Name: Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dellammasso cinese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri come ottimizzare i processi biotecnologici con microreattori automatizzati e Design of Experiments. Questo metodo consente di eseguire esperimenti in parallelo per analizzare proteine con colonne Protein A.

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Gli autori desiderano ringraziare il Bundesministerium f'r Bildung und Forschung (BMBF), il Ministero federale dell'istruzione e della ricerca, in Germania, e il team di BioProcessing di Sartorius Stedim Biotech GmbH, Germania, per il loro sostegno.

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<li>Schäpper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+microbioreactors+in+fermentation+process+development%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of microbioreactors in fermentation process development: a review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbioreactors+for+Bioprocess+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Microbioreactors for Bioprocess Development.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).</li>
<li>Claßen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+sensors+for+in-line+bioprocess+monitoring+in+research+and+pharmaceutical+industrial+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).</li>
<li>Janoschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+to+transfer+a+fed-batch+platform+process+into+semi-perfusion+mode%3A+The+benefit+of+automated+small-scale+bioreactors+compared+to+shake+flasks+as+scale-down+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model.</a> Biotechnology Progress. 35 (2), 2757(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'ottimizzazione del processo per aumentare la resa è di fondamentale importanza nell'industria biofarmaceutica. I flaconi di agitazione potrebbero essere potenzialmente utilizzati per lo screening del ceppo; tuttavia, il monitoraggio dei parametri di processo come pH e DO non sono disponibili nei flaconi. I microreattori hanno un vantaggio in quanto consentono un monitoraggio e un controllo continui del processo. Questi cicli di controllo nel microreattore forniscono anche una condizione simile a quelli su larga scala e...

Il mercato biofarmaceutico globale ha varato più di 250 miliardi di dollari nel 2018 ed è in continua espansione1. Le aziende farmaceutiche si stanno allontanando dalla produzione di piccoli farmaci molecolari a terapie biotecnologicamente prodotte come le proteine ricombinanti. Questi da soli sono responsabili di un fatturato di oltre 150 miliardi di dollari1. Le cellule dei mammiferi sono ora ampiamente utilizzate per la produzione di queste proteine ricombinanti farmaceutiche. Nel periodo attuale, tra i 68 prodotti approvati prodotti dalle cellule dei mammiferi, 57 sono prodotti dalle cellule ovariche di Hamster cinesi (CHO)2. Le cellule CHO sono specificamente utilizzate per la produzione di proteine ricombinanti che richiedono modifiche post-traduzionali. Queste cellule sono preferite in quanto crescono in una sospensione e quindi consentono risultati riproducibili in unsierolibero chimicamente 3,4. L'altro vantaggio dell'utilizzo di cellule CHO è che la struttura glicana del prodotto assomiglia a quella dell'anticorpo monoclonale umano (mAb) e si traduce in una maggiore resa di proteine ricombinanti e produttività specifica a causa dell'amplificazione della genetion5.
La resa della coltura cellulare ricombinante CHO (rCHO) è aumentata di cento volte negli ultimi due decenni. Questo miglioramento è attribuito all'ottimizzazione dei parametri di processo, alla strategia di alimentazione e allo sviluppo di un mezzo chimico definito chimicamente privo di siero6. Con l'aumento del fabbisogno dei prodotti farmaceutici, la pressione aumenta sull'efficienza dei costi e dei tempi per lo sviluppo del processo di produzione7. Per ridurre la pressione assicurando la qualità del prodotto ha reindirizzato l'attenzione dell'industria farmaceutica sulla qualità di progettazione (QbD). QbD viene utilizzato per comprendere la produzione del prodotto e il processo. Uno strumento vitale utilizzato nell'ObD è il Design of Experiment (DOE). Aiuta ad aumentare la comprensione del processo rivelando la relazione tra varie variabili di input e i dati di output risultanti. L'applicazione dell'approccio DOE per ottimizzare il bioprocesso è vantaggiosa durante le prime fasi del progetto nell'assimilare le condizioni di processo e nell'aumento della quantità e della qualità del titolo. Questo approccio è utile rispetto alla strategia antiquata: OFAT (one-factor-at-a-time). Gli approcci statistici al DOE utilizzando Classico, Shainin o Taguchi sono di gran lunga superiori all'OFAT8.
Il processo e l'ottimizzazione dei supporti possono essere eseguiti in flaconi shake. I flaconi sono relativamente poco costosi. Tuttavia, non è possibile controllare parametri quali temperatura, pH e ossigeno disciolto (DO). Per superare questi inconvenienti, possono essere utilizzati bioreattori multiuso che vanno dal volume di lavoro da 0,5 L a 5 L. I reattori forniscono un ampio monitoraggio on-line e controllo dei processi. Tuttavia, l'uso del bioreattore multiuso è un tempo e un lavoro intensivo. Per superare questi svantaggi, viene utilizzato un nuovo bioreattore monouso che combina il processo completo di monitoraggio del bioreattore bench-top e di facile gestione del pallone di agitazione. Il sistema di screening ad alta produttività e la tecnologia monouso hanno contribuito a migliorare l'efficienza delle prestazioni di processo e dello sviluppo9.
In questo articolo sono elencate le linee guida per caricare la ricetta nel software automatizzato di microbioreattore (AMBR). Nel corso di questo esperimento viene studiata l'influenza delle diverse velocità e del pH sulla concentrazione cellulare vitale (VCC) e sul timore. Il risultato sperimentale e l'analisi vengono effettuati con la progettazione di software sperimentale MODDE 12. L'analisi dei prodotti viene effettuata in un sistema di cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) con una colonna Protein A. Si basa sul principio che la regione Fc del mAb si lega alla proteina A con alta affinità10,11. Con questo metodo, è possibile identificare e quantificare il mAb. La quantificazione viene effettuata sulle aree di picco di eluizione misurata a 280 nm.

