Name: Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Impara l'immunochimica su intero monte per visualizzare proteine in embrioni e larve di Danio rerio. Questo protocollo consente l'osservazione tridimensionale dei pattern di espressione proteica in biologia dello sviluppo.

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Finanziamenti della sovvenzione NIH 8P20GM103436 14.

Le procedure per lavorare con gli adulti e gli embrioni di allevamento di pesci zebra descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Murray State University.
1. Raccolta e fissazione dell'embrione
<ol><li>Preparare i serbatoi di deposizione delle uova mettendo coppie di sesso misti di pesce zebra adulti o gruppi in serbatoi con una rete o fodera scanalata riempita con acqua di sistema durante la notte.</li>
	<li>All'accesa, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova per l'acqua del sistema fresco per rimuovere le feci. Utilizzare un ciclo scuro chiaro di 14 h/10 h con luci accese alle 9 del mattino.</li>
	<li>Una volta che le uova sono deposte, riportare gli adulti ai serbatoi di casa.</li>
	<li>Raccogliere le uova disegnandole con un pipet di trasferimento o versandole in un colino a rete.</li>
	<li>Trasferire le uova ai piatti Petri riempiti a metà con mezzo embrionale (come il 30% Danieau o il mezzo embrionale E2 con 0,5 mg/L di blu di metilene), limitando il numero di embrioni per piatto a 50.</li>
	<li>Rimuovere eventuali uova morte o che non si dividono. NOTA: Gli embrioni morti possono essere facilmente identificati quando diventano opachi e spesso appaiono "nuvolosi". Se il blu di metilene viene aggiunto al mezzo embrionale, gli embrioni morti assumono un aspetto blu scuro.</li>
	<li>Incubare piatti di uova a 28,5 gradi centigradi fino a raggiungere lo stadio desiderato. Per questo esperimento, sollevare gli embrioni fino a 23 hpf.</li>
	<li>Facoltativo) Trasferire gli embrioni a 24 hpf a 200 M 1-fenili 2-thiourea (PTU) nel mezzo embrionale per prevenire la melanogenesi16,17. In alternativa, gli embrioni di candeggina dopo la fissazione (vedere la sezione facoltativa 5).</li>
	<li>Cambiare mezzo embrionale o PTU medio al giorno.</li>
	<li>Dechorionate embrioni non tratteggiati utilizzando pinze ultra-fine-punta sotto uno stereomicroscopio. In alternativa, gli embrioni chimicamente dechorionati incubano in 1 mg/mL Pronase in mezzo embrionale per diversi minuti a temperatura ambiente. Rimuovere gli embrioni da Pronase e lavarsi tre volte con il mezzo embrionale.</li>
	<li>Gli embrioni Dechorioned si attaccano alla plastica. Conservarli in piatti Petri in vetro o plastica rivestiti con 1-2% di agarose disciolti in mezzo embrionale. Spostare gli embrioni dechorionati utilizzando pipet Pasteur lucidati dal fuoco per ridurre al minimo i danni.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni a tubi centrifuga 1,5 mL utilizzando un pipet di plastica o lucidato dal fuoco.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo embrionale con una micropipetta. Lasciare solo abbastanza liquido per coprire solo gli embrioni dopo ogni cambiamento di liquido.</li>
	<li>Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x salina tamponata da fosfati (PBS) in una cappa di fumi chimici. AVVISO: il PFA è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati in aree designate.</li>
	<li>Fissare gli embrioni in 4% PFA per 1-2 h con dondolo delicato a temperatura ambiente. In alternativa, fissare gli embrioni da 4 h a una notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Lavare tre volte in 1x PBS - 1% Triton-X (PBTriton) per 5 min.</li>
	<li>Utilizzare gli embrioni immediatamente o conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.</li>
	<li>Per lo stoccaggio a lungo termine, disidratare gli embrioni in metanolo 100% (MeOH) 2 h o durante la notte a -20 gradi centigradi. Conservare gli embrioni a -20 gradi centigradi in MeOH per diversi mesi. AVVISO: MeOH è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati in aree designate.</li>
