Name: Induzione e rilevamento dellapoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Impara a coltivare cellule intestinali primarie di Apostichopus japonicus per studi di biologia marina. Questo protocollo semplificato consente la coltura a lungo termine con background genetico coerente per ricerche su apoptosi e proliferazione.

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Gli autori desiderano ringraziare il prof. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (numeri di sovvenzione 41876154, 41606150 e 41406137) e dai Fondi di ricerca fondamentali per le università e gli istituti di ricerca provinciali di ].

1. Preparazione media coltura cellulare
<ol><li>
Preparazione dei fluidi coelomici
	<ol>
<li>
Raccolta di fluidi coelomici: In condizioni sterili, sezionare un cetriolo di mare sano (peso umido di 85-105 g), raccogliere il liquido coelomico e conservarlo in un pallone di vetro sterile.</li>
		<li>
Rimozione delle cellule coelomiche: Centrifugare il fluido coelomico in tubi di centrifuga 50 mL a 1.700 x g per 5 min e trasferire il supernatante in un nuovo flacone di vetro sterile; successivamente, raccogliere il fluido coelomico senza cellule del cetriolo di mare.</li>
		<li>
Inattivazione dei componenti del complemento: Incubare il pallone di vetro sterile, contenente il liquido coelomico del cetriolo di mare, in un bagno d'acqua di 40-50 gradi centigradi per 20-40 min per ottenere il liquido coelomico inattivato dai componenti di complemento.</li>
		<li>
Rimozione del microbo: Rimuovere batteri e clamidia filtrando attraverso filtri di membrana 0,22 m. Successivamente, rimuovere il micoplasma e altre particelle fini mediante filtrazione utilizzando filtri di membrana di 0,1 m per ottenere una soluzione di pretrattamento dei fluidi coelomici.</li>
		<li>
Regolazione della Salinità: Regolare la salinità della soluzione di pretrattamento del fluido coelomico a 30 o più (misurato per salinometro) aggiungendo il 20% di soluzione NaCl presterilizzata e filtrata ad alta concentrazione (diluita da liquido coelomico pretrattato) o DDW (acqua doppia distillata). Trasferire il liquido coelomico cetriolo di mare in una bottiglia sterile, sigillare la bottiglia e conservare il fluido a 4 gradi centigradi per ulteriori esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ottimizzazione media di coltura cellulare L-15 di Leibovitz
	<ol>
<li>Pesare 5,05 g di NaCl, 0,135 g di KCl, 0,15 g di CaCl2, 0,25 g di Na2SO4, 0,975 g di MgCl2, 0,25 g di glucosio e 6,25 mg di taurina e diluirli in 40 mL del mezzo L-15 di Leibovitz in un tubo sterile da 50 mL. Agitare il tubo su uno shaker per 1 h per assicurarsi che i sali si siano sciolti completamente.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 mL di L-glutamina (100 mg/mL) e 500 l di soluzione VE (1,75 mg/L) nel mezzo L-15 di Leibovitz precedentemente preparato e filtrare ulteriormente il mezzo attraverso filtri a membrana da 0,22 m.</li>
		<li>Regolare il volume medio totale a 500 mL con il fresco mezzo L-15 di Leibovitz e con 100 mL di liquido coelomico precedentemente preparato; quindi, regolare il pH a 7.6 utilizzando la soluzione NaOH. Mantenere il processo operativo in un ambiente sterile. Il rapporto di compounding del fluido coelomico può essere del 10%–50% e il 20% è sufficiente per la coltura di cellule intestinali ajaponicus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule intestinali
<ol><li>
Lavorazione dell'intestino del cetriolo di mare
	<ol>
<li>Anatescize cetrioli di mare sani in una scatola di ghiaccio. Dissezionare e raccogliere l'intestino anteriore, quindi sezionare i campioni di tessuto verticalmente e rimuovere il contenuto interno.</li>
		<li>Lavare due volte i campioni di tessuto in fosfato con buffer salina (PBS) e disinfettarli per immersione in una soluzione di etanolo acquosa (75% in volume) per non più di 2 s.</li>
		<li>Lavare i campioni di tessuto in PBS tre volte per rimuovere l'etanolo e trasferire circa 100 mg di campione di tessuto in un tubo di microcentrifuga sterile da 2,0 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta di celle