<table><tbody><tr><td>Puntali per pipette monouso da 1 mL, sterilizzati</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>A-0040</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutammina</td><td>Corning, Merck</td><td>25-005-CV</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti profondi a 24 pozzetti</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>A-0038</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette monouso da 5 mL, sterilizzati</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>A-0039</td><td></td></tr><tr><td>ambr 15 automatizzato sistema di microbioreattore</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>001-2804</td><td></td></tr><tr><td>ambr 15 Coltura cellulare 24 Bioreattori monouso - Sparged</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>001-1B86</td><td></td></tr><tr><td>Emulsione antischiuma C</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>A8011</td><td></td></tr><tr><td>Tappo del flacone Filtro sterile</td><td>Corning, Merck</td><td>CLS431474</td><td>0,1 &mu; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>CEDEX Detergente (3% Mucosol)</td><td>Roche Innovatis AG</td><td>05-650-658-001</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule</td><td>Roche Innovatis AG</td><td>05-650-216-001</td><td>CEDEX HiRes</td></tr><tr><td>CHO DG44 linea cellulare</td><td>Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHOKO Feed Media A (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>CR80025</td><td></td></tr><tr><td>CHOKO Feed Media B (FMB)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>CR80026</td><td></td></tr><tr><td>CHOKO Terreno di produzione</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>CR80027</td><td></td></tr><tr><td>CHOKO Coltura stock Meium</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>CR80028</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di cromatografia liquida ad alta pressione</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga conica</td><td>Corning, Merck</td><td>SIAL0790</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td></td><td></td>1070179026</tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Fiale HPLC</td><td>VWR International</td><td>SUPLSU860181</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A Colonna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1502226</td><td>POROS&trade; A 1,7&nbsp; mL</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich,Merck</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico anidro</td><td>Sigma-Aldrich,Merck</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR International</td><td>VWRVK940</td><td></td></tr><tr><td>YSI</td><td>YSI Inc</td><td>2900D</td><td>YSI 2900 Seleziona</td></tr></tbody></table>

ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

L'ottimizzazione dei bioprocessi per aumentare la resa dei prodotti desiderati è importante nell'industria biofarmaceutica. Ciò può essere ottenuto mediante la selezione della deformazione e lo sviluppo di parametri di bioprocesso. A questo scopo sono stati utilizzati flaconi Shake. Essi, tuttavia, non sono in grado di controllare i parametri di processo come il pH e l'ossigeno disciolto (DO). Questa limitazione può essere superata con l'aiuto di un microbioreattore automatico. Questi bioreattori imitano la coltivazione su scala più ampia. Uno dei principali vantaggi di questo sistema è l'integrazione del Design of Experiment (DOE) nel software. Questa integrazione consente di stabilire un progetto in cui più parametri di processo possono essere variati contemporaneamente. I parametri di processo critici e le condizioni ottimali del bioprocesso possono essere analizzati all'interno del software. L'obiettivo del lavoro qui presentato è quello di introdurre l'utente alle fasi coinvolte nella progettazione del processo nel software e nell'incorporazione del DOE all'interno della corsa di coltivazione.

