Name: Produzione di una piattaforma di distribuzione di vaccini sensibile al vicino allinfrarosso e Core-Shell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Impara a produrre polybubble per la distribuzione di vaccini utilizzando poliesteri sensibili al vicino infrarosso. Questa piattaforma core-shell garantisce stabilità del carico e rilascio ritardato per migliorare l'accessibilità vaccinale.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Bryan E. Tomlin affiliato con il laboratorio di analisi elementale all'interno del dipartimento di chimica di TAMU che ha assistito con l'analisi di attivazione neutroni (NAA).

1. Sintesi del triacrilato policaprolacyone (PCLTA)
<ol><li>Asciugare 3,2 mL di 400 da policaprolacyone (PCL) triol durante la notte a 50 gradi centigradi in un flacone di fondo rotondo aperto di 200 mL e K2CO3 in una fiala di vetro a 90 gradi centigradi.</li>
	<li>Mescolare il tris con 6,4 mL di diclorometano (DCM) e 4,246 g di carbonato di potassio (K2CO3) sotto argon.</li>
	<li>Mescolare 2,72 mL di cloruro di acriloile in 27,2 mL di DCM e aggiungere dropwise alla miscela di reazione nel pallone oltre 5 min.</li>
	<li>Coprire la miscela di reazione con un foglio di alluminio e lasciarlo indisturbato a temperatura ambiente per 24 h sotto argon.</li>
	<li>Dopo 24 h, filtrare la miscela di reazione utilizzando una carta da filtro su un imbuto Buchner sotto vuoto per scartare i reagenti in eccesso.</li>
	<li>Precipitare filtrato dal punto 1.5 che contiene il polimero finito nell'etere dietile in un 1:3 (vol/vol) e rotovape a 30 gradi centigradi per rimuovere l'etere dietile.</li>
</ol>2. Formazione del polibolo
NOTA: L'iniezione di polimero nell'acqua deionizzata (DI) causerebbe la migrazione dei polibollli verso il fondo della fiala con conseguente appiattimento del fondo. Utilizzare 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulosa (CMC) riempire la fiala di vetro invece per evitare l'appiattimento polibubble.
<ol><li>Preparare la soluzione CMC 10% (wt/vol) in acqua DI.</li>
	<li>Riempire una fiala di vetro da 0,92 mL con 0,8 mL del 10% CMC utilizzando un tubo di trasferimento da 1 mL.</li>
	<li>Mescolare 1000 mg/mL di 14 kDa PCL in DCM e sintetizzare PCLTA in un 1:3 (vol/vol) per un volume totale di 200 L o preparare 200 L di 1000 mg/mL di 5 kDa poli (acido lattico-coglico) diacrilato (AGGA) in cloroformio.</li>
	<li>Mescolare il 2-idrossi-4-(2-idrossiethoxy)-2-metilpropiophenone (fotoiniziatore) con la miscela polimero (PLGADA o PCL/PCLTA) in 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Caricare 200 L di miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa di siringa collegata a un tubo in acciaio inossidabile di erogazione con diametro interno di 0,016 pollici.</li>
	<li>Utilizzare un micromotore per controllare il movimento in avanti e all'indietro del tubo polimero per iniettare il polimero nel 10% CMC nella fiala di vetro per formare il polibolo.</li>
	<li>Curare i polibololi sotto ultravioletti (UV) a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.</li>
	<li>Il flash congela i polibololi in azoto liquido e liofilizzare durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.</li>
	<li>Separare i polibololi dalla CMC essiccata utilizzando le fopchine e lavare i polibololi con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo. Si noti che altri polimeri possono essere utilizzati probabilmente con modifiche per alterare la cinetica di rilascio.</li>
</ol>3. Modulazione del diametro della polibolletta
<ol><li>Riempire una fiala di vetro da 0,92 mL con 10% CMC utilizzando un pipetto di trasferimento da 1 mL.</li>
	<li>Mescolare PCL/PCLTA in un 1:3 (vol/vol) con 1000mg/mL 14kDa PCL e sintetizzare PCLTA. Mescolare il fotoiniziatore con la miscela polimera in un 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Caricare la miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa di siringa collegata a un tubo in acciaio inossidabile di erogazione con un diametro interno di 0,016 pollici.</li>
	<li>Utilizzare un micromotore per controllare il movimento in avanti e all'indietro del tubo polimero per iniettare il polimero nel 10% CMC nella fiala di vetro per formare il polibolo.</li>
	<li>Per ottenere polibolle con vari diametri, variare la velocità di erogazione da 0,0005 a 1 L/s.</li>
	<li>Scatta immagini della fiala con i polibolcchi di diametro variabile.</li>
	<li>Utilizzare ImageJ per quantificare il diametro dei polibolcchi e utilizzare le dimensioni della fiala come scala.</li>
</ol>4. Centrare il carico all'interno di polibolle
<ol><li>
