Name: Modello in vitro dellangiogenesi coronarica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Impara a creare un modello in vitro dell'angiogenesi coronarica utilizzando colture di esplanti di seno venoso ed endocardio di embrioni di topo. Questo metodo consente di studiare la risposta cellulare al VEGF-A e i meccanismi molecolari della formazione dei vasi sanguigni cardiaci.

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Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Sharma per aver fornito un ambiente di ricerca favorevole. Ci piace estendere un ringraziamento speciale a Diane (Dee) R. Hoffman che mantiene e si prende cura della nostra colonia di topi. Vorremmo anche ringraziare i dottori Philip J. Smaldino e Carolyn Vann per la revisione completa del manoscritto e fornire commenti utili. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi provenienti da Ball State University Provost Office e Department of Biology a B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondi a B.S, e NIH (RO1-HL128503) e i fondi della New York Stem Cell Foundation a K.R.

L'uso di tutti gli animali in questo protocollo ha seguito le linee guida del Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Stabilire allevatori di topi e rilevare spine vaginali per gravidanze a tempo
<ol><li>Impostare una gabbia per l'allevamento di topi selvatici di tipo maschile e femminile. Assicurarsi che l'età dei topi da riproduzione sia compresa tra 6-8 settimane. Impostare una coppia (1 maschio e 1 femmina) o come trio (1 maschio e 2 femmina) per l'allevamento.</li>
	<li>Verificare la presenza di una spina vaginale la mattina seguente. Utilizzare una sonda metallica angolata per rilevare una spina profonda inserendola nell'apertura vaginale. Designare la mattina di un tappo vaginale positivo per essere giorno embrionale 0.5 (e0.5). NOTA: Una spina vaginale può essere superficiale (che è facilmente visibile, vedere Figura 1) o profonda (che non è facilmente visibile). La presenza di una spina profonda bloccherà l'inserimento completo della sonda, mentre l'assenza di una spina consentirà l'inserimento completo senza resistenza.</li>
	<li>Mantenere la gravidanza a tempo fino a quando gli embrioni raggiungono e11.5 in cui saranno raccolti. Per confermare la gravidanza prima della raccolta degli embrioni, registrare il peso dei topi femminili tra e7.5 e e11.5. NOTA: L'aumento giornaliero del peso della madre indicherà una gravidanza di successo, mentre nessun cambiamento di peso indicherà una gravidanza fallita.</li>
</ol>2. Raccolta di embrioni da topi in gravidanza
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: una camera di eutanasia CO2, 70% di etanolo, asciugamani di carta, pinze regolari, pinze fini, forbici, 1x sterile fosfato-bufferato salina (PBS), 10 cm sterile sterile piatti Petri, contenitore con ghiaccio, cucchiaio perforato, dissezione stereomicroscopio.
<ol><li>Mettere un topo incinta e11.5 in una camera di eutanasia di CO2 pulita per sacrificarlo. Chiudere il coperchio della camera per evitare che il mouse esui.</li>
	<li>Dopo aver fissato il mouse nella camera di eutanasia, attivare CO2. Assicurarsi di regolare la portata di CO2 per le raccomandazioni IACUC (cioè 10-30% di spostamento al minuto). Dopo che il topo è completamente eutanasia, eseguire lussazione cervicale per garantire la morte.</li>
	<li>Spruzzare il mouse con 70% di etanolo. Sollevare la pelle sul ventre utilizzando pinze, fare una piccola incisione utilizzando un paio di forbici ed estendere l'incisione lateralmente. Ingrandire l'incisione anteriormente fino al diaframma ed esporre il corno uterino contenente gli embrioni (Figura 2).</li>
	<li>Estrarre la stringa di embrioni (corno uterino - embrioni) afferrando l'utero e tagliandolo libero. Mettere la stringa di embrioni in 1x PBS sterile a freddo ghiaccio.</li>
	<li>Dissezionare i singoli embrioni dal corno d'utero staccando il muscolo uterino, il sacco del tuorlo e l'amnione uno per uno(Figura 3A-F) sotto uno stereomicroscopio. Trasferire gli embrioni puliti con un cucchiaio perforato in un piatto Petri contenente sterile 1x PBS sul ghiaccio. Assicurarsi di mantenere gli embrioni freddi.</li>
</ol>3. Isolare i cuori da e11.5 Embrioni
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: pinze regolari, pinze sottili, 1x sterile PBS, 10 cm sterile piatto Petri, 6 cm sterile Petri parabola, contenitore con ghiaccio, cucchiaio perforato, dissezione stereomicroscopio.