</ol>2. Preparazione dell'embrione
<ol><li>Reidratare gli embrioni con incubazioni seriali a temperatura ambiente.<ol>
<li>Incubare nel 75% MeOH/25% 1x PBS per 5 min, dondolo.</li>
		<li>Incubare in 50% MeOH/50% 1x PBS per 5 min, dondolo.</li>
		<li>Incubare nel 25% MeOH/75% 1x PBS per 5 min, dondolo.</li>
		<li>Incubare in 100% PBTriton per 5 min, dondolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Facoltativo) Preparare sul ghiaccio una soluzione di lavoro fresca della proteinasi K (10 g/mL in PBTriton) aggiungendo 10 l di scorta di proteine K appena scongerate (10 mg/mL).<ol>
<li>Permeabilizzare gli embrioni digerindo fino a 30 min in Proteinase K. NOTA: la tempistica suggerita è <24 hpf: nessuna digestione; 24 hpf: digestione di 15 min; e 7 giorni: digestione di 30 min.</li>
		<li>Risciacquare gli embrioni permeabilizzati in PBTriton e ri-fissare in 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 5 min a temperatura ambiente con dondolo delicato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Incubazione anticorpale primaria
<ol><li>Selezionare una soluzione di blocco commerciale o un siero corrispondente alle specie host di anticorpi secondari (ad es. 10% siero di capra in PBTriton) con o senza 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).</li>
	<li>Bloccare gli embrioni in soluzione di blocco per 1-3 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi durante il dondolo.</li>
	<li>Incubare nell'anticorpo primario diluito in soluzione di blocco o 1% siero in PBTriton durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondola. In questo esperimento, gli anticorpi primari utilizzati erano anti-NMDAR1, recettore anti-pan-AMPA e anti-fosforo-Histone H3, ciascuno diluito ad una concentrazione finale di 1:500 nell'1% del siero di capra in PBTriton.</li>
	<li>Lavare cinque volte in PBTriton per 10 minuti a temperatura ambiente mentre dondola.</li>
</ol>4. Incubazione anticorpale secondaria
<ol><li>Selezionare un anticorpo secondario in base alla specie ospite dell'anticorpo primario e alla lunghezza d'onda desiderata.</li>
	<li>Incubare nell'anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco o 1% siero per 2 h a temperatura ambiente (o durante la notte a 4 gradi centigradi) durante il dondolo. NOTA: Gli anticorpi secondari fluorescenti sono sensibili alla luce. Abbiamo usato 1:500 capra-anti-topo Alexa488 diluito in 1% siero di capra in PBTriton.</li>
	<li>Coprire i tubi con un foglio di alluminio o coprire con una scatola di blocco della luce per questo e tutti i passaggi successivi.</li>
	<li>Lavare tre volte in PBTriton per 10 min a temperatura ambiente mentre dondola.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni a una soluzione glicerolo al 50% in PBS su un letto del 2% di agarose in mezzo embrionale e procedere alla documentazione o procedere a ulteriori fasi di lavorazione riportate di seguito.</li>
</ol>Passaggi facoltativiOptional Steps
5. Sbiancamento
<ol><li>Preparare la soluzione di candeggina in un tubo da 1,5 mL aggiungendo 810,7 gradi di ddH2O, 89,3 l l di 2 M KOH e 100 L del 30% H2O2.</li>
	<li>Invertire il tubo tre volte per mescolare.</li>
	<li>Pipetta 1 mL di direzione della soluzione di candeggina verso gli embrioni.</li>
	<li>Aprire il tappo del tubo dell'embrione per consentire alla fuoriuscita di gas. Toccare delicatamente il tubo sulla panca per spostare le bolle.</li>
	<li>Monitorare il processo di sbiancamento (utilizzare un microscopio se necessario) e interrompere la reazione quando il pigmento viene sufficientemente rimosso (circa 5 min per 24 hpf o 10 min per 72 hpf).</li>
	<li>Rimuovere con cautela la soluzione di sbiancamento con una micropipetta e risciacquare gli embrioni tre volte in 1 mL di PBTriton. NOTA: gli embrioni sono appiccicosi in questo passaggio.</li>
	<li>Procedere alla documentazione o a ulteriori procedure di elaborazione riportate di seguito.</li>
</ol>6. Dissezione dell'embrione e Deyolking
