Name: Uso dellanalogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri l'analisi del ciclo cellulare a livello di singola cellula mediante citometria di massa con IdU. Questo metodo semplice e diretto permette di studiare le proprietà di crescita delle cellule tumorali rare e i sottoinsiemi delle cellule immunitarie.

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Gli autori desiderano ringraziare gli sforzi di Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang e Justin Lyeberger per il loro supporto sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto dal Pelotonia Fellowship Program. Tutte le opinioni, i risultati e le conclusioni espressi in questo materiale sono quelli degli autori e non riflettono necessariamente quelli del Pelotonia Fellowship Program.

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<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

Il Dr. Behbehani riceve supporto di viaggio da Fluidigm. Fluidigm ha anche acquistato reagenti e materiali per uso di laboratorio.

Gli esempi qui presentati dimostrano come utilizzare una piattaforma MCM per analizzare la distribuzione del ciclo cellulare. È stato anche dimostrato che l'analisi del ciclo cellulare è sensibile alle condizioni sperimentali come il tempo e la temperatura, che è una considerazione importante che i ricercatori devono prendere quando considerano MCM per la loro analisi del ciclo cellulare14. I campioni lasciati in deposito per un breve periodo di tempo, non più di un'ora, avranno un'incorporazione ...

La citometria di massa consente di rilevare circa 40 parametri sfruttando l'alta risoluzione e la natura quantitativa della spettroscopia di massa. Gli anticorpi marcati con metallo vengono utilizzati al posto degli anticorpi coniugati con fluorofori che consentono un numero maggiore di canali e producono uno spillover minimo 1,2. MCM presenta vantaggi e svantaggi per quanto riguarda l'analisi del ciclo cellulare rispetto alla citometria a flusso. Uno dei principali vantaggi dell'MCM è che l'elevato numero di parametri consente la misurazione simultanea dello stato del ciclo cellulare in un gran numero di tipi di cellule T immunofenotipicamente distinti in campioni altamente eterogenei. MCM è stato utilizzato con successo per misurare lo stato del ciclo cellulare durante la normale emopoiesi nel midollo osseo umano3 e modelli murini transgenici di deficit di telomerasi4. L'analisi dello stato del ciclo cellulare nella leucemia mieloide acuta (LMA) ha mostrato che il ciclo cellulare è correlato alle risposte note alle terapie cliniche, fornendo una visione in vivo delle caratteristiche funzionali che possono informare le selezioni terapeutiche5. Un secondo vantaggio dell'analisi del ciclo cellulare citometrico di massa è la capacità di misurare un gran numero di altri marcatori funzionali che possono essere correlati con lo stato del ciclo cellulare. Recenti lavori sono stati in grado di correlare la sintesi di proteine e RNA con lo stato del ciclo cellulare attraverso l'uso di IdU e anticorpi marcati con metallo a BRU e rRNA6. Questo tipo di analisi altamente parametrica che misura lo stato del ciclo cellulare in numerose popolazioni in un continuum di differenziazione sarebbe quasi impossibile con l'attuale tecnologia di citometria a flusso. Il principale svantaggio dell'MCM è la mancanza di coloranti di DNA o RNA comparabili a quelli utilizzati nella citometria a flusso fluorescente (ad esempio, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, ecc.). I coloranti fluorescenti possono fornire misurazioni relativamente precise del contenuto di DNA e RNA, ma questa precisione è possibile solo a causa dei cambiamenti nelle proprietà fluorescenti di questi coloranti che si verificano dopo l'intercalazione tra basi nucleotidiche. L'analisi MCM non è quindi in grado di misurare il contenuto di DNA o RNA con precisione simile. Invece, l'analisi del ciclo cellulare citometrico di massa si basa su misurazioni di proteine correlate allo stato del ciclo cellulare come la ciclina B1, la proteina del retinoblastoma fosforilato (pRb) e l'istone H3 fosforilato (pHH3) combinato con la misurazione diretta dell'atomo di iodio dall'incorporazione di IdU nelle cellule di fase S. Questi due approcci di misurazione producono risultati molto simili durante la normale proliferazione cellulare, ma possono potenzialmente essere discordanti quando la progressione del ciclo cellulare viene interrotta.
La misurazione del numero di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare è importante per comprendere il normale sviluppo del ciclo cellulare e l'interruzione del ciclo cellulare, che è comunemente osservato nei tumori e nelle malattie immunologiche. MCM fornisce una misurazione affidabile dei fattori extracellulari e intracellulari utilizzando anticorpi marcati con metallo; tuttavia, la misurazione della fase S era limitata in quanto l'intercalatore del DNA basato sull'iridio non era in grado di distinguere tra DNA 2N e 4N. Al fine di definire le fasi del ciclo cellulare, Behbehani ha sviluppato un metodo che utilizza IdU con una massa di 127, che rientra nell'intervallo del citometro di massa e consente la misurazione diretta delle cellule nella fase S3. Questa misurazione diretta elude la necessità di anticorpi secondari o l'uso di agenti denaturanti del DNA come acido o DNasi. In combinazione con marcatori di ciclo intracellulare, consente un'alta risoluzione della distribuzione del ciclo cellulare in modelli sperimentali.
Questo protocollo adatta le misurazioni del ciclo cellulare dai comuni protocolli di citometria a flusso per MCM. I nostri metodi forniscono un modo comodo e semplice per includere i parametri del ciclo cellulare. L'incorporazione di IdU di campioni in vitro richiede solo da 10 a 15 minuti di incubazione a 37 °C, che è più breve della maggior parte dei protocolli di colorazione BrdU che raccomandano tempi di incubazione di diverse ore 3,7. I campioni incorporati in IdU e BrdU possono essere fissati utilizzando uno stabilizzatore proteomico e quindi conservati per qualche tempo in un congelatore a -80 °C. Ciò consente di archiviare un gran numero di campioni colorati con IdU per l'analisi dei lotti senza ridurre la qualità del campione.