	<ol>
<li>Aggiungere 1,5 mL del mezzo di coltura pre-ottimizzato al blocco di tessuto intestinale cetriolo di mare e tritare il blocco con forbici chirurgiche sterilizzate fino a quando la soluzione è torbida. NOTA: Per un protocollo semplificato opzionale, aggiungere 0,5 mL di mezzo di coltura pre-ottimizzato al blocco di tessuto intestinale cetriolo marino e tagliare il blocco con forbici chirurgiche sterilizzate in 1 mm3. Trasferire direttamente i campioni ai piatti di coltura seguiti da successive fasi di incubazione.</li>
		<li>Aggiungere 400 l di orpina (0,25%), mescolare la soluzione per inversione e incubarla per 5 min a temperatura ambiente; quindi filtrare la soluzione utilizzando un colino cellulare di 100 m. NOTA: È facoltativo aggiungere la trypsina per la dispersione cellulare durante il trattamento di diversi campioni di tessuto. L'acido etilenediaminetraace (EDTA) deve essere contenuto in soluzione di trypsin per ridurre l'attività inibitoria da Ca2 e Mg2 in mezzo di coltura.</li>
		<li>Raccogliere il filtrato in un nuovo tubo sterile di microcentrifuga da 2,0 mL, centrifugare a 1.700 x g per 3 min, scartare il supernatante, quindi risospendere il pellet in mezzo di coltura (integrato con antibiotici) e lavarlo due volte. NOTA: Preparare un nuovo mezzo di coltura pre-ottimizzato integrato con una soluzione penicillina-streptomica del 2% (10.000 U/mL penicillina e 10 mg/mL streptomycin) e 1% gentamicin (4 mg/mL) prima dell'inizio dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cultura cellulare
<ol><li>
Preimpostazione dell'incubatore: Preimpostare l'incubatrice per la coltura cellulare e farla funzionare in anticipo per almeno 24 h con una temperatura di 18 gradi centigradi e umidità satura. NOTA: Alimentare CO2 nell'incubatrice a seconda delle proprietà medie di coltura cellulare; non deve essere fornito alcun CO2 quando si utilizza il mezzo di base dell'L-15 di Leibovitz.</li>
	<li>
Prima fase della coltura cellulare
	<ol>
<li>Per inibire la crescita dei microbi e promuovere la proliferazione durante la fase iniziale della coltura cellulare, aggiungere 10 mL di soluzione penicillina-streptomicina (10.000 U/mL penicillina e 10 mg/mL streptomycin) e 0,5 mL di gentamicina (40 mg/mL) in ogni 500 mL di coltura pre-ottimizzata. Inoltre, integrare ogni 500 mL di coltura media con 0,6 mL di insulina (10 mg/mL), 100 l di fattore di crescita simile all'insulina (0,1 g/l) e 25 -L di fattore di crescita fibroblasta (0,1 g/l).</li>
		<li>Raccogliere le cellule in tubi da 1,5 mL, risospenderle usando 200 gradi l di mezzo indicato e inserirle in piatti da 4 cm.</li>
		<li>Coltivare le cellule in un'incubatrice e aggiungere 2,0 mL di mezzo indicato alla cellula coltiva piatti dopo 6 h. Cambiare la metà del mezzo ogni 12 h fino a raggiungere la fase successiva. NOTA: Gestire il mezzo cambiare delicatamente, perché le celle non sono attaccate ai piatti strettamente. I piatti rivestiti in polisisina possono essere utilizzati per attaccare liberamente alle celle del piatto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seconda fase della coltura cellulare
	<ol>
<li>Per ridurre gli effetti negativi degli antibiotici alle cellule coltivate, ridurre di mezza la concentrazione di antibiotici indicati (penicillina, streptomicina e gentamicina). NOTA: L'utilizzo di insulina e fattori di crescita dipende dalle condizioni di coltura cellulare ed è facoltativo.</li>
		<li>Sostituire il mezzo di coltura cellulare; effettuare variazioni medie ogni due o tre giorni a seconda della densità cellulare. NOTA: Osservare quotidianamente le cellule coltivate al microscopio e registrare le condizioni di crescita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaggio cellulare NOTA: Passaggio e sottocoltura delle cellule, quando la densità cellulare primaria raggiunge il 60%.<ol>
