Attivazione e quantificazione dell'espressione genica infette da NF-B nelle cellule di coltura dei tessuti infetti
12 gennaio 2020
Qui, presentiamo un protocollo per misurare rapidamente e facilmente il fattore nucleare kappa-luce-catena-potenziatore delle cellule B attivate (NF-B) attivazione in linee cellulari che esprimono NF-B::luciferate reporter costruisce, attraverso misurazioni di luminescenza nel lisato di cella. Inoltre, l'espressione genica viene determinata tramite RT-qPCR isolata da cellule infettate da Salmonella Typhimurium.
Questo protocollo è utile per determinare le modifiche nell'attivazione NF-kappa-B nelle celle che esprimono un reporter luciferasi NF-kappa-B. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente uno schermo ad alta produttività di fattori o condizioni che portano a cambiamenti nell'attivazione NF-kappa-B. L'NF-kappa-B è un fattore di trascrizione per un'ampia varietà di processi cellulari.
Una funzione ben nota di NF-kappa-B è nell'induzione di risposte infiammatorie inducendo l'espressione di varie citochine e chemiochine. Il nostro laboratorio è particolarmente interessato all'induzione di NF-kappa-B indotta dall'agente patogeno Salmonella typhimurium. Qui, usiamo la linea cellulare HeLa che è stabilmente trasfettata con un plasmide reporter NF-kappa-B luciferasi.
Altri batteri, o anche virus o composti chimici, possono essere utilizzati in questa linea cellulare per studiare l'attivazione di NF-kappa-B. Altre linee cellulari possono anche essere utilizzate se è possibile introdurre un tale plasmide reporter NF-kappa-B luciferasi in quella linea cellulare. Qualcuno che lo fa per la prima volta può avere problemi a utilizzare correttamente la tecnica sterile necessaria per la coltura cellulare e il lavoro batterico.
Un giorno prima della stimolazione cellulare, rimuovere il supporto di crescita delle cellule HeLa 57A che sono state coltivate fino a circa il 75% di confluenza. Lavare le celle con un millilitro dello 0,05% di trippsina EDTA. Sostituire con un altro millilitro di tripside EDTA e trasferire il pallone in un incubatore di 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo che le cellule sono state staccate dal pallone, sospenderle in 10 millilitri di mezzi di crescita. Combina 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di blu Trypan, pipetta su e giù per mescolare e trasferisci 10 microlitri in uno scivolo del contatore cellulare. Contare le cellule in sospensione usando un contatore di cellule e utilizzare i mezzi di crescita per diluire le cellule a una concentrazione finale di 2,5 per 10 alle cinque cellule per millilitro in un tubo conico da 50 millilitri.
Trasferire 250 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra da 48 porri. Fissare periodicamente e capovolgare il tubo conico per garantire una sospensione cellulare omogenea. Toccare delicatamente la piastra sul lato per assicurarsi che le cellule distribuiscano uniformemente nei pozzi.
Trasferire la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% e consentire alle cellule di attaccarsi e crescere durante la notte. Scorte congelate di Salmonella su piastre di agar LB per produrre singole colonie. Trasferire le piastre in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius e consentire la crescita notturna.
Il giorno dopo, aggiungere tre millilitri di LB a tubi di coltura batterica sterili e aggiungere antibiotici appropriati al supporto. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, scegliere una singola colonia dalle colture batteriche striate e toccare il ciclo al supporto LB. Limitare i tubi dopo l'inoculazione e scartare il ciclo.
Posizionare i tubi in un'incubatrice di scuotimento impostata a 37 gradi Celsius e 180 RPM, quindi consentire ai batteri di crescere durante la notte. Al mattino, recupera colture batteriche durante la notte dall'incubatrice. Preparare i tubi per la sottocoltura aggiungendo tre millilitri di LB fresco e antibiotici.
Trasferire 30 microlitri della coltura batterica durante la notte sui mezzi appena preparati. Posizionare i tubi in un incubatore di scuotimento impostato a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione di tre ore, trasferire un millilitro di brodo LB sterile in una cuvetta di plastica per fungere da vuoto.
Trasferire 900 microlitri di LB nelle altre cuvette da utilizzare per l'analisi del campione. Trasferire 100 microlitri di sottocoltura batterica in una cuvetta contenente 900 microlitri di LB e pipettare su e giù più volte per mescolare. Ripeti questo per ogni sospensione batterica.
Accendere lo spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture batteriche ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri. Posizionare lo spazio vuoto nello spettrofotometro. Prendi nota dell'orientamento.
Chiudere il coperchio e premere il pulsante vuoto sullo spettrofotometro per ottenere l'assorbanza dello sfondo. Sostituire la cuvetta vuota con una cuvetta campione nello stesso orientamento e premere lettura. Registrare i valori OD600 di questi campioni.