<table><tbody><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>Componente della</td></tr><tr><td>centrifuga</td> CSM <td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Centrifugazione del campione</td></tr><tr><td>Cleaved-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Identificazione di cellule apoptotiche</td></tr><tr><td>Ciclina B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Risoluzione</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Cryoconservative</td></tr><tr><td>EQ Perle di calibrazione a quattro elementi</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Standard metallico interno per prestazioni CyTOF</td></tr><tr><td>Tubo FACS con filtro a rete</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>Filtro cellulare per rimuovere grumi/detriti prima dell'esecuzione CyTOF</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Integratore per la crescita cellulare</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF Sistema/Piattaforma</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Additivo colorante per prevenire la colorazione non specifica</td></tr><tr><td>IdU (5-Iodo-2&prime;-deossiuridina)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>Incorpora nella fase S</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>Conferma del kit G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Kit di etichettatura in metallo, attacca i metalli agli anticorpi</td></tr><tr><td>Agitatore per micropiastre</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Miscelazione di campioni durante la colorazione</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Servizi di microscopia elettronica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pentametilciclopentadienil-Ir(III)-dipiridofenazina</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>Identificazione cellulare durante l'acquisizione CyTOF</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>Rilevamento di danni al DNA</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>Soluzione</td></tr> salina <tr><td>tamponata con fosfato con risoluzione in fase M (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Soluzione di lavaggio per colture cellulari e componente della soluzione fissativa</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td> Risoluzione <td>G0/G1</td></tr><tr><td>Stabilizzatore proteomico</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Fissativo per campioni</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>Componente di CSM/tampone anticorpale, biocida</td></tr></tbody></table>

uso dell'analogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (idu) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

