נתמך על ידי התאים Purkinje17. אלה תאי גזע/ושלתי לתרום בלידה מאוחרת יותר GABAergic הנקרא תאי סל ו stellate תאים. אלה נוירונים מתגוררים בשכבה המולקולרית, שם הם סינפסה על התאים purkinje והטופוגרפיה המחשב לפיסול ותפקוד דרך gabaergic עיכוב13,17,23. מלבד...

המוח הקצר מזוהה כאחד המעגלים העיקריים של תיאום תנועה מרצון1. הוא מקבל קלט מתוך העיטורים הרחבים של הציר הנוירולוגי, הכולל מידע באמצעות הפריה הפריפריה, כדי לכוונן את התפוקה ולתאם את התנועה. לאחרונה, הוא גם היה מעורב בוויסות ההכרה והרגשות על-ידי שימוש ברשתות עיבוד מידע דומות2,3,4.
המוח החלק המבוגר מורכב מקליפת מוח חיצונית וחומר לבן פנימי. בתוך מבנים אלה הם גרעיני תאיים עמוק. בדומה לשאר מערכת העצבים, ההתפתחות של המוח ה, הוא מונע על ידי התפשטות של תאים בעלי ממון רב עוצמה (תאי גזע) להגר ולהבדיל כדי להניב מבנה מאורגן היטב. בהתפתחות מוקדמת (e 10.5 – e 13.5), נישה גזע חדרית סביב החדר הרביעי המתפתח מייצר נוירונים gabaergic (כלומר, התאים purkinje, לוגרו תאים, התאים golgi) יחד עם ברז גליה5,6,7,8.
מאוחר יותר בפיתוח (postnatal שבוע אחד), נישה תא גזע שני ב שפתו מעובית מייצר MATH1-ו nestin הביע ושלתי כי להצמיח מגרריר הנוירונים הנירע9,10,11,12. לאחרונה הוגדרה נישה של תא גזע שלישי13. תאים אלה express prominin-1 (הידוע גם כ-CD133), גליקופרוטאין מפורש מקרום המגדיר מערכת משנה של תאי גזע במעי ומערכות המטטיות14,15,16. בשנת vivo מיפוי הגורל מראה כי תאי גזע אלה לייצר מפתח מולקולרי שכבה interneurons (כלומר, תאי סל ותאי stellate), יחד עם astrocytes, במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר הלידה. בעבר, היה קשה לחקור את התאים האלה בתוך מבחנה משום שיטות קודמות נדרשו טכניקות יקרות זמן רב (כלומר, מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית [facs]) התלויים על12prominin-1כתמים 12,13,17. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת החיסונית לבידוד של תאי גזע אלה שיכולים לאחר מכן להיות תרבותי בקלות והבדיל.

<table><tbody><tr><td>0.05%טריפסין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>25300054</td><td>0.05%</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>ג'יבקו; Thermo Fisher Scientific</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"מ תמיסת EDTA</td><td>קורנינג</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-פרומינין-1 מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biote</td><td>130-092-333</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>עמוד MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית אולטרה - חיבור נמוך</td><td>קורנינג</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D4513-1VL</td><td>250 U/ml</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffer</td><td>Salt Thermo Fisher Scientific</td><td>14040141</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק-HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי רקומביננטי</td><td>אנושי Promega</td><td>G507A</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס רקומביננטי אנושי</td><td>Promega</td><td>G502A</td><td>20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>לוקמיה גורם מעכב</td><td>סיגמא</td><td>L5158</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה</td><td>Lieca TCS SP5 מיקרוסקופים</td><td></td><td></td>קונפוקליים</tr><tr><td>מפריד MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-פרומינין-1</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-1331</td><td>1 ב 100</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab27952</td><td>1 ב 200</td></tr><tr><td>Neurobasal בינוני</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>O4</td><td>Millopore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>(100 U/mL)</td></tr> <tr><td>גורם גדילה שמקורו בטסיות</td><td>דם Sigma</td><td>H8291</td><td>10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-טובולין, b-III</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>1 ב-500</td></tr><tr><td>Rabit anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>1 ב-500</td></tr><tr><td>עמודות הפרדה-עמודות MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים סטרילית</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>40 &mu; מ</td></tr></tbody></table>

טיהור של prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

הנוירונים המוח ביותר לנבוע משני נישות גזע עובריים: נישה שפתיים מעובית, אשר מייצרת את כל הנוירונים glutamatergic המוח מרגש, ואת נישה אזור חדרית, אשר מייצרת את העכבות GABAergic מעצור התאים Purkinje, אשר הם נוירונים המהווים את גרעיני המוח עמוק ברגמן גליה. לאחרונה, נישה תא גזע שלישי תוארה שנוצר כאזור נבטי משני מנישה אזור חדרית. התאים של נישה זו מוגדרים על ידי משטח התא סמן prominin-1 והם מותאמים לחומר הלבן המתפתח של המוח התחתי לפני הלידה. זה נישה חשבונות עבור שכבה מולקולרית מאוחר נולד GABAergic האינטרנוירונים יחד עם שנוצר postnatally המוח האסטרוציטים. בנוסף לתפקידם ההתפתחותי, נישה זו מקבלת חשיבות טרנסלתית לגבי מעורבותו בניוון שיניים ובטווריגנזה. הביולוגיה של תאים אלה היה קשה לפענח בגלל חוסר טכניקות יעיל לטיהור שלהם. הפגינו כאן הם שיטות יעילות כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל אלה תאי גזע לאחר הלידה.