<ol><li>Impostare un nuovo piatto Petri con sterile ghiacciato 1x PBS sotto uno stereomicroscopio. Trasferire un embrione dalla fase 2.5 nel piatto Petri per sezionare il cuore.</li>
	<li>Rimuovere la testa dell'embrione con le pinze. In primo luogo, spremere la testa tra le pinze con una mano e quindi rimuovere la testa raschiando via con l'altra mano utilizzando pinze chiuse (Figura 4A-C).</li>
	<li>Dopo aver rimosso la testa, orientare l'embrione con il lato ventrale tenendo l'embrione con le pinze alla pancia con una mano (Figura 4D).</li>
	<li>Con l'altra mano, aprire la parete toracica dell'embrione prima facendo una piccola incisione nel torace leggermente sopra il diaframma utilizzando pinze sottili. Quindi, ingrandire l'incisione con molta attenzione inserendo pinze chiuse e strappando la parete toracica aprendo le pinze. Assicurarsi di non spingere troppo in profondità, che può danneggiare il cuore. Con l'aiuto delle pinze, tenere la parete toracica spalancata per esporre il cuore e i polmoni nella cavità toracica (Figura 4E).</li>
	<li>Usando le pinze sottili, muovi delicatamente il cuore anteriormente (90o) ed esponi l'aorta/veina dorsale. Estrarre il cuore/ polmoni anteriormente catturando l'aorta/vena dorsale alla base del cuore (Figura 4F-H). NOTA: Sii gentile mentre estrai il cuore /i polmoni per evitare lo strappo della SV, che si trova sul lato dorsale del cuore.</li>
	<li>Sciacquare il cuore/polmone con 1x PBS freddo per rimuovere le cellule del sangue.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.6 per rimuovere il cuore/i polmoni dagli embrioni rimanenti. Assicurarsi di tenere il cuore/polmoni isolati sul ghiaccio.</li>
</ol>4. Isolamento di SAv e Ventricoli da e11.5 Cuori murini embrionali
<ol><li>Posizionare il piatto Petri con cuore/polmoni dal punto 3.7 sotto uno stereomicroscopio per isolare i SV e i ventricoli interi. Sbucciare i lobi attaccati dei polmoni uno ad uno dalla loro radice utilizzando pinze fini.</li>
	<li>Orientare il cuore sul lato dorsale e rimuovere gli atri e il tessuto adiacente che circonda la SV anteriormente senza strappare la SV. Rimuovere gli atri sinistro e destro dal cuore tenendo alla sua base e raschiandolo via con pinze sottili (Figura 5B). Rimuovere il tessuto adiacente che circonda l'SV con una tecnica simile (Figura 5C). NOTA: Tenere presente che l'atrio giusto è collegato all'Atrio, quindi fate attenzione a rimuovere solo l'atrio.</li>
	<li>Per isolare l'SV, prima orientare il cuore con il suo lato dorsale rivolto verso l'alto (perché la SV è sul lato dorsale) e mantenere il cuore ancora in questa posizione tenendo delicatamente il cuore ai suoi ventricoli con pinze. NOTA: L'SV è un organo in flusso di un cuore embrionale che si trova tra gli atri sul lato dorsale del cuore.</li>
	<li>Rimuovere la SV staccandolo con cura dal cuore dove è attaccato o tenendo la SV alla base del suo attacco con pinze sottili e raschiandola con pinze chiuse (Figura 5D,E).</li>
	<li>Trasferire la SV isolata in una nuova parabola Petri di 6 cm con sterile ghiacciato 1x PBS sul ghiaccio utilizzando una pipetta di trasferimento sterile ed etichettare il piatto Petri come SV.</li>
	<li>Per isolare tutti i ventricoli, rimuovere il tratto di deflusso (aorta e tronco polmonare) dal cuore dopo la rimozione della SV (Figura 5F,G).</li>
	<li>Trasferire l'intero ventricolo in un nuovo piatto Petri di 6 cm contenente sterile 1x PBS sul ghiaccio utilizzando una pipetta di trasferimento sterile ed etichettare il piatto Petri come ventricoli. Tenere l'Isolato SV e ventricoli sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.7 per isolare gli SV e i ventricoli dai cuori rimanenti.</li>
</ol>5. Impostazione di piastre di coltura dei tessuti con inserti e rivestimento a matrice extracellulare
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di disporre delle seguenti attrezzature e reagenti: soluzione a matrice extracellulare commerciale (ECM; ad esempio, Matrigel), 8,0 inserti di coltura in polietilene terephthalate (PET), 24 piastre di pozzo, 37 gradi centigradi, 5% di incubatore di CO2.