La regolazione della fase del ciclo cellulare è un aspetto importante della proliferazione cellulare e dell'omeostasi. L'interruzione dei meccanismi regolatori che governano il ciclo cellulare è una caratteristica di una serie di malattie, incluso il cancro. Lo studio del ciclo cellulare richiede la capacità di definire il numero di cellule in ogni porzione della progressione del ciclo cellulare e di delineare chiaramente tra ciascuna fase del ciclo cellulare. L'avvento della citometria di massa (MCM) offre un enorme potenziale per l'analisi di singole cellule ad alto rendimento attraverso misurazioni dirette di isotopi elementari e lo sviluppo di un metodo per misurare lo stato del ciclo cellulare mediante MCM estende ulteriormente l'utilità dell'MCM. Qui descriviamo un metodo che misura direttamente la 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU), simile alla 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), in un sistema MCM. L'uso di questo MCM basato su IdU offre diversi vantaggi. In primo luogo, l'IdU viene rapidamente incorporata nel DNA durante la sua sintesi, consentendo una misurazione affidabile delle cellule nella fase S con incubazioni di soli 10-15 minuti. In secondo luogo, l'IDU viene misurata senza la necessità di anticorpi secondari o la necessità di degradazione del DNA. In terzo luogo, la colorazione IdU può essere facilmente combinata con la misurazione della ciclina B1, della proteina del retinoblastoma fosforilato (pRb) e dell'istone fosforilato H3 (pHH3), che fornisce collettivamente una chiara delineazione delle cinque fasi del ciclo cellulare. La combinazione di questi marcatori del ciclo cellulare con l'elevato numero di parametri possibili con MCM consente la combinazione con numerose altre metriche.

Utilizzando cellule HL-60 e un aspirato del midollo osseo umano è possibile mostrare come le condizioni sperimentali possono influenzare la distribuzione e l'analisi del ciclo cellulare. In primo luogo, la strategia di gating deve essere stabilita per dimostrare come vengono derivate le fasi del ciclo cellulare. Nella Figura 1 mostriamo l'istituzione della porta singoletto, che è importante per separare detriti cellulari e doppietti, stabilendo una singola popolazione cellulare. Per le linee...

Questo protocollo adatta le misurazioni del ciclo cellulare per l'uso in una piattaforma di citometria di massa. Con le capacità multiparametriche della citometria di massa, la misurazione diretta dell'incorporazione di iodio consente l'identificazione delle cellule in fase S, mentre i marcatori del ciclo intracellulare consentono la caratterizzazione di ogni stato del ciclo cellulare in una serie di condizioni sperimentali.