<ol><li>Per rimuovere il tuorlo, trasferire una piccola quantità (200 dollari l o abbastanza per coprire completamente l'embrione ma abbastanza restrittivo da limitare dove può galleggiare) di 1x PBS a uno scivolo di depressione o un vetro semplice.</li>
	<li>Utilizzare un tubo di trasferimento di plastica per spostare 1 o più embrioni nella goccia PBS.</li>
	<li>Utilizzare pinze ultra-sottili e 00 perni di insetti per rompere il tuorlo e molto delicatamente raschiare i granuli del tuorlo dalla superficie ventrale dell'embrione (vedi anche Cheng et al., 2014)18.</li>
	<li>Rimuovere i granuli del tuorlo e rifornire PBS in base alle esigenze.</li>
	<li>Ripetere fino a quando l'embrione è sufficientemente privo di tuorlo.</li>
</ol>7. Montaggio piatto su vetrini
<ol><li>Trasferire gli embrioni deyolked in uno scivolo di vetro caricato con una pipetta di plastica o una micropipetta da 1 mL con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio). Orientarsi come desiderato con una punta di micropipetta o un perno per insetti da 200 luna.</li>
	<li>Wick via pbS in eccesso con una salvietta Kim o un asciugamano di carta.</li>
	<li>Aggiungere 2-3 gocce di supporto di montaggio alla diapositiva e coverslip.</li>
	<li>Asciugare all'aria per circa 5-10 min.</li>
	<li>Sigillare il vetro di copertura sul vetrino con uno smalto trasparente. NOTA: I bordi del vetro di copertura devono essere completamente coperti con uno strato sottile e continuo di smalto.</li>
	<li>Lasciare asciugare circa 10 min prima dell'imaging.</li>
</ol>8. Montaggio ad Agarose
<ol><li>Preparare l'1% di agarose nel mezzo embrionale aggiungendo 0,5 g di agarose a 50 mL di mezzo embrionale in un pallone a microonde o in un becher di volume almeno 3 volte superiore a quello desiderato.</li>
	<li>Riscaldare in un forno a microonde, vorticoso ogni 30 s, fino a agarose è completamente dissolto.</li>
	<li>Crea 1 mL di aliquote in tubi di centrifuga da 1,5 ml. Conservare le aliquote a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coprire i tappi della metropolitana con serrature prima del riscaldamento.</li>
	<li>Mettere i tubi di agarose in un supporto di tubo galleggiante in un becher mezzo pieno d'acqua.</li>
	<li>Microonde il becher con tubi galleggianti per 2-3 min, o fino a quando agarose è completamente sciolto.</li>
	<li>Trasferire un embrione allo scivolo colmato con una pipetta di plastica o una micropipetta 200 con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio).</li>
	<li>Posizionare l'embrione su un coperchio rettangolare utilizzando perni di insetto e aggiungere circa 20 anni di agarose fuso direttamente all'embrione.</li>
	<li>Orientare rapidamente la regione di interesse più vicina alla coverslip usando 00 perni di insetti. NOTA: Si tratta di un supporto capovolto.</li>
	<li>Riportare il tubo di agarose al tubo dell'acqua calda galleggiante tra ogni uso e microonde in base alle esigenze.</li>
	<li>Immagine con un microscopio quando l'agarose si indurisce. Tenere l'embrione montato capovolto per l'uso al microscopio invertito. Capovolgere il coperchio sopra (in modo che l'agarose è sotto il coperchio) per l'uso su microscopi eretti.</li>
</ol>9. Montaggio su scivoli a ponte
<ol><li>Per fare scivoli con bridge, incollare i copricapi quadrati alla diapositiva di vetro utilizzando un piccolo punto di supercolla. NOTA: Dovrebbe esserci un trogolo largo almeno 5 mm tra i copricopertine. Due #1 copriletti alti è in genere appropriato per gli embrioni da 24-48 hpf, mentre tre copricapi alti possono essere necessari per 72 hpf.</li>
	<li>Trasferire 1-2 embrioni deyolked al vetrino colmato con una pipetta di plastica o una micropipetta da 200 l con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio).</li>
	<li>Wick via il liquido in eccesso con una salvietta Kim o un asciugamano di carta.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di glicerolo dell'80% direttamente all'embrione.</li>
	<li>Coprire con un vetro di copertura rettangolare. La goccia di glicerolo dovrebbe toccare il vetro di copertura.</li>