<ol><li>Lasciare scongelare la soluzione ECM sul ghiaccio. Mantenere la soluzione ECM sul ghiaccio per evitare la solidificazione.</li>
	<li>Collocare gli inserti della coltura della membrana PET (dimensione del poro - 8,0 m, area di filtrazione - 0,3 cm2, diametro del filtro , 6,5 mm) nei pozzi della coltura non tissutale trattati 24 piastre di pozzo. Etichettare le piastre come SV o ventricoli per la SV o i saggi di angiogenesi endocardiale, rispettivamente. NOTA: Impostare gli inserti in piastre separate per l'SV e i ventricoli quando si eseguono entrambe le colture contemporaneamente. Assicurarsi di impostare abbastanza pozzi per tutti i campioni e controlli sperimentali.</li>
	<li>Dopo lo scongelamento della soluzione ECM, diluire immediatamente ECM 1:2 in un supporto basale preraffreddato (ad esempio, supporto basale EBM-2, vedere Tabella dei materiali) a un volume sufficiente (100 L/inserire x numero di inserti). NOTA: Ad esempio, se ci sono sei inserti, il volume totale sarà 100 x 6 x 600 L. Aggiungere 200 L di ECM in 400 - L di supporto basale.</li>
	<li>Rivestire gli inserti con 100 gradi di ECM appena diluito aggiungendolo direttamente sopra la membrana. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per almeno 30 min per consentire all'ECM di solidificare. NOTA: Questa operazione deve essere eseguita in una cappa di coltura del tessuto a flusso laminare per evitare la contaminazione.</li>
</ol>6. SV e Culture Ventrili Intere
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: 70% etanolo, transfer pipette, stereomicroscopio, pinze, cappa di coltura del tessuto flusso laminare, kit di supplemento di cellule endoteliali microvascolari (Tabella dei materiali), mezzo basale, 1xe steril e PBS). La figura 6 mostra il flusso di lavoro della cultura SV e ventricola.
<ol><li>Scongelare il contenuto del kit di supplemento sul ghiaccio. Preparare il mezzo completo aggiungendo tutti i contenuti del kit di supplemento in 500 mL di mezzo basale sotto un cofano di coltura del tessuto a flusso laminare certificato. Mescolare bene il mezzo e distribuirlo in aliquote da 50 mL.</li>
	<li>Sterilizzare la base dello stereomicroscopio e dell'area di lavoro circostante con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Ottenere le piastre di coltura dei tessuti dal punto 5.4. Con l'aiuto di una pipetta di trasferimento, trasferire attentamente gli espianti dal passaggio 4.7 sulla parte superiore della membrana di inserimento. Sotto uno stereomicroscopio e con l'aiuto di pinze pulite, posizionare i semiplants al centro degli inserti per assicurarsi che non siano bloccati nell'angolo degli inserti o attaccati alle pareti laterali.</li>
	<li>Dopo aver posizionato e centrato gli inserti agli espiatori, rimuovere con attenzione eventuali PBS aggiuntivi dagli inserti e chiudere i coperchi delle piastre.</li>
	<li>Sotto un cofano di coltura del tessuto di flusso laminare, aggiungere 100 L del mezzo completo preriscaldato sopra gli inserti e 200 L nei pozzi per lacoltura degli espianti all'interfaccia aria-liquido in modo che la superficie basale dell'inserto sia a contatto con il mezzo , ma la superficie superiore è esposta all'aria. NOTA: Assicurarsi di regolare il volume per ottenere un'interfaccia aria-liquido se si utilizzano inserti di dimensioni diverse/ piastre di pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 300 l di PBS nei pozze inutilizzati delle 24 lastre del pozzo e coprire con il coperchio. Incubare la piastra in un incubatore di CO2 a 37 gradi e coltivare le culture per 5 giorni.</li>
	<li>Nei giorni successivi, osservare regolarmente le colture al microscopio luminoso invertito per valutare lo stato delle colture espiante. Assicurarsi che gli espianti esibiscano il pestaggio contrattile e che tutti gli espianti siano attaccati alla parte inferiore della membrana incorporata con ECM. Prendere nota di eventuali espianti galleggianti. NOTA: la contrazione periodica degli espianti indica che sono vivi. Gli espianti galleggianti devono essere omessi dall'analisi.</li>
	<li>Dopo aver valutato lo stato culturale, rimettere la piastra di coltura nell'incubatrice e continuare a far crescere la coltura per un massimo di 5 giorni.</li>
</ol>7. Trattamento delle colture con VEGF-A (controllo positivo)
NOTA: prima di iniziare, assicurarsi di disporre delle seguenti attrezzature e reagenti: cappa di coltura del tessuto del flusso laminare, 1x PBS, supporto basale , 1% siero bovino fetale (FBS), supporto basale - VEGF-A, pipette e punte pipette.