Uso dell'analogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Questo protocollo ci consente di esaminare il ciclo cellulare a livello di singola cellula utilizzando il citometro di massa, e questo consente di eseguire diverse nuove ricerche e studi clinici. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità. L'IDU viene aggiunta direttamente alle cellule e non sono necessari ulteriori trattamenti o anticorpi.Abbiamo usato questa tecnica per studiare lo stato del ciclo cellulare in pazienti con leucemia mieloide acuta all'interno dei compartimenti delle cellule staminali e progenitrici. E questo ha dimostrato che le proprietà del ciclo cellulare di questi specifici tipi di cellule possono essere correlate con l'esito clinico dei pazienti con queste malattie. Questa tecnica può essere utile per comprendere le proprietà di crescita delle cellule tumorali rare e comprendere la proliferazione dei sottogruppi di cellule immunitarie.Prima e dopo aver aggiunto IdU ai campioni cellulari, mantenere le cellule nelle condizioni di crescita di interesse. In questo caso, un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 per etichettare le cellule con IdU, diluire la soluzione madre concentrata di IdU da uno a 50 nei mezzi di crescita delle cellule. Quindi trasferire i campioni in una cappa di biosicurezza e aggiungere 10 microlitri di un millimolare IdU a ogni millilitro di cellule.Restituire le cellule all'incubatore per 10-15 minuti prima di trasferire i campioni ai singoli tubi conici. Raccogliere le celle mediante centrifugazione in tubi conici da 15 millilitri e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS per tubo. Se necessario, etichettare le celle con una macchia viva / morta appropriata per contrassegnare le cellule morte.Dopo la colorazione viva / morta, spegnere le cellule con mezzi lavati con CSM prima di fissare le cellule con 25 microlitri di paraformaldeide al 16%. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Aggiungere da cinque a 15 millilitri di CSM e centrifugare nuovamente.Risospendere i pellet in 500 microlitri di mezzo di colorazione cellulare integrato con il 10% di dimetilsolfossido. Quindi trasferire le cellule in tubi più piccoli per memorizzarle in 80 gradi Celsius negativi. Per normalizzare l'analisi del ciclo cellulare, importare i file in un programma software di analisi della citometria a flusso appropriato e creare un grafico biassiale della lunghezza dell'evento rispetto a 191 iridio.Le cellule formeranno una distinta popolazione luminosa di iridio. Modificate la scala della lunghezza dell'evento per rendere le celle più prominenti. Quindi creare un cancello di singoletto per escludere dal 50 al 60% dei doppietti e dei detriti e impostare i parametri gaussiani residui e sfalsati per rimuovere eventuali doppietti e detriti rimanenti.Per impostare il gate di fase S, creare un grafico biassiale di IdU rispetto a un marcatore di proliferazione. Le cellule IdU positive in fase S formeranno una popolazione distinta. Per G0/G1 e G2/M gating, stabilire le porte su un grafico IdU rispetto a Cyclin B1.La fase G0/G1 sarà Cyclin B1 bassa, IdU negativa, e la fase G2/M sarà Cyclin B1 alta, IdU negativa. Per individuare tipi di cellule specifici, tracciare solo le celle della fase S sul grafico Cyclin B1 rispetto a IdU per aiutare a stabilire la separazione tra le celle di fase G0 / G1 e G2 / M. Disegna un cancello intorno all'alta popolazione di Cyclin B1.In alcuni casi, questo può essere difficile da discernere, ma il livello di ciclina B1 di circa il 5% superiore della popolazione in fase S è tipicamente il punto di rottura tra le porte di fase G0 / G1 e G2 / M. Le cellule che risiedono all'interno del gate precedente saranno la popolazione di fase G2/M, mentre il resto sarà la popolazione di fase G0/G1. Per stabilire la popolazione della fase G0, creare una proteina del retinoblastoma fosforilato rispetto al grafico IdU.La fase G0 sarà rappresentata da una proteina fosforilata del retinoblastoma a bassa popolazione, IdU negativa. Poiché la popolazione ciclica attiva dimostrerà un'elevata proteina di retinoblastoma fosforilato e l'incorporazione di IdU, la porta di fase G0 può essere disegnata su questo confine in quanto si esprime tipicamente in due popolazioni distinte. Se il gate G0 è difficile da definire, rendere la popolazione in fase S la popolazione attiva e disegnare un gate che incorpori il 90-100% superiore della popolazione ad alta proteina del retinoblastoma fosforilato.La bassa popolazione della proteina retinoblastoma fosforilata al di fuori del gate è tipicamente la popolazione G0, mentre le cellule G0 / G1 con livelli di pRb che cadono in questa porta sono cellule G1. Per il gating in fase M, creare un IdU rispetto all'istone fosforilato H3 mediante tracciatura assiale. La fase di fase M sarà osservata come la frazione molto piccola di cellule all'interno della popolazione di istoni fosforilati H3.Le cellule nella popolazione G2/M con livelli più bassi di pHH3 sono le cellule G2. Se l'incorporazione di IdU non è riuscita o non è stata possibile, definire le frazioni cellulari cicliche e non cicliche utilizzando Ki67 e la proteina del retinoblastoma fosforilato. La popolazione doppia positiva rappresenterà la popolazione ciclica attiva correlata alle fasi G1, S, G2 e M.La popolazione doppia bassa rappresenterà la popolazione non ciclica correlata alla fase G0. Una volta stabilite tutte le porte, esportare i valori numerici dalle porte. Le percentuali in ogni ciclo possono essere ottenute sottraendo le singole popolazioni dalle popolazioni combinate per generare valori numerici per ogni singola fase del ciclo cellulare per la successiva rappresentazione grafica e analisi statistica.L'istituzione della porta singoletto è importante per separare i detriti cellulari e i doppietti per consentire l'isolamento della popolazione monocellulare. È quindi possibile eseguire l'analisi del ciclo cellulare delle singole cellule. L'etichettatura IDU e quindi l'analisi del ciclo cellulare a valle possono essere influenzate in modo significativo dal tempo e dalla temperatura.Ad esempio, le cellule che rimangono troppo a lungo in vasi chiusi o nel trasporto tra le posizioni avranno frazioni di fase S ridotte e ciò non sarà accurato per l'analisi del ciclo cellulare. I campioni di cellule conservati per brevi periodi di un'ora o meno dimostrano ancora una normale distribuzione del ciclo cellulare, indicando che un trasporto rapido potrebbe non avere un impatto negativo sull'analisi. Le cellule crioconservate possono richiedere un lungo periodo di equilibrio prima che le cellule ritornino al ciclo cellulare attivo, che potrebbe ancora non riflettere lo stato del ciclo cellulare di pre-crioconservazione.Diversi tipi di cellule possono anche essere influenzati in modo differenziale dalle condizioni di mantenimento. Ad esempio, in questo campione di midollo osseo umano, le cellule T hanno dimostrato una riduzione del numero di cellule rispetto ai monoblasti dello stesso campione. Un altro vantaggio della citometria di massa è la capacità di discriminare le cellule nell'arresto del ciclo cellulare o che hanno una distribuzione anormale del ciclo cellulare.Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che è facilmente compatibile con altre misurazioni della citometria di massa come la fenotipizzazione superficiale, la struttura della cromatina, lo stimolo delle citochine intracellulari, che può essere correlato con lo stato del ciclo cellulare. Abbiamo usato questa tecnica per studiare l'esaurimento delle cellule immunitarie, la senescenza e per dimostrare che la risposta alla chemioterapia nei pazienti con leucemia acuta può essere correlata con le proprietà del ciclo cellulare delle cellule leucemiche.