Modulazione della viscosità PCL/PCLTA utilizzando K2CO3: NOTA: La viscosità di PLGADA non deve essere modificata utilizzando K2CO3 perché la viscosità di 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL è sufficiente per centrare il carico.<ol>
<li>Aggiungere K2CO3 (che è stato isolato dopo la reazione PCLTA) al PCLTA a concentrazioni variabili tra cui 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.</li>
		<li>Misurare le viscosità dinamiche delle soluzioni modificando la velocità di taglio da 0 a 1000 1/s utilizzando la rieometria.</li>
		<li>Iniettare manualmente il carico al centro (fare riferimento al punto 4.2 per preparare la miscela di carico) dei polibololi che si sono formati utilizzando le soluzioni PCL/PCLTA con diverse concentrazioni di K2CO3 (punto 4.1.1). Determinare la concentrazione ottimale di K2CO3 osservando quale soluzione del punto 4.1.1 può provocare il mantenimento del carico nel mezzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Centramento del carico (già dimostrato fattibilità con piccole molecole) con CMC
	<ol>
<li>Mescolare il carico con 5% (wt/vol) CMC in un rotatore durante la notte per aumentare la viscosità del carico.</li>
		<li>Iniettare manualmente 2 L della miscela di carico nel polibubble e procedere con la poligozza UV a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.</li>
		<li>Il flash congela i polibololi in azoto liquido per 30 s e liophilize durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.</li>
		<li>Separare i polibololi dalla CMC essiccata utilizzando le finzioni e lavare con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo.</li>
		<li>Tagliare la polibolletta a metà e le metà utilizzando la microscopia confocale per garantire che il carico sia centrato (fare riferimento al punto 6 per le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione utilizzate).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Formulazione del carico
NOTA: La formulazione di polibolle può ospitare vari tipi di carico, tra cui piccole molecole, proteine e acidi nucleici.
<ol><li>Sulla base di studi precedenti, nel caso del carico proteico, utilizzare escipienti tra cui polietilene glicole (PEG)6, polivinylpyrrolidone (PVP) e glicopolimeri6 per migliorare la stabilità delle proteine durante la formulazione polibubble.</li>
	<li>Formare polibollli in base al protocollo nel passaggio 2.</li>
	<li>Preparare la soluzione antigene aggiungendo 17,11 g di trehalose a 625 l di antigene HIV gp120/41.</li>
	<li>Iniettare manualmente 1 L di soluzione antigene al centro del polibolo.</li>
	<li>Aprire le polibolle nei giorni 0, 7, 14 e 21 e registrare la fluorescenza dell'antigene con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente 497 nm e 520 nm.</li>
	<li>Determinare la funzionalità dell'antigene utilizzando l'analisi immunosorsient collegata agli enzimi (ELISA) e utilizzare il 5% di latte non grasso come tampone di blocco.</li>
</ol>6. Rilascio del carico
NOTA: Piccole molecole o antigeni possono essere utilizzati come tipo di carico
<ol><li>
Piccola molecola
	<ol>
<li>Polibololi incubati con acriflavine centrato in 400 L di salina tampone di fosfato (PBS) a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi per i polibubble PCL/PCLTA. NOTA: Il motivo per cui si consiglia di testare al di sopra delle temperature del corpo è a) simulare la temperatura (50 gradi centigradi) alla quale il polibubble raggiunge mentre si laser per i nanorod d'oro (AuNRs) all'interno di PCL e PLGA; e b) accelerare il processo di degradazione della PCL (50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi).</li>
		<li>In ogni momento, raccogliere i supernatanti e sostituirli con 400 L di PBS fresco.</li>
		<li>Utilizzare un lettore di la tavoletta per quantificare le intensità di fluorescenza nei supernatanti raccolti. NOTA: utilizzare ex/em di 416 nm/514 nm per acriflavine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigene
	<ol>
<li>Polibololi incubati con siero di albumina bovina centrato (BSA)-488 in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi, 50 gradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibollli PCL/PCLTA.</li>
		<li>In ogni momento, raccogliere i supernatanti e sostituirli con 400 PBS freschi.</li>
		<li>Utilizzare un lettore di la tavoletta per quantificare le intensità di fluorescenza nei supernatanti raccolti. Utilizzare ex/em di 497 nm/520 nm per BSA-488. NOTA: lo studio del rilascio a 70 gradi centigradi per i polibolcchi PCL/PCLTA non deve essere condotto per evitare di esporre l'antigene a temperature estreme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Tossicità
<ol><li>