<ol><li>Preparare il supporto basale dell'1% FBS e il supporto basale - VEGF-A.<ol>
<li>Per preparare il supporto basale - 1% FBS, determinare innanzitutto il numero di pozzi di controllo necessari. Ad esempio, se ci sono tre pozze di controllo, allora 300 L/well x 3 x 900 L è il volume totale necessario. Aggiungete 9 L di FBS a 891 l di mezzo basale per rendere il mezzo basale : 1% FBS.</li>
		<li>Per preparare il supporto basale - VEGF-A, determinare innanzitutto il numero totale di pozzi che necessitano di un supporto VEGF-A. Se ci sono tre pozze, allora 300 l/well x 3 x 900 l è il volume totale e 50 ng/well x 3 x 150 ng VEGF-A. Aggiungete 150 ng di VEGF-A in 900 l di mezzo basale per rendere il mezzo basale : VEGF-A. NOTA: assemblare questa soluzione a un volume maggiore di quello calcolato per assicurare un numero sufficiente di aliquote più piccole per ogni esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno 2, rimuovere il supporto da entrambe le camere (gli inserti e i pozzi). Lavare le colture con 300 - L di 1x PBS aggiungendo 100 - L agli inserti e 200 L nei pozze. Girare saldamente le piastre un paio di volte e rimuovere il PBS.</li>
	<li>Aggiungete 300 l di mezzo basale : 1% DiF (100 gradi nell'inserto e 200 l nei pozze) per affamare le colture per 24 h.</li>
	<li>Il giorno 3, dopo la fame, aggiungere 300 l di mezzo basale : 1% DiF (100 -L nell'inserto e 200 L nei pozze di controllo) rispettivamente nei pozze di controllo e nel mezzo basale - VEGF-A (50 ng/well) nei pozze di trattamento.</li>
	<li>Dopo il trattamento, continuare a far crescere le colture nell'incubatrice.</li>
</ol>8. Fissaggio e immunostaining
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: 4% paraformaldeide (PFA), 1x PBS, anticorpi primari e secondari, uno shaker, 0.5% nonionic surfactant in PBS (PBT).
<ol><li>Il sesto giorno di coltura, rimuovere il mezzo e lavare le colture con 1x PBS a temperatura ambiente (RT).<ol>
<li>Fissare le colture aggiungendo 200 l di 4% soluzione PFA nei pozze e 100 L negli inserti. Fissare le colture a 4 gradi centigradi per 20 min mentre dondola.</li>
		<li>Dopo 20 min di fissazione, togliere la PFA dalle colture in una cappa di fumi e lavare le colture con 1x PBS aggiungendo 200 l nei pozzi e 100 L negli inserti.</li>
		<li>Ripetere i lava3x, 10 min ciascuno, mentre dondolo. Quindi procedere all'immunostaining. NOTA: tutti i passaggi di lavaggio vengono eseguiti su un banco a RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluire gli anticorpi primari (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) in soluzione di blocco (5% siero d'asino, 0,5% PBT). Aggiungete 300 l di soluzione anticorpale primaria (200 L nei pozze inferiori e 100 L negli inserti). Incubano colture negli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondolano. NOTA: Anti-VE-Cadherin viene utilizzato per etichettare la membrana cellulare endoteliale e anti-ERG 1/2/3 viene utilizzato per etichettare il nucleo delle cellule endoteliali al fine di visualizzare i germogli angiogenici delle cellule endoteliali.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare e scuotere le piastre di coltura 10x in 0.5% PBT, cambiando PBT ogni 10 min.</li>
	<li>Diluire gli anticorpi secondari (anti-ratto anti-ratto Alexa Fluor 488 e anti-coniglio anti-asino Alexa Fluor 555) in soluzione di blocco. Aggiungere 300 l dell'anticorpo secondario come al punto 8.2 e incubare le colture durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondola. Il giorno successivo, lavare gli anticorpi secondari 10x in PBT, cambiando PBT ogni 10 min. NOTA: Lavare un minimo di 10x ma più lavaggi sono migliori. Una volta completati i lavamenti, le colture possono essere conservate con 1x PBS fino a quando non vengono montate su scivoli.</li>
</ol>9. Montaggio delle colture su diapositive, imaging e analisi
NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi di avere le seguenti attrezzature e reagenti: pinze sottili, scivoli, supporto di montaggio con 4-6-diamidino-2-fenilondole (DAPI), coprilabbra e microscopio confocale. Dopo la colorazione dell'anticorpo secondario, montare le colture sui vetrini per l'imaging utilizzando i seguenti passaggi.