Moltiplicare il valore per 10 per tenere conto del fattore di diluizione. Diluire la sospensione da uno a 10 in una cuvetta e misurare l'assorbanza, che dovrebbe dare un valore di circa 0,1 che corrisponde approssimativamente a uno per 10 al nove CFU per millilitro. In un nuovo tubo, aggiungere un volume appropriato della sottocoltura diluita alla LB fresca per ottenere una sospensione di uno per 10 all'otto CFU per millilitro da utilizzare come inoculo.
Preparare le diluizioni seriali dell'inoculo trasferendo 50 microlitri di sospensione batterica in un tubo contenente 450 microlitri di PBS sterile fino a quando non viene effettuata una diluizione finale di circa 100 CFU per millilitro. Trasferire 100 microlitri delle due diluizioni più basse, 100 e 1000 CFU per millilitro, in due piastre di agar LB e stendere la sospensione con uno spargitore di cellule per ottenere singole colonie. Trasferire queste piastre in un incubatore Celsius di 37 gradi e incubare durante la notte.
Il giorno seguente, contare le colonie e calcolare la concentrazione batterica dell'inoculo iniziale per determinare l'effettiva concentrazione di inoculo. Lo stesso giorno, etichettare il coperchio della piastra in base alle condizioni di infezione che verranno utilizzate per ogni pozzo, con ogni condizione eseguita in triplice copia. Aggiungere 10 microlitri dell'inoculo ai pozzi appropriati e aggiungere 10 microlitri di LB sterile a pozzi di controllo non infetti.
Per sincronizzare il tempo di infezione, posizionare la piastra in una centrifuga da tavolo e girare a 500 volte G per cinque minuti, assicurando che la piastra sia controbilanciata. Quindi, trasferire le cellule infette in un incubatore di anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per un'ora. Posizionare un tubo conico da 15 millilitri contenente un'aliquota di mezzi di coltura cellulare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius da utilizzare nel passaggio successivo.
Un'ora dopo il momento dell'infezione, rimuovere il tubo conico da 15 millilitri contenente mezzi di coltura cellulare dal bagno d'acqua e pulire l'esterno con il 70% di etanolo. Trasferire le piastre di coltura tissutale dall'incubatrice a un armadio per la biosicurezza. Utilizzare punte sterili per aspirare i supporti dai pozzi e sostituirli con 250 microlitri di mezzi di coltura cellulare freschi e caldi.
Riportare le piastre all'incubatore di anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per altre quattro ore. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatore di anidride carbonica e aspirare il supporto dai pozzi. Per l'analisi della luciferasi, aggiungere 100 microlitri di tampone di lysis cellulare 1X ai pozzi.
Trasferire la piastra in un congelatore negativo di 80 gradi Celsius e incubare per almeno 30 minuti per garantire un'efficiente lisi cellulare. Quindi, posizionare la piastra contenente lisato di cellule congelate su una panchina per scongelare e preparare i reagenti del substrato di luciferasi secondo le raccomandazioni del produttore. Lasciare che i reagenti del substrato di luciferasi equilibrano a temperatura ambiente.
Quindi, accendere il lettore di lastre e aprire il programma di lettura corrispondente. Impostare la macchina per misurare la luminescenza. Trasferire 10 microlitri di ogni cella lysate in un pozzo di una piastra opaca da 96 po'.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri del reagente del saggio luciferasi ad ogni pozzo della piastra opaca. Toccare delicatamente la piastra sul lato per mescolare i pozzi e assicurarsi che la superficie inferiore sia coperta di liquido. Posizionare il piatto in un lettore di lastre e iniziare la lettura.
Copiare i valori di luminescenza in un programma foglio di calcolo e tracciare i risultati. Questo protocollo si concentra sull'attivazione del fattore di trascrizione NF-kappa-B utilizzando un reporter luciferasi dipendente da NF-kappa-B che viene trasfetto stabilmente in una linea di cellule HeLa. Questa figura mostra un esperimento rappresentativo dell'attivazione della luciferasi dipendente dalla NF-kappa-B e dell'espressione genica IL6 nelle cellule HeLA 57A infettate dai ceppi di Salmonella typhimurium.
L'infezione da ceppo SL1344 di tipo selvaggio ha indotto un forte segnale luciferasi sia nell'espressione RLU che IL6, che è stato diminuito nelle cellule infettate dal mutante triplo sopB sopE2 sipA e ridotto a livelli di controllo con il mutante quadruplo sopB sopE2 sopE2 sipA. Prestare molta attenzione quando si evince le diluizioni seriali e la placcatura. Ciò ti assicurerà un inoculo coerente attraverso i tuoi ceppi.
Dopo aver identificato i fattori che contribuiscono all'attivazione NF-kappa-B e ai cambiamenti a valle nell'espressione dell'mRNA, la tecnica western blot può essere utilizzata per identificare i cambiamenti nell'espressione proteica. Questo protocollo ha permesso al nostro laboratorio non solo di valutare l'attivazione NF-kappa-B indotta dalla Salmonella, ma anche altri composti e proteine implicati nell'attivazione NF-kappa-B. Salmonella typhimurium è un agente patogeno umano.
Utilizzare DPI adeguati quando si lavora con questi batteri.