Quantificare il contenuto di cloro nei polibololi utilizzando l'analisi di attivazione neutroni (NAA)
	<ol>
<li>Utilizzare polibololi che sono stati liofilizzati per 2, 4, 6, 20 e 24 h per questo studio a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.</li>
		<li>Misurare 5-9 mg di polibolcchi e posizionarli su fiale di irradiazione LDPE.</li>
		<li>Preparare 1000 g/mL di soluzione di taratura del cloro dall'Istituto nazionale di standard e tecnologia (NIST) soluzione di calibrazione tracciabile.</li>
		<li>Utilizzare il reattore Triga da 1 megawatt per effettuare irradiazioni di neutroni su ciascun campione a una velocità di fluenza neutrone di 9,1 ×10 12 /cm2per 600 s.</li>
		<li>Trasferire le polibolle in fiale non errate.</li>
		<li>Utilizzare il rilevatore HPGe per ottenere spettri a raggi gamma per 500 s dopo intervalli di decadimento di 360 s.</li>
		<li>Utilizzare il software NAA di canberra Industries per analizzare i dati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificare il contenuto di cloro rilasciato dai poliboloni utilizzando NAA
	<ol>
<li>Polibololi incubati che sono stati lyophilized durante la notte (a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi) in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Raccogliere i supernatanti nelle settimane 1, 2 e 3 dopo l'incubazione.</li>
		<li>Analizzare i supernatanti per il contenuto di cloro utilizzando NAA utilizzando lo stesso metodo descritto in precedenza nel passaggio 7.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Sintesi AuNR di Kittler, S., et al.8
<ol><li>Preparare la soluzione di semina AuNR mescolando 250 L di acido cloroaurico da 10 mM (HAuCl4), 7,5 mL di bromuro di cetrimonium da 100 mM (CTAB) e 600 l di 10 mM di boroidride di sodio freddo freddo (NaBH4).</li>
	<li>Preparare la soluzione di crescita mescolando 40 mL di CTAB 100 mM, 1,7 mL di 10 mM HAuCl4, 250 l di nitrato d'argento (AgNO3) e 270 l di acido ascorbico da 17,6 mg/mL in un tubo.</li>
	<li>Mescolare vigorosamente 420 L di soluzione di seme con la soluzione di crescita a 1200 rpm per 1 min. Quindi lasciare la miscela indisturbata per reagire per 16 h.</li>
	<li>Togliere i reagenti in eccesso dalla miscela centrifugando a 8000 × g per 10 min e scartare il supernante.</li>
</ol>9. Idrofobicizzazione degli AuNRs di Soliman, M.G., etal.
<ol><li>Regolare il pH di 1,5 mL degli AuNR sintetizzati stabilizzati CTAB a 10 utilizzando 1 mM di idrossido di sodio (NaOH).</li>
	<li>Mescolare la soluzione con 0,1 mL di 0,3 mM di tioloto metilato (mPEG) a 400 giri/min durante la notte.</li>
	<li>Mescolare gli AuNR PEGylated con 0,4 M dodecylamine (DDA) in cloroformio a 500 giri/min per 4 giorni.</li>
	<li>Pipettare lo strato organico superiore contenente AuNR idrofobicizzati e conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso futuro.</li>
</ol>10. Attivazione NIR di polibolle
<ol><li>Mescolare la soluzione polimerica (PLGADA o PCL/PCLTA) con AuNR idrofobicizzati in un 1:9 (vol/vol).</li>
	<li>Aggiungere il fotoiniziatore alla miscela polimero-AuNR in un 0.005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Formare polibololi iniettando la miscela polimero-AuNR in una fiala di vetro da 0,92 mL con 10% CMC (wt/vol) (fare riferimento al punto 2).</li>
	<li>Curare i polibololi a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm2.</li>
	<li>Congelamento del flash in azoto liquido per 30 s e liofilizzazione durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.</li>
	<li>Separare le polibolecche secche utilizzando le fopchine e lavare con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo.</li>
	<li>Incubare le polibolelle in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Attivare i polibololi utilizzando il laser NIR a 801 nm a 8A per 5 min ogni lunedì, mercoledì e venerdì.</li>
	<li>Scatta immagini a infrarossi (FLIR) lungimirative del polibolo prima e dopo l'attivazione del laser per ottenere i valori di temperatura.</li>
	<li>Calcolare le differenze di temperatura tra l'attivazione prima e dopo l'attivazione laser in base ai valori di temperatura delle immagini FLIR.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tecnologie e sfide attuali Micro- e nanoparticelle a base di emulsione sono stati comunemente utilizzati come portatori di consegna di farmaci. Anche se la cinetica del rilascio del carico da questi dispositivi è stata ampiamente studiata, il controllo della cinetica del rilascio a raffica è stata una grande sfida11. La versatilità e la funzionalità del carico sono limitate anche nei sistemi basati sull'emulsione a causa dell'esposizione del carico ai solventi aques e organici ...