<ol><li>Sbucciare attentamente la membrana dall'inserto con pinze sottili e trasferirla sui vetrini mettendo il lato della membrana verso il basso e posizionando le colture espiante verso l'alto. Inserire i campioni di replica nelle stesse diapositive ed etichettare le diapositive come controllo o VEGF-A. Aggiungere alcune gocce di supporto di montaggio con DAPI direttamente sulla membrana e coprire i vetrini con gli scivoli di copertura. NOTA: Assicurarsi di evitare le bolle d'aria durante il posizionamento dei coperchi.</li>
	<li>Sigillare i bordi dei vetrini con smalto trasparente e lasciare asciugare. NOTA: Le diapositive possono essere conservate in -20 gradi centigradi per l'archiviazione a lungo termine.</li>
	<li>Diapositive di immagini con un microscopio confocale.</li>
	<li>Eseguire analisi per misurare la lunghezza della escrescenza angiogenica. Quantificare la lunghezza della crescita angiogenica misurando la distanza delle cellule endoteliali (Ve-Cadherin,ERG 1/2/3) estesa dal limite interno delle cellule ERG 1/2/3 nelle colture ventricole e dal centro degli espiatori SV nelle colture SV.<ol>
<li>Per eseguire la quantificazione utilizzando FIJI/ImageJ, scaricare prima il software FIJI.</li>
		<li>Aprire i file di immagine in FIJI: andare su File Proprietà Open . Proprietà Folder . Proprietà Filename . Aperto.</li>
		<li>Vai a Analizzare Impostare le misure Selezionare Perimetro.</li>
		<li>Selezionare lo strumento Linea retta dalla finestra principale.</li>
		<li>Disegnare una linea sulla lunghezza di un germoglio come suggerito nel passaggio 9.4.</li>
		<li>Vai a Analizzare Misurare. NOTA: le misure della lunghezza vengono visualizzate nella nuova finestra.</li>
		<li>Eseguire la quantificazione nelle immagini che rappresentano almeno tre campi di visualizzazione selezionati casualmente. Calcolare la media delle misurazioni della lunghezza del germoglio e riportarle come media e deviazione standard.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Alcuni dei passaggi più critici per la crescita con successo dei vasi coronarici dai tessuti progenitivi SV ed Endo sono: 1) Identificare e isolare correttamente il tessuto SV per la coltura SV; 2) l'uso di ventricoli da embrioni di età compresa tra e11 e 11,5 per una cultura accurata degli Endo; 3) mantenere le condizioni sterili per tutto il periodo di dissezione e mantenere i tessuti freddi in ogni momento; e 4) mantenendo le espiatori attaccate alla membrana rivestita ECM per evitare che il tessuto galleggiasse nel m...

I vasi sanguigni del cuore sono comunemente chiamati vasi coronarici. Questi vasi sono costituiti da arterie, vene e capillari. Durante lo sviluppo, i capillari altamente ramificati vengono stabiliti prima, che poi rimodellano in arterie coronarie e vene1,2,3,4,5. Questi capillari iniziali sono costruiti da cellule progenitrici endoteliali presenti nel proepicardio, nel veleno del seno (SV) e nei tessuti dell'endocardio (Endo)1,6,7,8. SV è l'organo di afflusso del cuore embrionale ed Endo è il rivestimento interno del lume del cuore. Le cellule del progenitore endoteliale presenti nella SV e nell'Endo costruiscono la maggior parte della vascolatura coronarica, mentre il proepidico contribuisce ad una porzione relativamente piccola di esso2. Il processo mediante il quale la rete capillare di vasi coronarici cresce nel cuore dalle sue cellule precursori preesistenti è chiamata angiogenesi coronarica. La malattia coronarica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e tuttavia manca un trattamento efficace per questa malattia. Comprendere i meccanismi cellulari e molecolari dettagliati dell'angiogenesi coronarica può essere utile nella progettazione di terapie nuove ed efficaci per riparare e rigenerare le arterie coronarie danneggiate.