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Panoramica
Questo protocollo consente la valutazione rapida dell'attivazione di NF-魏B in linee cellulari utilizzando un reporter NF-魏B::luciferase. Include anche l'analisi dell'espressione genica tramite RT-qPCR in cellule infettate con Salmonella Typhimurium.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Immunologia
- Microbiologia
Sfondo
- NF-魏B è un fattore di trascrizione cruciale coinvolto in vari processi cellulari.
- Gioca un ruolo significativo nelle risposte infiammatorie regolando l'espressione di citochine e chemochine.
- Questo studio si concentra sull'attivazione di NF-魏B indotta da Salmonella Typhimurium.
- La linea cellulare HeLa viene utilizzata per questa ricerca grazie alla sua trasfezione stabile con un reporter luciferasi NF-魏B.
Obiettivo dello studio
- Misurare l'attivazione di NF-魏B in risposta a diversi stimoli.
- Esplorare gli effetti di Salmonella Typhimurium sulla segnalazione di NF-魏B.
- Facilitare lo screening ad alto rendimento dei fattori che influenzano l'attivazione di NF-魏B.
Metodi utilizzati
- Misura della luminescenza nei lisati cellulari per valutare l'attivazione di NF-魏B.
- RT-qPCR per l'analisi dell'espressione genica in cellule infettate.
- Utilizzo di cellule HeLa che esprimono stabilmente costrutti reporter NF-魏B::luciferase.
- Tecniche di screening ad alto rendimento per valutare varie condizioni.
Principali risultati
- Misura riuscita dei livelli di attivazione di NF-魏B in risposta all'infezione da Salmonella.
- Identificazione di fattori chiave che modulano i percorsi di segnalazione di NF-魏B.
- Dimostrazione dell'efficacia del sistema reporter luciferasi per i saggi ad alto rendimento.
- Fornitura di informazioni sul ruolo di NF-魏B nelle risposte infiammatorie.
Conclusioni
- Il protocollo offre un metodo affidabile per studiare l'attivazione di NF-魏B.
- Può essere applicato a vari contesti di ricerca che coinvolgono infiammazione e infezione.
- Questo approccio migliora la nostra comprensione del ruolo di NF-魏B nelle risposte cellulari ai patogeni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput assessment of NF-κB activation in response to infectious agents, supporting target validation in inflammatory disease pathways. By linking pathogen-induced signaling to luciferase reporter output, it provides a quantitative, reproducible readout for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation, particularly for anti-infective and immunomodulatory programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB as a central node in inflammatory signaling cascades triggered by pathogen-associated molecular patterns.
- Operational Value: Provides a stable, luciferase-based reporter system for consistent, quantitative measurement of transcription factor activation across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets upstream or downstream of NF-κB by correlating pathogen strain genetics with signal output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-responsive luminescence signals that reflect NF-κB nuclear translocation and transcriptional activity, enabling compound or strain screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and standard luminometers, facilitating medium-to-high throughput screening of chemical libraries or microbial mutants.
- Assay Readiness: Produces a linear, luminescent readout that correlates with target gene expression, supporting assay standardization and inter-lab reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Measures NF-κB-dependent gene expression (e.g., IL-6) via RT-qPCR, aligning reporter output with endogenous biomarker induction in relevant infection models.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination between bacterial virulence factors (e.g., SopE, SipA) that modulate NF-κB, informing target selection for immunomodulatory interventions.
- Disease Relevance: Models host-pathogen interactions that drive inflammatory responses, applicable to sepsis, gastroenteritis, and mucosal immunity programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, where pathway activation is assessed prior to lead identification, enabling prioritization of targets based on functional relevance in immune activation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase inhibitors, adaptor proteins, or ubiquitin ligases that regulate IκB degradation and NF-κB nuclear translocation.
- Screening: Enables evaluation of compound libraries or pathogen mutants for modulatory effects on NF-κB activity in a controlled cellular context.
- Analytics: Delivers quantitative luminescence and mRNA expression data that allow normalization, statistical comparison, and EC50/IC50 estimation.
- Translational Research: Connects reporter activation to endogenous cytokine expression, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: The HeLa-NF-κB-luciferase platform can be reused across projects involving TLR signaling, inflammasome activation, or cytokine storm models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time readout of transcription factor activation state.
- Operational Value: Standardizes NF-κB measurement across teams using a genetically encoded reporter, minimizing variability from antibody-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional pathway output in a pathogen-relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to attenuate pathogen-induced NF-κB signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, bacterial pathogenesis, and biosafety level 2 practices for Salmonella handling.
- Dependent on luminometer access and compatible plate reader software for luminescence acquisition and data export.
- Necessitates standardization of MOI, infection timing, and lysis procedures to ensure reproducible signal across experiments.
- Adaptation to primary immune cells or alternative cell lines requires successful transfection or transduction of the NF-κB-luciferase reporter construct.
- Signal interpretation must account for potential cytotoxicity or non-specific luciferase induction, necessitating parallel viability controls.