La copertura immunitaria limitata comporta la morte di 3 milioni di persone specificamente causate da malattie prevenibili convaccino 1. Condizioni di stoccaggio e trasporto inadeguate portano allo stoccaggio dei vaccini funzionali e contribuiscono così a ridurre l'immunizzazione globale. Inoltre, la vaccinazione incompleta dovuta al non aderire ai programmi vaccinale richiesti provoca anche una copertura vaccinale limitata, in particolare nei paesi in via disviluppo 2. Sono necessarie visite multiple al personale medico entro il periodo raccomandato per ricevere colpi di richiamo, limitando così la percentuale di popolazione con vaccinazione completa. Pertanto, è necessario sviluppare nuove strategie per la fornitura controllata di vaccini per aggirare queste sfide.
Gli attuali sforzi per sviluppare tecnologie di consegna dei vaccini includono sistemi polimerici basati sull'emulsione3,4. Tuttavia, il carico è spesso esposto a una maggiore quantità di solvente organico che può potenzialmente causare aggregazione e denaturazione, in particolare nel contesto del carico a base diproteine 5,6. Abbiamo sviluppato una nuova piattaforma di consegna di vaccini, "polibolle", che può potenzialmente ospitare più vano di carico riducendo al minimo il volume di carico che è esposto al solvente7. Ad esempio, nella nostra piattaforma di polibolletta core-shell, una tasca di carico di diametro 0,38 mm (SEM) viene iniettata al centro di un polibubble da 1 mm. In questo caso, la superficie del carico esposta al solvente organico sarebbe di circa 0,453 mm2. Dopo aver considerato la densità di imballaggio delle sfere (microparticelle) all'interno di una sfera (deposito di carico), il volume effettivo di microparticelle (10 m di diametro) che potrebbero essere contenute nel deposito è di 0,17 mm3. Il volume di una microparticella è 5,24x10-8 mm3 e quindi il numero di particelle microparticelle che possono adattarsi al deposito è di 3,2x10particelle. Se ogni microparticella ha 20 sacche di carico (a seguito di doppia emulsione) di diametro di 0,25 m, la superficie del carico esposta al solvente organico è di 1274 mm2. Il deposito di merci all'interno della polibolletta avrebbe quindi una superficie di 2800 volte inferiore esposta al solvente organico rispetto a quella del carico organico esposto a solventi in microparticelle. La nostra piattaforma a base di poliestere può quindi ridurre potenzialmente la quantità di carico esposta al solvente organico che altrimenti può causare l'aggregazione e l'instabilità del carico.
I polibololi si formano in base al principio di separazione di fase in cui il poliestere in fase organica viene iniettato in una soluzione aques con conseguente bolla sferica. Il carico nella fase aques può quindi essere iniettato al centro della polibolletta. Un altro vano di carico può potenzialmente essere raggiunto all'interno del polibubble mescolando un carico diverso con il guscio polimero. La polibolletta in questa fase sarà malleabile e sarà quindi curata per tradurvi in una struttura in polibolletta solida con carico nel mezzo. I polibololi sferici sono stati scelti su altre forme geometriche per aumentare la capacità di carico all'interno del polibolo, riducendo al minimo le dimensioni complessive del polibolo. Polibololi con carico al centro sono stati scelti per dimostrare il rilascio ritardato burst. I polibololi sono stati incorporati anche con un agente sensibile all'infrarosso (NIR), cioè il nanorod d'oro (AuNR), per causare un aumento della temperatura dei polibololi. Questo effetto potrebbe potenzialmente facilitare una degradazione più rapida e potrebbe essere utilizzato per controllare la cinetica nelle applicazioni future. In questo articolo, descriviamo il nostro approccio per formare e caratterizzare i polibolcchi, per ottenere il rilascio ritardato di scoppio dai polibolcchi e per incorporare AuNR all'interno dei polibolo per causare l'attivazione del NIR.