<li>Lavare le cellule coltivate due volte utilizzando PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 200 l di soluzione di prova (0,25%) ad ogni piatto e agitare manualmente il piatto assicurandosi che l'intero fondo sia coperto. Eliminare la soluzione di riapina e incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare le cellule con 1,0 mL di mezzo di coltura fresca pipettando e rimettendo le cellule. Trasferire 0,5 mL di sospensione cellulare in un nuovo piatto, aggiungere 1,5 mL di mezzo fresco e incubare le cellule a 18 gradi centigradi. NOTA: i raschiatori cellulari possono essere utilizzati per la raccolta delle celle quando la soluzione trypsin non riesce a digerire e staccare le cellule dai piatti (alcune linee cellulari sono troppo adesive). Tuttavia, non eseguire entrambi i metodi contemporaneamente.</li>
		<li>Cambiare il mezzo dopo 12 h e osservare le cellule al microscopio per valutare le condizioni. Coltura le cellule per ulteriori saggi sperimentali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Induzione e rilevamento di apoptosi nelle cellule intestinali japonicus
<ol><li>
Coltura cellulare e trattamento dexamethasone
	<ol>
<li>Preparare le cellule intestinali seguendo il protocollo introdotto in precedenza e aggiungere le cellule dropwise a una piastra di 12 pozzetti ad un volume cellulare di 2 x 106 per bene.</li>
		<li>Dopo tre giorni di coltura, seguendo le fasi della "coltura cellulare del primo stadio", lavare le cellule tre volte con PBS e sostituire il mezzo con un mezzo ottimizzato (senza antibiotici e fattori di crescita).</li>
		<li>Dilute dexamethasone (DXMS) nel mezzo di coltura per preparare soluzioni fresche da 2 e 200 M DXMS prima di iniziare gli esperimenti.</li>
		<li>Aggiungere soluzioni DXMS in concentrazioni diverse alle cellule coltivate con lo stesso volume di mezzo di coltura; impostare tre gruppi sperimentali, tra cui il controllo (CTL), 1 M e 100 DXMS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione Hoechst 
	<ol>
<li>Lavare le cellule con PBS tre volte dopo l'incubazione con/senza DXMS per i periodi di tempo indicati (0 h, 24 h e 48 h).</li>
		<li>Aggiungere 300 luna di Hoechst 33258 soluzione per pozzo a una piastra di 12 pozzetti e incubare a 18 gradi centigradi per 30 m. Agitare delicatamente la piastra per coprire tutte le cellule garantendo la loro colorazione.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di colorazione Hoechst e fissare le cellule aggiungendo 300 l di una soluzione di paraformaldeide del 4% (in PBS) a ogni pozzo. Agitare delicatamente per 15 min. ATTENZIONE: La paraformaldeide è moderatamente tossica per contatto della pelle o inalazione, ed è designata come probabile cancerogeno umano. Cappe di fumi chimici, recinti di bilanciamento ventilato, o altre misure protettive devono essere utilizzati durante la pesata e la manipolazione della paraformaldeide.</li>
		<li>Lavare le celle fisse tre volte in PBS. Non scartare il PBS dopo il lavaggio per mantenere le cellule coperte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi microscopia fluorescente
	<ol>
<li>Accendere l'hardware del microscopio fluorescente, tra cui la potenza della lampada a mercurio, la potenza della luce fluorescente e il PC. Accedere all'account del sistema operativo, avviare il software e verificarne la configurazione.</li>
		<li>Posizionare la piastra preparata sullo stadio del microscopio. Posizionare il campione sull'obiettivo utilizzando il controller dello stage.</li>
		<li>Trova le cellule di interesse al microscopio luminoso, passa alla microscopia fluorescente e cattura le immagini sintonizzando i parametri. NOTA: Per osservare il segnale fluorescente di Hoechst 33258 legato al DNA dei nuclei, la microscopia a fluorescenza deve essere condotta con eccitazione ed emissione rispettivamente a circa 352 nm e 461 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi decenni sono stati dedicati ampi sforzi di ricerca per stabilire le linee cellulari, tuttavia, è ancora difficile fare un progresso sulla coltura a lungo termine delle cellule da invertebrati marini14,22. È stato riferito che le cellule coltivate provenienti da tessuti olothuriani rigeneranti erano vitali per un lungo periodo di tempo e un'elevata attività di proliferazione può essere rilevata in cellule specifiche17,</su...