Recentemente, un aumento nella nostra comprensione di come si sviluppano i vasi coronarici è stato in parte raggiunto attraverso lo sviluppo di nuovi strumenti e tecnologie. In particolare, l'etichettatura del lignaggio in vivo e le tecnologie di imaging avanzate sono state molto utili per scoprire l'origine cellulare e i percorsi di differenziazione dei vasi coronarici9,10,11,12. Nonostante i vantaggi di questi strumenti in vivo, ci sono limitazioni in termini di velocità, flessibilità e accessibilità. Pertanto, robusti sistemi di modelli in vitro possono integrare i sistemi in vivo per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica in modo ad alta produttività.
Qui, descriviamo un modello in vitro di angiogenesi coronarica. Abbiamo sviluppato un sistema di coltura in vitro per far crescere vasi coronarici da due tessuti progenitori, SV ed Endo. Con questo modello, mostriamo che le colture di espianto di tessuto in vitro crescono germogli di vasi coronarici quando stimolati dal mezzo di crescita. Inoltre, le colture di espiante crescono rapidamente rispetto al controllo quando stimolate dal fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A), una proteina angiogenica altamente potente. Inoltre, abbiamo scoperto che i germogli angiogenici della cultura SV subiscono una dedifferenziazione venosa (perdita di espressione COUP-TFII), un meccanismo simile all'angiogenesi SV in vivo1. Questi dati suggeriscono che il sistema culturale dell'espianto in vitro ripristina fedelmente gli eventi angiogenici che si verificano in vivo. Collettivamente, i modelli in vitro di angiogenesi che sono descritti qui sono ideali per sondare meccanismi cellulari e molecolari di angiogenesi coronarica in modo ad alta produttività e accessibile.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale 100 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>877222</td><td>Indicato nel protocollo come piastra Petri</td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Inserti per coltura con membrana PET da 8,0 uM</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-rat 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Sonda metallica angolata</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>10088-15</td><td>Angolato a 45 gradi, utilizzato per il rilevamento di tappi profondi</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ERG 1/2/3</td><td>Abcam</td><td>Abcam Ab92513</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>primario Anticorpo anti-VE-caderina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Anticorpo primario, produttore BD BioSciences</td></tr><tr><td>Serbatoio di gas CO2</td><td>Fornitori vari</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>Per 37 gradi C, 5% CO2 incubazione</td></tr><tr><td>Dissezione stereomicrosope</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Stereomicroscopio Leica S9i</td></tr><tr><td>Terreno basale EBM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>Crescita delle cellule endoteliali terreno basale</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td>ECM Corning</td><td>354230</td><td>Commercialmente noto come Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Kit di integrazione di cellule endoteliali microvascolari; Questo viene miscelato nell'EBM-2 per rendere il terreno completo EGM-2</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Software di elaborazione delle immagini (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11412-11</td><td>Utilizzato per l'embrione Fisherbrand</td></tr><tr><td>Forbici operatorie a lama dritta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di iclone (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per coltura tissutale a flusso laminare</td><td>Fisher Scientific</td><td>vari modelli disponibili</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Vectashield con DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Microscopia elettronica/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Questo è disponibile al 32%; deve essere diluito al 4%</td></tr><tr><td>Cucchiaio perforato</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>10370-18</td><td>Utile per rimuovere embrioni/tessuti da una soluzione</td></tr><tr><td>VEGF-A murino ricombinante 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>Pinza standard, Dumont #5</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Camera per topi/ratti</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>Camera per eutanasia</td></tr></tbody></table>

modello in vitro dell'angiogenesi coronarica

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Qui, descriviamo un saggio in vitro per studiare l'angiogenesi coronarica. I vasi coronarici alimentano il muscolo cardiaco e sono di importanza clinica. I difetti in questi vasi rappresentano gravi rischi per la salute come l'aterosclerosi, che può portare a infarti miocardici e insufficienze cardiache nei pazienti. Di conseguenza, la malattia coronarica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Nonostante la sua importanza clinica, relativamente pochi progressi sono stati fatti su come rigenerare le arterie coronarie danneggiate. Tuttavia, sono stati fatti recenti progressi nella comprensione dell'origine cellulare e dei percorsi di differenziazione dello sviluppo dei vasi coronarici. L'avvento di strumenti e tecnologie che consentono ai ricercatori di etichettare fluorescentmente le cellule progenitrici, seguire il loro destino e visualizzare le progenie in vivo sono state fondamentali per comprendere lo sviluppo di vasi coronarici. Gli studi in vivo sono preziosi, ma hanno limitazioni in termini di velocità, accessibilità e flessibilità nella progettazione sperimentale. In alternativa, accurati modelli in vitro di angiogenesi coronarica possono aggirare questi limiti e consentire ai ricercatori di interrogare importanti questioni biologiche con velocità e flessibilità. La mancanza di adeguati sistemi di modelli in vitro può aver ostacolato i progressi nella comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita dei vasi coronarici. Qui, descriviamo un sistema di coltura in vitro per far crescere vasi coronarici dal veleno del seno (SV) e dall'endocardio (Endo), i due tessuti progenitori da cui nascono molti dei vasi coronarici. Abbiamo anche confermato che le culture riassumono accuratamente alcuni dei meccanismi in vivo noti. Per esempio, mostriamo che i germogli angiogenici in coltura da SV downregulate espressione COUP-TFII simile a quello che si osserva in vivo. Inoltre, mostriamo che il VEGF-A, noto fattore angiogenico in vivo, stimola in modo robusto l'angiogenesi sia delle culture SV che Endo. Collettivamente, abbiamo ideato un modello accurato di coltura in vitro per studiare l'angiogenesi coronarica.