Soluzione di <table><tbody><tr><td>substrato del saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) in 1 fase Ultra Tetrametilbezidina (TMB)</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-idrossi-2-metilpropiofenone</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di arresto da 450 nm per substrato</td><td>TMB Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di acriloil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acriflavina</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>Etere etilico anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HIV1 gp120 coniugato alla perossidasi di rafano (HRP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Coniugati coloranti BSA-CF488</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Acido bromosalicilico</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>Carbossimetilcellulosa (CMC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di centrimonio (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di rivestimento</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>Dodeacil Ammina</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicina cloridrato</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Pompa a siringa</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG tiolo</td><td>Laysan Bio</td><td>NC0702454</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di potassio</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Tampone salino fosfato</td> Fisher <td>BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr> <tr><td>(Poly(caprolattone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr><tr><td>(Poly(caprolattone) triolo</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>Poliacido (acido lattico-co-glicolico) diacrilato</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di potassio</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante HIV1 gp120 + gp41 proteina</td><td>Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>Sodio boroidruro</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678 10</td><td></td></tr><tr><td>Acido tetracloroaurico</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54 1</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Acros Organics</td><td>AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di una piattaforma di distribuzione di vaccini sensibile al vicino all'infrarosso e core-shell

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Le strategie di erogazione dei vaccini che possono limitare l'esposizione del carico al solvente organico, consentendo al contempo nuovi profili di rilascio, sono cruciali per migliorare la copertura delle vaccinazioni in tutto il mondo. Qui, viene introdotta una nuova piattaforma di rilascio di fumpoli iniettabile, curabile e ritardata, chiamata polibolle. Il carico è stato iniettato in polibolo a base di poliestere che si sono formati in una soluzione aques basata sul 10% di carboxymethycellulose. Questo documento include protocolli per mantenere la forma sferica dei polibololi e ottimizzare il posizionamento e la ritenzione del carico per massimizzare la quantità di carico all'interno dei polibololi. Per garantire la sicurezza, il contenuto di solventi clorurato all'interno dei polibolcchi è stato analizzato utilizzando l'analisi dell'attivazione dei neutroni. Studi di rilascio sono stati condotti con piccole molecole come carico all'interno del polibolo per confermare il rilascio di scoppio ritardato. Per mostrare ulteriormente il potenziale di consegna on-demand del carico, i nanorod d'oro sono stati mescolati all'interno del guscio polimero per consentire l'attivazione laser nel vicino infrarosso.