	<li>Aggiungere più glicerolo allo spazio tra il vetro di copertura e lo scivolo necessario per coprire completamente l'embrione con un margine di glicerolo sui lati dell'embrione.</li>
	<li>Far scorrere delicatamente il vetro di copertura rettangolare per arrotolare l'embrione in posizione per l'imaging.</li>
</ol>10. Colorazione DAB
NOTA: questa sezione inizia dopo il passaggio 4.2 precedente e sostituisce il resto del passaggio 4.
<ol><li>Incubare gli embrioni in una soluzione di blocco con un anticorpo secondario coniugato perossidico per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi durante il dondolo.</li>
	<li>Lavare tre volte in PBTriton per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni su una piastra di coltura o uno scivolo di depressione con una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Mescolare 50 - L dell'1% DAB (3,3'-diaminobenzidine) sciolto in ddH2O e 50 - L di 0,3% di perossido di idrogeno e portare a 1 mL con PBS. AVVISO: DAB è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati DAB in aree designate.</li>
	<li>Coprire gli embrioni macchiati HRP con la soluzione DAB preparata sopra e monitorare lo sviluppo del colore (in genere 1-5 min) al microscopio.</li>
	<li>Dopo aver raggiunto il livello desiderato di sviluppo del colore, risciacquare brevemente gli embrioni in PBS.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in un tubo da 1,5 mL prima della fissazione.</li>
	<li>Rifissare gli embrioni per 15-20 min in 4% PFA a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 5 min.</li>
	<li>Procedere alla documentazione.</li>
</ol>11. Protocollo modificato per la colorazione del tessuto sezionato montato su diapositive
<ol><li>Accerchia il tessuto per essere macchiato con una pap pen.</li>
	<li>Trasferire le diapositive in una camera umida.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS direttamente alla diapositiva.</li>
	<li>Incubare 7 min a temperatura ambiente per rimuovere il mezzo di incorporamento.</li>
	<li>Versare il PBS invertendo la diapositiva.</li>
	<li>Reidratare 1 min fino a 1 mL di tampone TNT (100 mM MM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).</li>
	<li>Bloccare fino a 1 mL di soluzione di blocco (commerciale o 10% siero - 2% BSA) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare durante la notte in anticorpi primari diluiti nel siero dell'1% o soluzione di blocco a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Lavare cinque volte fino a 1 mL di tampone TNT a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare nell'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente o peruna notte a 4 gradi centigradi. Coprire la camera con un foglio o utilizzare un coperchio scuro.</li>
	<li>Lavare cinque volte in TNT a temperatura ambiente. Versare l'ultimo lavaggio.</li>
	<li>Montare con 2-3 gocce di supporto di montaggio e coverslip. Lasciate inserire 5-10 min.</li>
	<li>Sigillare il vetro di copertura sulla diapositiva con smalto trasparente. Lasciare asciugare completamente prima dell'imaging.</li>
</ol>12. Documentazione
<ol><li>Registrare la procedura completa e le eventuali deviazioni in un notebook di laboratorio.</li>
	<li>Registrare la concentrazione, il nome, il numero di catalogo, il produttore e il numero di lotto dell'anticorpo primario.</li>
	<li>Posizionare il campione montato in modo appropriato sullo stadio del microscopio. Individuare la regione di interesse.</li>
	<li>Selezionare un esempio relativamente luminoso. Impostare l'esposizione e il guadagno della fotocamera in modo che il segnale sia sufficientemente luminoso senza saturare.</li>
	<li>Confrontare l'intensità di colorazione della stessa regione di interesse utilizzando le stesse impostazioni di esposizione quando si confrontano tra embrioni sperimentali con etichetta anticorpale e embrioni di anticorpi di controllo (ex. IgG).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno informazioni da divulgare.