Una delle caratteristiche più sorprendenti dell'angiogenesi SV in vivo è che segue un percorso specifico e coinvolge eventi di dedifferenziazione cellulare e ridifferenziazione che si verificano in tempi e posizioni stereotipati1. Man mano che le cellule SV iniziali crescono sul ventricolo cardiaco, smettono di produrre marcatori venosi come COUP-TFII (Figura 7). Successivamente, i germogli coronarici prendono due percorsi di migrazion...

I modelli in vitro di angiogenesi coronarica possono essere utilizzati per la scoperta dei meccanismi cellulari e molecolari dell'angiogenesi coronarica. Le colture in vitro espiante di venosus e tessuti endocardio mostrano una solida crescita in risposta al VEGF-A e mostrano un modello simile di espressione COUP-TFII come in vivo.

Modello in vitro dell'angiogenesi coronarica

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Il nostro protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di indagare il meccanismo molecolare dell'angiogenesi coronarica al di fuori di un organismo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che modella accuratamente il processo di angiogenesi coronarica all'interno di un organismo, facilitando lo studio dei meccanismi dell'angiogenesi coronarica. Inizia spruzzando un topo incinta che trasporta embrioni del giorno embrionale 11,5 con il 70% di etanolo.Sollevando la pelle sul ventre con le flessione, utilizzare le forbici per fare una pelle addominale e un'incisione peritoneale lateralmente e anteriormente fino al diaframma per esporre il corno uterino. Afferrando l'utero, tagliare il tessuto libero ed estrarre il corno uterino. Posizionare la stringa di embrioni in PBS sterile ghiacciato sotto un microscopio stereo e staccare il muscolo uterino, il sacco vitellino e la copertura di amnigio da ogni embrione.Poiché ogni embrione è isolato, utilizzare un cucchiaio perforato per trasferire i tessuti in una nuova piastra di Petri contenente PBS sterile sul ghiaccio. Per raccogliere il tessuto cardiaco embrionale, trasferire il primo embrione ad essere sezionato in una nuova piastra di Petri al microscopio e posizionare l'embrione in lato ventrale verso l'alto. Utilizzare le forcep fini per fare una piccola incisione nel petto, leggermente sopra il diaframma, e inserire le forcep chiuse nell'incisione per ingrandire l'incisione.Usando le forcep per tenere aperta la parete toracica per esporre il cuore e i polmoni, usa un secondo paio di forcep per muovere delicatamente il cuore anteriormente di 90 gradi per esporre l'aorta dorsale e la vena. Quindi, afferrando questi vasi alla base del cuore, estrarre con cura il cuore e i polmoni anteriormente e risciacquare i tessuti con PBS freddo. Quando tutto il tessuto cardiaco è stato raccolto, posizionare i campioni cardiaci al microscopio e rimuovere i lobi polmonari da ogni cuore.Orientare il primo cuore sul lato dorsale, e tenendo il cuore alla sua base, utilizzare forcep fini per raschiare gli atri sinistro e destro nel tessuto adiacente che circonda la SV dal cuore. Per isolare l'SV, orientare il lato dorsale del cuore verso l'alto. Rimuovere con cura l'SV dal cuore e utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per posizionare il tessuto isolato in una nuova piastra di Petri di sei centimetri contenente PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio.Per isolare l'intero ventricoli, rimuovere il tratto di deflusso e utilizzare una nuova pipetta di trasferimento sterile per posizionare i ventricoli in una piastra di Petri separata di sei centimetri contenente PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio. Per impostare colture SV e ventricolari intere, rivestire prima le membrane di un inserto in PET di otto micrometri pore per pozzo di una piastra di coltura di 24 pozzi, con 100 microlitri di matrice extracellulare appena diluita per coltura per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quando la matrice si è solidificata, utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire un espianto su ogni inserto e spostare la piastra al microscopio.Utilizzando forcep puliti, posizionare gli espianto al centro di ogni inserto per assicurarsi che non siano attaccati