I polibololi sono stati ampiamente caratterizzati utilizzando SEM e NAA. Cargo è stato centrato con successo per provocare un rilascio burst ritardato. I polibololi sono stati attivati con successo anche al laser a causa della presenza di AuNR all'interno dei polibololi.
Caratterizzazione polybubble Polibololi iniettati in una soluzione aques senza CMC hanno provocato una polibolletta appiattita a causa del l...

In questo articolo vengono descritti i protocolli utilizzati per produrre una nuova piattaforma di distribuzione di vaccini, "polybubbles", per consentire il rilascio ritardato di burst. Poliesters tra cui politolico-acido co-glicolico) e policaprolactone sono stati utilizzati per formare i polibubbles e piccole molecole e antigene sono stati utilizzati come carico.

Produzione di una piattaforma di distribuzione di vaccini sensibile al vicino all'infrarosso e Core-Shell

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

Questo protocollo può aiutare a mantenere la stabilità del carico, che può essere sia piccole molecole che proteine, attraverso l'uso della polibola, che a sua volta può ridurre le interazioni di carbonio con il solvente. Questa nuova tecnica può essere utilizzata per migliorare la copertura vaccinale nei paesi in via di sviluppo in quanto le funzionalità vaccinale possono spesso essere compromesse a causa di strutture di trasporto e stoccaggio inefficienti. Per fabbricare le polibolle, utilizzare prima una pipetta di trasferimento millilitro per aggiungere 800 microlitri di 10%CMC in una fiala di vetro da 0,92 millilitro.Per sintetizzare PCLTA, mescolare 1.000 grammi per millilitro di PCL da 14 kilodalton in 200 microlitri di DCM. Per sintetizzare PLGADA, mescolare 1.000 grammi per millilitro di cinque kilodalton PLGADA in 200 microlitri di cloroformio. Mescolare il fotoiniziotore con la miscela polimerica di interesse con un rapporto da 0,005 a 1 e caricare 200 microlitri della soluzione risultante in una siringa di vetro millilitro montata su una pompa di siringa collegata a un tubo di acciaio inossidabile di erogazione con un diametro interno di 0,016 pollici.Utilizzando un micromotore per controllare il movimento avanti e indietro del tubo polimerico, iniettare il polimero nel 10%CMC nel flaconcino di vetro per formare le polibolle e curare le polibolle sotto la luce ultravioletta a una lunghezza d'onda di 254 nanometri per 60 secondi a due watt per centimetro quadrato, quindi flash congelare le polibolle in azoto liquido per 30 secondi e liofilizzare i portatori durante la notte a 0,01 millibar sotto vuoto in meno 85 gradi Celsius. Per centrare il carico di interesse all'interno di una polibubble, mescolare il carico con il 5%CMC in un rotatore durante la notte per aumentare la viscosità del carico prima di iniettare manualmente due microlitri della miscela di carico nella polibubble. Quando tutto il carico è stato iniettato, ri-curare, congelare il flash e liofilizzare la polibola iniettata come appena dimostrato.La mattina seguente, utilizzare le forcep per separare la polibola dal CMC essiccato e lavare la polibola con acqua deionizzata per rimuovere eventuali CMC residui. Quindi tagliare la polibolletta a metà e immagini le metà con microscopia confocale per assicurarti che il carico sia centrato. Per il rilascio di carichi di piccole molecole, incubare le polibolle con acriflavina centrata in 400 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius per l'appropriata lunghezza di incubazione.Ad ogni momento sperimentale, raccogliere il supernatante e aggiungere 400 microlitri di PBS fresco al flaconcino. Quindi utilizzare un lettore di piastre per quantificare l'intensità di fluorescenza del supernatante raccolto. Per l'attivazione nel vicino infrarosso, mescolare la soluzione polimerica con nano aste d'oro idrofobicizzate con un rapporto uno a nove e aggiungere l'iniziatore fotografico con un rapporto da 0,005 a 1.Iniettare la miscela risultante in una fiala di vetro da 0,92 millilitri contenente 800 microlitri del 10%CMC e curare le polibolle sotto la luce ultravioletta, come dimostrato. Dopo il congelamento del flash e la liofilizzazione come dimostrato, lavare le polibolle con acqua deionizzata e incubare i portatori in 400 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius per l'appropriato periodo di incubazione. Al termine dell'incubazione, ottenere un'immagine infrarossa lungimirante della polibolla prima e dopo aver attivato le polibolle con un laser vicino all'infrarosso da 801 nanometri a otto ampere per cinque minuti tre volte a settimana per quattro settimane per le polibolle PLGADA e 14 settimane per i polibolli PCL-PCLTA.Ad ogni momento sperimentale, raccogliere il supernatante e aggiungere 400 microlitri di PBS fresco al flaconcino. Quindi calcola le differenze di temperatura tra le polibolle prima e dopo l'attivazione laser in base ai valori di temperatura delle immagini infrarosse lungimiranti. L'aggiunta di una soluzione acquosa basata su CMC al 10% si traduce in una sospensione completa in polibolle per una manutenzione efficace della sfericità polibubble.L'iniezione di carico nel polibolle in assenza di CMC si traduce in perdite e una conseguente mancanza di ritenzione del carico all'interno della polibola. Per far fronte a questa perdita, la viscosità del PCLTA può essere aumentata utilizzando carbonato di potassio isolato dopo il polietilene di tappatura finale con triacrilato e la viscosità del carico può essere aumentata mescolando il carico con il 5%CMC. La viscosità delle polibolle PLGADA è sufficiente per facilitare la centratura del carico e non richiede modulazione tramite carbonato di potassio.Si noti che non si osserva alcuna differenza statisticamente significativa nell'efficienza di legame dell'anticorpo dopo aver miscelato l'antigene HIV gp120/41 con e senza trealosio prima dell'iniezione di polibolle. I rilasci di scoppio ritardato sono osservati nelle polibolle PLGADA con acriflavina nel mezzo il giorno 19 per polibolle incubate a 37 gradi Celsius e il quinto giorno per polibolle incubate a 50 gradi Celsius. Inoltre, le polibolle PLGADA e le polibolle PCL e PCLTA contenenti nano aste d'oro possono essere attivate con successo al laser più volte.Quando si formano le polibolle, si prega di fare attenzione a proteggere i reagenti dalla luce e anche di utilizzare immediatamente le soluzioni. Dopo aver sviluppato questa tecnologia, volevamo anche esplorare l'automazione di questo processo per arne la scala nella produzione di polibolle.