Le cellule di coltura in condizioni controllate artificialmente, e non nel loro ambiente naturale, forniscono materiali sperimentali uniformi per studi biologici, in particolare per specie che non possono essere facilmente coltivate in un ambiente di laboratorio. Gli invertebrati marini rappresentano oltre il 30% di tutte le specie animali1e forniscono numerosi materiali biologici per intraprendere ricerche sui meccanismi normativi di processi biologici specifici, come la rigenerazione2,3, la risposta allo stress4e l'adattamento ambientale5,6.
Il cetriolo di mare, Apostichopus japonicus, è una delle specie di echinoderm più studiate che abitano acque temperate lungo la costa del Pacifico settentrionale. E 'ben noto come una specie commercialmente importante e maricultured su larga scala in Asia orientale, soprattutto in Cina7. Numerose domande scientifiche riguardanti A. japonicus, tra cui i meccanismi regolatori alla base della rigenerazione intestinale dopo l'eviscerazione8 e la degenerazione in un'aestivazione9, controllo metabolico10,11, e risposta immunitaria12,13 sotto stress termico o patogeno, hanno attirato l'attenzione dei ricercatori. Tuttavia, rispetto agli animali modello ben studiati, la ricerca di base, soprattutto a livello cellulare, è limitata da colli di bottiglia tecnici, come la mancanza di metodi avanzati di coltura cellulare.
I ricercatori hanno dedicato molti sforzi per stabilire le linee cellulari, ma hanno anche affrontato molte sfide e nessuna linea cellulare da qualsiasi invertebrato marino è stata stabilita ancora14. Tuttavia, le colture cellulari primarie da invertebrati marini sono progredite negli ultimi decenni15,16, e hanno fornito un'opportunità per la sperimentazione a livello cellulare. Ad esempio, l'intesina rigenerante da A. japonicus è stata utilizzata come fonte di cellule per colture cellulari a lungo termine che ha fornito un metodo pratico per la coltura cellulare primaria degli invertebrati marini17. Questo protocollo combinava e ottimizzato gli approcci di coltura delle cellule invertebrate e sviluppava un metodo di coltura primaria ampiamente adatto per cetrioli di mare o altri invertebrati marini.
L'apoptosi è un programma di suicidio cellulare intrinseco innescato da vari stimoli esogeni ed endogeni. L'apoptosi coordinata è fondamentale per molti sistemi biologici18,19, ed è stata implicata nella regressione intestinale del cetriolo di mare durante l'acentratura9. Per studiare il processo apoptotico negli organismi di interesse, sono stati stabiliti e applicati con successo20metodi, tra cui la colorazione di Hoechst e i saggi di microscopia. Qui, abbiamo condotto l'induzione e il rilevamento dell'apoptosi nelle cellule intestinali coltivate primarie del cetriolo marino per valutare l'usabilità delle cellule primarie negli studi biologici degli invertebrati marini. Dexamethasone, uno dei glucocorticosteroidi sintetici comunemente usati21, è stato utilizzato per indurre l'apoptosi nelle cellule intestinali coltivate dal cetriolo marino, e significativo segnale Hoechst 33258 è stato rilevato con successo nelle cellule colorate dalla microscopia fluorescente.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina</td><td>genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtro</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>piastre da 4 cm</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di paraformaldeide al 4%</td><td>Reagente chimico Sinopharm</td><td>80096618</td><td>in</td></tr><tr><td>centrifughe da banco</td> PBS <td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 kit</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Reagente Chimico</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a temperatura costante</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sinopharm Reagente Chimico XW00500221</td><td></td><td></td></tr> Bagno <tr><td>d'acqua termostatico elettrico</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sinopharm Reagente chimico 80176961</td><td></td><td>75%</td></tr> <tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamicina</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 Soluzione colorante</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>Reagente chimico Insulina</td><td>Sinopharm</td><td></td><td></td>XW1106168001</tr><tr><td>Fattore di crescita insulino-simile (IGF)</td><td>Reagente chimico PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>Genom L-15 di Leibovitz</td><td></td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (100 