L'immunohistochimica è uno strumento versatile che può essere utilizzato per caratterizzare l'espressione spatio-temporale di praticamente qualsiasi proteina di interesse in un organismo. L'immunohistochimica è utilizzata su un'ampia varietà di tessuti e organismi modello. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso nel pesce zebra. L'immunostochimica in specie diverse può richiedere diverse tecniche di fissazione e manipolazione, soluzioni di blocco a seconda delle specie e la presenza di perossie endogene e tempi d...

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente modello per lo studio dei processi biologici per diversi motivi, tra cui tempi di breve generazione, rapido sviluppo e amenabilità alle tecniche genetiche. Di conseguenza, i pesci zebra sono comunemente utilizzati in schermi ad alta produttività di piccole molecole per la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci. Il pesce zebra è anche un modello interessante per lo studio dei processi di sviluppo, dato che una singola femmina può produrre regolarmente 50-300 uova alla volta e gli embrioni otticamente chiari si sviluppano esternamente consentendo una visualizzazione efficiente dei processi di sviluppo. Tuttavia, le prime ricerche si basavano principalmente su schermi genetici in avanti utilizzando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) o altri mutageni a causa di sfide nello stabilire tecniche genetiche inverse. Circa due decenni fa, i morfolino sono stati utilizzati per la prima volta nei pesci zebra per abbattere i geni mirati1. I morfolino sono piccoli oligonucleotidi antisensi che inibiscono la traduzione dell'mRNA bersaglio dopo la microiniezione in un embrione in una fase di sviluppo precoce. Una delle principali debolezze dei morfemole è che vengono diluite poiché le cellule si dividono e generalmente perdono efficacia di 72 ore dopo la fecondazione (hpf). Mentre i morfolino rimangono un potente strumento per la perturbazione del gene dei pesci zebra, le nucleasi effettore (TALEN) di trascrizione attivatori, le nucleasi zinco-dita (FN) e le ripetizioni palindromiche brevi (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR) vengono utilizzate più recentemente per colpire direttamente il genoma del pesce zebra2,3. Queste strategie genetiche inverse, in combinazione con la genetica avanzata e gli schermi ad alta velocità, hanno stabilito il pesce zebra come un potente modello per studiare l'espressione e la funzione genica.
La capacità di studiare la funzione genica richiede generalmente una valutazione della distribuzione spatio-temporale dell'espressione genica o del prodotto genico. Le due tecniche più comunemente utilizzate per visualizzare tali modelli di espressione durante lo sviluppo precoce sono l'ibridazione in situ (ISH) e l'immunohistochimica a monte intero (IHC). L'ibridazione in situ è stata sviluppata per la prima volta nel 1969 e si basa sull'uso di sonde di RNA antisenso etichettate per rilevare l'espressione di mRNA in un organismo4. Al contrario, gli anticorpi etichettati sono utilizzati nell'immunoistochimica per visualizzare l'espressione proteica. L'idea di etichettare le proteine per il rilevamento risale ai5 del 1930 e il primo esperimento IHC è stato pubblicato nel 1941 quando gli anticorpi etichettati FITC sono stati utilizzati per rilevare batteri patogeni nei tessuti infetti6. ISH e IHC si sono evoluti e migliorati in modo significativo nel corso dei decenni successivi e sono ora entrambi regolarmente utilizzati nel laboratorio di ricerca molecolare e diagnostica7,8,9,10,11. Sebbene entrambe le tecniche abbiano vantaggi e svantaggi, IHC offre diversi vantaggi rispetto a ISH. In pratica, IHC è molto meno dispendioso in termini di tempo di ISH ed è generalmente meno costoso a seconda del costo dell'anticorpo primario. Inoltre, l'espressione dell'mRNA non è sempre una metrica affidabile dell'espressione proteica, come è stato dimostrato nei topi e negli esseri umani, che solo circa un terzo della variazione dell'abbondanza proteica può essere spiegata dall'abbondanza di mRNA12. Per questo motivo, IHC è un importante integratore per confermare i dati ISH, quando possibile. Infine, IHC può fornire dati subcellulari e di co-localizzazione che non possono essere determinati da ISH13,14,15. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per rilevare in modo affidabile le proteine mediante immunostachimica in embrioni e larve di pesci zebra di montaggio intero. L'obiettivo di questa tecnica è determinare l'espressione spaziale e temporale di una proteina di interesse per l'intero embrione. Questa tecnologia utilizza anticorpi primari specifici dell'antigene e anticorpi secondari fluorescenti. Il protocollo è facilmente adattabile all'uso su sezioni di tessuto montate su slittamenti e per l'uso con substrati cromogenici al posto della fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo che lo sviluppo del muscolo scheletrico del pesce zebra esprime i recettori del glutammato ionotropico, oltre ai recettori dell'acetilcolina. Le sottounità del recettore del glutammato di tipo NMDA sono rilevabili sul muscolo longitudinale a 23 hpf.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio, resistente</td><td>Kirkland</td><td></td><td>Qualsiasi marca può essere sostituita Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-NMDA</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-istone H3 (Ser10), clone RR002</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPA recettore (GluR1-4)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>MABN832</tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di calcio [Ca(NO3)2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Smalto trasparente</td><td>Sally Hanson</td><td></td><td>Qualsiasi smalto o indurente può essere sostituito</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Diaminobenzidina <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Terreno embrionale, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES in acqua ultrapura.</td></tr><tr><td>Terreno embrionale, E2</td><td></td><td></td><td>7,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 &mu; M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0,5 mM CaCl2, 0,35 mM NaHCO3, 0,5 mg/L blu di metilene</td></tr><tr><td>Supporto per provetta galleggiante</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio composto a fluorescenza</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Leica Biosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 18 mm x 18 mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>IgG antitopo capra Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Camera umida con coperchio</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno, 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Immunedge pap pen</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Spille per insetti, misura 00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a rete</td><td>Oneida</td><td></td><td>Qualsiasi marca può essere sostituita</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Blocco del tappo della microprovetta</td><td>Research Products International</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Toastmaster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Millipore Sigma</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore nutante</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (vetro)</td><td>Pyrex</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (plastica)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-fenil 2-tiourea</td><td>Acros Organics</td><td>207250250</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x</td><td></td><td></td><td>1x a partire da 10x stock diluito in dH2O</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Vasca di deposizione delle uova con coperchio e inserto</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + vetrini</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM di NaCl; 0,1% Tween20; made in dH2O</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico (Cl3CCOOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinza ultrafine</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>Acqua, ultrapura/doppia distillazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