alle pareti laterali e rimuovere con cura eventuali PBS aggiuntivi. Successivamente, trasferire la piastra con il coperchio chiuso sotto una cappa di coltura tissutale a flusso laminare e aggiungere 100 microlitri di mezzo completo pre-riscaldato ad ogni inserto e 200 microlitri al pozzo sotto ogni inserto. Quindi aggiungere 300 microlitri di PBS a tutti i pozzi inutilizzati e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per cinque giorni.Per il trattamento VEGF-A il secondo giorno di coltura, rimuovere il mezzo da entrambe le camere di ogni coltura e aggiungere 100 microlitri di PBS ad ogni inserto e 200 microlitri di PBS ad ogni pozzo. Dopo aver ruotato la piastra alcune volte, sostituire il PBS con 300 microlitri di mezzo basale integrati con siero bovino fetale all'1% per avviare le colture e riportare la piastra nell'incubatrice. Il terzo giorno dopo la fame, aggiungere 300 microlitri di mezzo basale fresco più siero ai pozzi di controllo e al mezzo basale più 50 nanogrammi per millilitro di VEGF-A ai pozzi di trattamento e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.Il sesto giorno di coltura, lavare le camere con PBS come dimostrato e fissare le colture con 200 microlitri del 4% di paraformaldeide in ogni pozzo e 100 microlitri di fissatore in ogni inserto. Dopo 20 minuti a 4 gradi Celsius con dondolo, lavare le colture con 300 microlitri di PBS per 10 minuti per lavaggio con dondolo a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale primaria ai pozzi e inserire per una coltura notturna a quattro gradi Celsius con dondolo.La mattina seguente, lavare le colture 10 volte in tensioattivo non ionico in PBS con dondolo, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 10 minuti prima di etichettare le colture con 300 microlitri di un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriato a quattro gradi Celsius durante la notte con dondolo. Il giorno dopo, lavare le colture 10 volte in PBS fresco con tensioattivo non ionico come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare forcep fini per sbucciare con cura la membrana da ogni inserto e posizionare le membrane su singoli vetrini al microscopio di vetro, esplantare il lato verso l'alto.Coprire i campioni con il supporto di montaggio integrato DAPI in uno scivolo di copertura e sigillare i bordi del coperchio scivola con smalto chiaro. Quando lo smalto si è asciugato, immagini le diapositive con microscopia confocale. Man mano che le cellule SV iniziali crescono sul ventricolo cardiaco, smettono di produrre marcatori venosi come Coup-TF2.Dopo cinque giorni di coltura, le cellule endoteliali SV germogliano e migrano sulla membrana. Come nel cuore embrionale, l'espressione di Coup-TF2 è ridotta man mano che i vasi migrano lontano dall'SV. Le colture stimolate con VEGF-A mostrano una maggiore crescita dei germogli angiogenici sia in densità che in lunghezza. Ulteriori colture SV stimolate da VEGF-A dimostrano un aumento quasi triplicato della lunghezza del germoglio rispetto ai controlli, suggerendo che i germogli endoteliali di SV ed endocardio rispondono a VEGF-A.È importante non perdere il tessuto SV mentre si estraggono il cuore e i polmoni, rimuovendo gli atri e pulendo il tessuto adiacente che circonda l'SV. Gli esperimenti di imaging dal vivo possono essere eseguiti per visualizzare l'angiogenesi coronarica e catturare i dettagli della dinamica cellulare e molecolare durante il processo. Questa tecnica è estremamente utile per valutare potenziali meccanismi molecolari dell'angiogenesi coronarica e come sistema modello per lo studio dell'angiogenesi in generale.

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L'analisi di co-coltura di anello aortico: Un comodo strumento per valutare il potenziale angiogenico delle cellule stromali mesenchimali In Vitro

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Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura

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Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

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Modello in vitro dell'angiogenesi coronarica

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