Prominin-1-חיובי פוסט לידה בתאי גזע יצרו כדורים נוירוספירה בינונית נוירוספרה עשיר בגורמי גדילה (EGF ו-bFGF). נוירוספירות אלה היו חיוביות עבור prominin-1-כתמים, הסמן המשמש בידוד, וגם ככתם עבור סמנים תא גזע אחרים כגון Nestin ו GFAP13 (איור 1). ביטוי בסמן תא הגזע נשמר ברחבי התרבות ובמשך עד לפחות שמונה פסקאות20. לאחר הנסיגה של גורמי גדילה ובנוכחות של ה-, ו-pdgf-AA (אשר הם גורמים התומכים בבידול העצבי והגליאל21,<sup...

הפגינו כאן היא שיטה יעילה וחסכונית כדי לטהר, תרבות, ולהבדיל בתאי גזע החומר הלבן מתוך המוח הימני של העכבר.

טיהור של Prominin-1+ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה וחסכונית לטיהור תאי גזע מהקטנום שלאחר הלידה. תאי גזע אלה אחראים לאינטרואורונים שנולדו מאוחר מדי מבחינה מולקולרית, אך הם גם מהווים אסטרוציטים מוחיים שמקורם לאחר הלידה. לכן, לימוד תאים אלה חשוב בבירור להבנת התפתחות המוח הקטן.באמצעות פרוטוקול זה, התשואה של תאי גזע דומה לזו של אסטרטגיה מבוססת FACS שהיא בדרך כלל יקרה פי 10. פרוטוקול זה יכול להיות מוכלל כדי לחלץ prominin-1 המביעים תאי גזע מרקמות אחרות כגון המעי ומח העצם. התחל על ידי הנחת המנה עם המוח תחת מיקרוסקופ ניתוח.השתמש מדפים מספר חמש בסדר כדי להסיר את קרום המוח וכלי דם גדולים מן המוח הקטן, ולאחר מכן להפריד את המוח הקטן מן המוח באמצעות מרית. העבר את המוח הקטן לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פתרון HBSS קר כקרח. לשטוף אותו ואז decant HBSS.חזור על לשטוף פעמיים נוספות. לאחר שטיפה האחרונה, להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון דיסוציאציה רקמות מבוסס פפאין כי כבר התחמם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. דגירה הרקמה במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לאט לערבב את התוכן של הצינור על ידי היפוך זה שלוש עד חמש פעמים כל שלוש דקות.הכן קוטר רחב וקוטר צר זכוכית פיפיטור פסטר על ידי ליטוש אש מעל מבער בונזן. לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של פתרון HBSS הקפדה להימנע לאבד רקמה תוך decantin

purification-of-prominin-1-stem-cells-from-postnatal-mouse-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים שיטה לבודד cerebellar תרבות גרגר עצב ובתאים ונוירונים גרגיר cerebellar מהעכבר לאחר הלידה.

בידוד תרבות שלאחר הלידה cerebellar עכבר גרגיר Neuron ובתאים ונוירונים

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של תאי אב עצביים במוח הקטן של גור עכברים. אבות נוירון גרגיר המוח הקטן מבודדים ומטוהרים באמצעות הידבקות דיפרנציאלית, ומסירים ביעילות אסטרוציטים. אבות מתורבתים אלה מתמיינים לאחר מכן לנוירונים גרגיריים צרבלריים.

בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינותם לתאים עצביים. תאי גזע מתרחיף התא המבודד מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ומתורבתים ליצירת נוירוספרות. לאחר מכן הנוירוספרות נשמרות במדיום התמיינות כדי ליצור תאים עצביים.

בידוד תאי גזע מהמוח הקטן של העכבר לאחר הלידה והתמיינות לתאים עצביים

ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים של עכבר לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ביעילות נמוכה על ידי ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. המתווכים הנדירים של תגובת התכנות מחדש מבודדים FACS באמצעות תיוג עם נוגדנים כנגד יצרני פני התא Thy-1.2, Ssea-1 ו-Epcam.

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

אבות להביע Nestin הם אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של אבות עצביים במוח הקטן מתפתח. שימוש בטכניקת microdissection מוצגת כאן בשילוב עם מיון תא הופעל ניאון, אוכלוסיית תא זו יכולה להיות מטוהרת ללא זיהום מאזורים אחרים של מוח קטנים ויכולה להיות מתורבת למחקרים נוספים.

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

אנחנו מציגים פרוטוקול להפקת. קרום המוח של מורציטים פרוטוקול זה הינו כלי רב ערך עבור מחקרים בלתי מתורבת המספקים טוהר גבוה ותשואה גבוהה, ובכך מקטין את מספר החיות הנסיוניות המשמשות.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

למד שיטה פשוטה וזולה לטיהור תאי גזע Prominin-1+ ממוח עכבר פוסט לידתי. הפרוטוקול מאפשר ייצור נוירוספירות והבחנה לשושלות עצביות שונות למחקר התפתחות המוח הקטן ומחלותיו.

טיהור של Prominin-1⁺ בתאי גזע מתוך עכבר המוח פוסט לידתיים

גלה סרטונים נוספים