intero monte immunohistochimica in embrioni e larve di pesce zebra

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

L'immunohistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per esplorare l'espressione e la localizzazione delle proteine sia durante i normali stati di sviluppo che di malattia. Sebbene molti protocolli di immunohistochimica siano stati ottimizzati per le sezioni dei tessuti e dei tessuti dei mammiferi, questi protocolli spesso richiedono modifiche e ottimizzazione per gli organismi modello non mammiferi. I pesci zebra sono sempre più utilizzati come sistema modello nella ricerca di base, biomedica e traslazionale per studiare i meccanismi biologici molecolari, genetici e cellulari dei processi di sviluppo. Il pesce zebra offre molti vantaggi come sistema modello, ma richiede anche tecniche modificate per un rilevamento ottimale delle proteine. Qui, forniamo il nostro protocollo per l'immunohistochimica a fluorescenza integrale in embrioni di pesce zebra e larve. Questo protocollo descrive inoltre diverse strategie di montaggio che possono essere impiegate e una panoramica dei vantaggi e degli svantaggi offerti da ciascuna strategia. Descriviamo anche modifiche a questo protocollo per consentire il rilevamento di substrati cromogenici nell'intero tessuto di montaggio e il rilevamento della fluorescenza nel tessuto larvale sezionato. Questo protocollo è ampiamente applicabile allo studio di molte fasi di sviluppo e strutture embrionali.