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Biologia

Questo protocollo descrive una procedura generale per lo studio ricombinante del recettore dominio di legame (RBD) a base di vaccini a subunità contro la SARS. Esso include metodi per la trasfezione ed espressione di proteine ​​nelle cellule 293T RBD, l'immunizzazione di topi con RBD e la rilevazione di attività di neutralizzazione del mouse utilizzando un siero stabilito pseudovirus SARS saggio di neutralizzazione.

Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

Questo video mostra un metodo per generare vaccini multivalenti con vescicole di membrana esterna (OMV). Le cellule di mammifero vengono trasfettate per esprimere e secernere antigeni virali fusi a uno SpyTag e a un tag di poliistidina. Questi antigeni vengono quindi purificati utilizzando una colonna di affinità per acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA). L'antigene purificato viene miscelato con vescicole della membrana esterna che esprimono la proteina SpyCatcher (SC) legata alla superficie.

Generazione di un vaccino multivalente con vescicole della membrana esterna

Questo video dimostra un metodo per la generazione di una nuova piattaforma basata su bolle polimeriche o polibolle che consente il rilascio ritardato a raffica. I polimeri a base di poliestere vengono utilizzati per formare le polibolle con struttura core-shell e piccole molecole e antigeni possono essere utilizzati come carico.

Una tecnica per generare una nuova piattaforma di somministrazione per un rilascio ritardato di molecole

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Produzione di una piattaforma di distribuzione di vaccini sensibile al vicino all'infrarosso e Core-Shell

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