mg/mL)</td><td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td></td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Reagente chimico</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7.2-7.4</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Genom</td><td></td><td></td>GNM15140</tr><tr><td>misuratore di PH</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Le cellule coltivate primarie sono utilizzate in una varietà di discipline scientifiche come strumenti eccezionalmente importanti per la valutazione funzionale di sostanze biologiche o la caratterizzazione di specifiche attività biologiche. Tuttavia, a causa della mancanza di mezzi e protocolli di coltura cellulare universalmente applicabili, i metodi di coltura cellulare ben descritti per gli organismi marini sono ancora limitati. Nel frattempo, la contaminazione microbica e le proprietà politropiche comunemente presenti delle cellule invertebrate marine ostacolano ulteriormente l'istituzione di una strategia di coltura cellulare efficace per gli invertebrati marini. Qui, descriviamo un metodo facile da gestire per la coltura di cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus; inoltre, forniamo un esempio di induzione e rilevamento di apoptosi in vitro nelle cellule intestinali coltivate primarie. Inoltre, questo esperimento fornisce dettagli sul metodo di raccolta delle cellule e del mezzo di coltura appropriato. Il protocollo descritto è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini, tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea, e può fornire cellule sufficienti per molteplici applicazioni sperimentali in vitro. Questa tecnica consentirebbe ai ricercatori di manipolare in modo efficiente le colture cellulari primarie dagli invertebrati marini e di facilitare la valutazione funzionale di materiali biologici mirati sulle cellule.

Qui, abbiamo stabilito la coltura primaria delle cellule intestinali di A. japonicus e abbiamo fatto passare le cellule. La figura 1 mostra le celle rotonde in diverse fasi di coltura. E i saggi di colorazione EdU forniscono prove dirette per rivelare l'attività proliferaria di queste cellule rotonde nella fase successiva (Figura 2). Abbiamo anche leggermente regolato il protocollo, coltivando i blocchi di tessuto macinato invece delle cellule filtrate;...

Questo protocollo fornisce un metodo facile da gestire per la coltura delle cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus japonicus ed è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea.

Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Il protocollo fornisce un metodo di coltura cellulare primaria facile da gestire e ampiamente compatibile per gli invertebrati marini. Questa tecnica offre ai ricercatori un modo per coltura delle cellule invertebrate marine per un tempo relativamente lungo. Una coltura di cellule dovrebbe essere fornita con un background genetico coerente per diverse ulteriori applicazioni biologiche sperimentali nella ricerca sulla biologia marina.Per quanto riguarda la nuova ricerca in questo campo, riteniamo che il protocollo semplificato indicato debba essere la buona scelta da esercitare. Dopo l'anestesia, sezionare e raccogliere l'intestino anteriore, quindi sezionare i campioni di tessuto verticalmente e rimuovere il contenuto interno. Lavare i campioni di tessuto in PBS due volte e disinfettarli per immersione in una soluzione di etanolo al 75% per non più di due secondi.Quindi lavare i campioni di tessuto in PBS tre volte per rimuovere l'etanolo e trasferire circa 100 milligrammi di campione di tessuto in un tubo di micro centrifuga sterile a due millilitri. Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo di coltura pre-ottimizzato al blocco del tessuto intestinale del cetriolo marino e tritare il blocco con forbici chirurgiche sterilizzate fino a quando la soluzione è torbide. Aggiungere 400 microlitri dello 0,25% di tripside.Mescolare la soluzione per inversione e incubarla per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi filtrare la soluzione utilizzando un colino a celle da 100 micron e raccogliere il filtrato in un nuovo tubo sterile a micro centrifuga a due millilitri. Per il protocollo semplificato opzionale, i blocchi di tessuto tagliati in supporti coltivati possono essere trasferiti direttamente nei piatti e successivamente incubati.Centrifugare il tubo a 1700xG per tre minuti, scartare il supernatante, quindi sospendere di nuovo il pellet nel mezzo di coltura con