L'immunohistochimica integrale utilizza anticorpi per rilevare il modello spaziale dell'espressione proteica nell'animale intatto. Il flusso di lavoro di base dell'immunoistochimica (illustrata nella figura 1) prevede l'allevamento del pesce zebra, l'allevamento e la preparazione di embrioni, il blocco di antigeni non specifici, l'utilizzo di un antigene primario specifico dell'antigene per colpire la proteina di interesse, il rilevamento di tale anticorpo pr...

Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

L'immunoistochimica a montaggio intero è una tecnica relativamente rapida e semplice che consente l'osservazione spaziale e temporale delle proteine direttamente in un tessuto o organismo utilizzando anticorpi etichettati. L'utilità di questa tecnica è che consente la colorazione di un tessuto intatto o di un organismo senza doverlo prima sezionamento e la microscopia confocale può essere utilizzata per generare una rappresentazione tridimensionale del modello di espressione proteica. L'immunoistochimica è ampiamente utilizzata nella ricerca biomedica per comprendere l'eziologia e i meccanismi molecolari che sono alla base della malattia.È anche un prezioso strumento diagnostico per identificare i tumori nei campioni patologici. Per iniziare, preparare i serbatoi di deposizione delle uova riempiti con acqua di sistema e con una rete o una fodera fessurata in posizione. Posizionare coppie di sesso misto zebrafish adulti in gruppi nei serbatoi durante la notte.Usa un ciclo chiaro/scuro di 14 ore e 10 ore con luci che si accese alle 9 del .m. La mattina seguente, con le luci accese, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova con acqua fresca del sistema per rimuovere le feci. Una volta deposte le uova, riportare gli adulti ai serbatoi di casa.Raccogliere le uova disegnandole utilizzando una pipetta di trasferimento. Trasferire 50 uova in ogni piastra di Petri riempita a metà strada con mezzo embrionale. Rimuovere eventuali uova opache e torbate che sono morte o non sono riuscite a dividersi.Incubare il piatto di uova a 28,5 gradi Celsius fino a 23 ore dopo la fecondazione. Se gli embrioni sono più vecchi di 24 ore dopo la fecondazione, con una pipetta trasferire gli embrioni a 200 PTU micromolare nel mezzo embrionale per prevenire la melanogenesi. Al microscopio stereo, dechorionare gli embrioni non odiati usando forcep a punta ultra fine.Utilizzando pipette Pasteur lucidate dal fuoco per ridurre al minimo i danni, trasferirle in piastre petri in vetro o plastica rivestite con 1-2% di agarosio sciolto in mezzo embrionale. Quindi trasferire gli embrioni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta in plastica o lucidata a fuoco. Rimuovere il mezzo embrionale con una micropipetta.Lasciare solo abbastanza liquido per coprire solo gli embrioni. Fissare gli embrioni in PFA al 4% per una o due ore con un dolce dondolo a temperatura ambiente. Quindi, lavare gli embrioni tre volte in 1X PBS e 1%PBTriton per cinque minuti.Utilizzare immediatamente gli embrioni o conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per la conservazione a lungo termine, disidratare e conservare gli embrioni in metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Per reidratare gli embrioni, eseguire incubazioni seriali cinque minuti ciascuna a temperatura ambiente con quantità decrescenti di metanolo e PBS e PBTriton per il lavaggio finale.Procedere con la preparazione dell'embrione secondo il manoscritto. Selezionare una soluzione di blocco corrispondente alla specie ospite dell'anticorpo secondario, ad esempio siero di capra al 10% in PBTriton con o senza due milligrammi per millilitro di BSA. Aggiungere 0,5 millilitri della soluzione di blocco nel tubo contenente l'embrione e posizionare il tubo su un rocker per una o tre ore a temperatura ambiente.Quindi incubare l'embrione in anticorpi primari diluiti in soluzione di blocco e PBTriton durante la notte a quattro gradi Celsius durante il dondolo. Al mattino, lavare l'embrione cinque volte in PBTriton per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente durante il dondolo. Quindi selezionare un anticorpo secondario in base alla specie ospite dell'anticorpo primario e alla lunghezza d'onda desiderata a 488 nanometri.Aggiungere l'anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco nel tubo contenente l'embrione. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare per due ore a temperatura ambiente durante il dondolo. Successivamente, lavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente mentre sono coperti con foglio di alluminio e dondolo.Con una pipetta, trasferire gli embrioni in una soluzione di glicerolo al 50% in PBS su un letto di 2%agarosio in mezzo embrionale. Per rimuovere il tuorlo, trasferire 200 microlitri di 1X PBS in uno scivolo di depressione o in un semplice scivolo di vetro. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per spostare uno o più embrioni nella goccioline PBS.Utilizzare pin ultra fini e perni di insetti doppi zero per rompere il tuorlo e raschiare molto delicatamente i granuli di tuorlo dalla superficie ventrale dell'embrione. Rimuovere i granuli di tuorlo e reintegrare con PBS in base alle esigenze. Dopo il montaggio, posizionare il campione sullo stadio del microscopio.Individuare l'area di interesse selezionando un esempio relativamente luminoso. Regolare l'esposizione e il guadagno della telecamera in modo che il segnale sia sufficientemente luminoso senza saturarsi. Quando si confrontano tra gli embrioni sperimentali etichettati con anticorpi e gli embrioni anticorpali di controllo, utilizzare le stesse impostazioni di esposizione.Questo protocollo di immunoistochimica a montaggio intero è uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione spaziale e temporale delle proteine utilizzando lo sviluppo del pesce zebra. La subunità GluN1 del recettore del glutammato di tipo NMDA ha rivelato l'espressione delle subunità del recettore del glutammato durante lo sviluppo dei muscoli zebrafish a 23 ore dopo la fecondazione. Sezioni congelate di embrioni post fecondazione di 72 ore sono state montate su scivoli e immunostained per fosfo-H3, un marcatore di cellule proliferato.Diverse cellule espresse fosfo-H3 e l'espressione era più notevole nelle zone ventricolari. L'anticorpo di controllo IgG del topo e l'esclusione degli anticorpi primari hanno rivelato un basso livello di espressione non specifica. È importante selezionare soluzioni di blocco appropriate e anticorpi secondari in base alle specie ospiti degli anticorpi primari per garantire il rilevamento e ridurre al minimo la colorazione non specifica.L'immunoistochimica deve essere verificata per garantire che il segnale osservato sia effettivamente la proteina di interesse. Gli esperimenti di follow-up di solito comportano l'uso di organismi geneticamente o modificati per l'ambiente. L'immunoistochimica garantisce ai ricercatori la possibilità di osservare le proteine in situ, accelerando notevolmente la nostra comprensione di numerosi sistemi sia nella biologia di base che applicata, in particolare durante lo sviluppo degli embrioni.Il metanolo e la formaldeide sono tossici e devono essere maneggiati con attenzione. I rifiuti devono essere raccolti e smaltiti secondo procedure istituzionali.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere...

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

Processi di sviluppo quali la proliferazione, il modello, la differenziazione, e la guida degli assoni possono essere facilmente modellati nel midollo spinale zebrafish. In questo articolo, si descrive una procedura di montaggio per gli embrioni di zebrafish, che ottimizza la visualizzazione di questi eventi.

Dissezione e laterale Montaggio di embrioni di zebrafish: analisi dello sviluppo del midollo spinale

L'embrione zebrafish è un ottimo modello per la ricerca biologia dello sviluppo. Durante l'embriogenesi, zebrafish sviluppare con una massa tuorlo, che presenta sfide tridimensionali per l'osservazione e l'analisi del campione. Questo protocollo descrive come creare bidimensionali montaggio preparazioni semplici di tutto il monte in situ (WISH) colorati esemplari embrioni di zebrafish.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine.

Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.

Immunofluorescenza sequenziale e immunosofochimica su embrioni di pesce zebra criosezione

Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l'imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

Presentato qui è un protocollo per l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La procedura sperimentale include la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione.

In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale

Impara l'immunochimica su intero monte per visualizzare proteine in embrioni e larve di Danio rerio. Questo protocollo consente l'osservazione tridimensionale dei pattern di espressione proteica in biologia dello sviluppo.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

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