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Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti per quantificare due turni successivi di divisione cellulare. Questa strategia è utile per rilevare il ricambio cellulare del longevo tessuti, la trasformazione oncogena, o di transito amplificazione cellule.

Rilevazione immunofluorescenza di due analoghi della timidina (CldU e IDU) in tessuto primario

Determinare la posizione del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, o la comprensione di come i segnali influenzano la proliferazione, può essere facilmente misurato mediante citometria di flusso utilizzando questo protocollo. Riportiamo un semplice approccio sperimentale alla colorazione delle cellule e quantificare la loro posizione nel ciclo cellulare.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l'uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l'introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Questo video descrive il protocollo per la colorazione in immunofluorescenza BrdU. La tecnica consente l'identificazione di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare. L'aggiunta di coloranti del DNA e la marcatura degli anticorpi consentono l'analisi dettagliata del destino delle cellule della fase S in tempi successivi.

Colorazione in immunofluorescenza BrdU: una tecnica per identificare le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare

Il video dimostra un approccio basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali. Le cellule trattate con idrossiurea producono DNA a filamento singolo, rilevato attraverso l'immunofluorescenza. Il conteggio dei focolai di fluorescenza verdi indica il livello di stress di replicazione nelle cellule tumorali.

Un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare lo stress di replicazione nelle cellule tumorali

Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

L'analisi del ciclo cellulare con etichettatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e fosfo-istone H3 (pH3) è una procedura in più fasi che può richiedere un'ampia ottimizzazione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive tutti i passaggi per questa procedura, compresa l'analisi e la quantificazione delle immagini per distinguere le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.

Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila

Descriviamo due protocolli complementari per determinare con precisione la durata della fase S in S. cerevisiae utilizzando EdU, un analogo della timidina, che viene incorporato in vivo e rilevato utilizzando la chimica Click mediante microscopia e citometria a flusso. Permette una facile caratterizzazione della durata della replicazione del DNA e dei difetti di replicazione trascurati nei mutanti.

Determinazione della durata della fase S mediante incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina in Saccharomyces cerevisiae

Scopri l'analisi del ciclo cellulare a livello di singola cellula mediante citometria di massa con IdU. Questo metodo semplice e diretto permette di studiare le proprietà di crescita delle cellule tumorali rare e i sottoinsiemi delle cellule immunitarie.

Uso dellanalogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa (Video) | JoVE Journal

Uso dell'analogo della pirimidina, 5-iodo-2′-deossiuridina (IdU) con marcatori del ciclo cellulare per stabilire fasi del ciclo cellulare in una piattaforma di citometria di massa

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