antibiotici e lavarlo due volte con mezzo di coltura. Pre-impostare l'incubatore per la coltura cellulare e eseguito in anticipo per almeno 24 ore con la temperatura di 18 gradi Celsius e l'umidità satura. Quindi sospendere di nuovo le celle utilizzando 200 microlitri di mezzo indicato e trasferirle in piatti di quattro centimetri.Coltura delle cellule in un'incubatrice. Dopo sei ore, estenerli dall'incubatrice e aggiungere due millilitri di mezzo indicato ai piatti di coltivazione cellulare. Ogni 12 ore, cambia metà del mezzo.Dopo cinque o sette giorni, le cellule iniziano a dividersi. Ridurre gli effetti avversi degli antibiotici riducendo della metà la concentrazione di antibiotici, penicillina, streptomicina e gentamicina indicati nel mezzo di coltura. Ogni due o tre giorni, sostituire il mezzo di coltura cellulare.Quando la densità della cella primaria raggiunge il 60% conduce la passaging cellulare. In primo luogo, lavare le cellule coltivate due volte utilizzando PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di tripside allo 0,25% ad ogni piatto e agitare manualmente i piatti, assicurandosi che l'intero fondo sia coperto.Scartare la soluzione di tripina e incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con un millilitro di mezzo di coltura fresco pipettando e sospendendo di nuovo le cellule. Trasferire 0,5 millilitri di sospensione cellulare in un nuovo piatto.Aggiungere 1,5 millilitri di mezzo fresco e incubare le cellule a 18 gradi Celsius. Dopo 12 ore, cambiare il mezzo e osservare le cellule al microscopio per valutare le condizioni. Preparare tre gruppi sperimentali, tra cui un controllo, e due gruppi di soluzioni, con un deximethazone micromolare e 100 micromolare.Dopo l'incubazione con o senza deximethazone per zero, 24 o 48 ore, lavare le cellule tre volte con PBS. Dopo aver spento la luce, aggiungere 300 microlitri di soluzione hoechst 33258 per pozzo a una piastra di 12 pozzi e agitare delicatamente la piastra per coprire tutte le celle, garantendone la colorazione. Incubare a 18 gradi Celsius per 30 minuti.Quindi rimuovere la soluzione di colorazione hoechst e fissare le cellule aggiungendo 300 microlitri di soluzione di paraformaldeide al quattro per cento in PBS ad ogni pozzo. Agitare delicatamente per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule fisse tre volte in PBS.Mantenere il PBS dopo l'ultimo lavaggio per mantenere le celle coperte. Accendi l'hardware del microscopio fluorescente, tra cui la potenza della lampada a mercurio, la potenza della luce fluorescente e il PC. Accedere all'account del sistema operativo, avviare il software e verificarne la configurazione. Posizionare la piastra preparata sullo stadio del microscopio.Posizionare il campione sull'obiettivo utilizzando il controller del palco. Trova le cellule di interesse al microscopio luminoso. Passare alla microscopia fluorescente e regolare i parametri dell'eccitazione e dell'emissione a circa 352 e 461 nanometri, rispettivamente, per l'osservazione del DNA dei nuclei.Acquisire le immagini. In questo studio, è stata stabilita e passaggi la coltura cellulare intestinale primaria del cetriolo marino. Qui vengono mostrate cellule rotonde in diverse fasi di lavorazione.Qui ci sono cellule attaccate al fondo dei piatti il terzo giorno, dopo essere state seminate. Ecco la proliferazione cellulare il settimo giorno. Qui ci sono cellule attaccate al fondo dei piatti dopo la passaging.E cellule che hanno perso attività e stavano morendo dopo 10 passaggi. L'EDU che afferma i saggi fornisce prove dirette per rivelare l'attività proliferativa di queste cellule rotonde nelle fasi successive. La stimolazione con un deximethazone micromolare ha aumentato la velocità cellulare apoptotica più rapidamente, rispetto al controllo e alla stimolazione di deximethazone micromolare 100 micromolare.Le cellule coltivate sono state trattate con deximethazone per diversi periodi di tempo, seguite dalla colorazione hoechst 33258 per il rilevamento di cellule apoptotiche. I trattamenti cellulari prima dell'incubazione sono fondamentali per il controllo a lungo termine. È un promemoria per provare il protocollo semplificato opzionale quando la cella non cresce bene.La paraformaldeide è moderatamente tossica per contatto con la pelle o inalazione, ed è documentata come cancerogeno probabilmente umano.

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Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

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