Una panoramica della coltivazione effettuata in questo studio è presentata nella Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60577/60577fig02.jpg"> Figura 2: Rappresentazione schematica delle condizioni sperimentali per testare i profili di pH e di velocità dell'agitazione nelle stazioni di coltura. La figura rappresenta anche il layout corretto per posizionare i vasi. <a href="https://w...

Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

In questo video, gli utenti hanno introdotto nel software micro bioreattore con la pianificazione e l'esecuzione della progettazione di esperimenti o DOE. Gli analizzatori valvole ausiliarie sono anche dimostrati per ottimizzare le condizioni di processo. L'incorporazione di modet nel software automatizzato di micro bioreattore è stata ufficiale per l'analisi dei dati.Un gran numero di esperimenti può essere pianificato ed eseguito simultaneamente su piccola scala. A dimostrare la procedura sarà Tamanna Nagraik, dottoranda del mio laboratorio. Inizia con la procedura di pre-coltura nella coltivazione principale come descritto nel protocollo di testo.Per creare un nuovo esperimento, aprire il software di autocoltura Amber e nella scheda introduzione fare clic su crea nuovo esperimento. Nella nuova scheda esperimento immettere il nome dell'esperimento insieme alla data in cui verrà condotto. Attivare il checkpoint per la stazione di coltura nelle navi da utilizzare durante la coltivazione.I tag DOE ad aggiunta automatica verranno attivati anche per una facile transizione durante la programmazione dell'esperimento DOE. Clicca su avanti"per passare alla scheda successiva. Per impostare informazioni sull'aggiunta di supporti nella nave, insieme a antischiuma, inoculo, mangime e glucosio, attivare il checkpoint della piastra del supporto di aggiunta.Definire il tipo di piastra, il nome e la posizione della piastra contenente il supporto. Clicca su aggiungi supporto alle navi. Immettere il volume del supporto da aggiungere alle navi.Definire la mappatura del trasferimento dei supporti dalla piastra ai recipienti. Clicca su avanti"per passare alla scheda successiva. Dopo che le informazioni multimediali sono state inserite nel software, assegnare le condizioni di coltivazione.Fare clic sui supporti di condizione e riempire la temperatura, il DO di destinazione, il limite ph superiore e l'agitazione rpm. Quindi fare clic su Su mescolando"o verso il basso mescolando. Per impostare l'aggiunta di inoculi nei vasi, attivare aggiungere la piastra cellulare.Definire il tipo di piastra, il nome e la posizione della piastra contenente il supporto. Fare clic su aggiungi celle ai vasi. Immettere l'ora di inoculazione e il volume dei supporti da aggiungere ai recipienti.Definire il percorso percorso dal gestore del liquido per trasferire la cella dalla piastra ai vasi. Clicca su avanti"per passare alla scheda successiva. Per impostare l'aggiunta di mangime, glucosio e anti-schiuma, attivare la piastra di alimentazione di aggiunta e definire il tipo, il nome e la posizione della piastra.Fare clic su aggiungi mangime ai vasi e inserisci il volume del mangime da aggiungere alle navi. A seconda della coltivazione, aggiungere il numero di aggiunta di mangime. Per questa coltivazione, il reattore viene alimentato dopo 72 ore ogni 24 ore.Aggiungere manualmente il ritardo di tempo tra l'alimentazione inserendo i dati in ritardo dalle celle aggiunte. Il primo giorno di alimentazione è dopo 72 ore di inoculazione, il prossimo è dopo 96 ore e così via. Definire la mappatura del trasferimento del mangime dalla piastra ai vasi.Per impostare il campionamento durante la coltivazione, attivare la piastra di campionamento add" e definire il tipo, il nome e l'ubicazione della lastra. Controllare il campione dalle navi" e inserire il volume del campione da rimuovere dalle navi. Assicurarsi che il volume non diminuisca al di sotto di 10 mililitri durante l'intero corso di coltivazione.Aggiungere il numero di campioni da prelevare durante la coltivazione. Analogamente all'alimentazione, aggiungere il tempo di rimozione del campione dal recipiente per ogni punto campione di ingresso. Salvare il processo.Ora è pronto per l'esecuzione. Infine, definire la mappatura del trasferimento del campione dalle navi alla piastra. Aprire il software Amber 15 DOE.Clicca su indagine"e seleziona nuovo. Immettere il nome della nuova indagine DOE nella finestra di dialogo crea indagine. Per assegnare un esperimento all'indagine DOE, aprire la ricetta creata per studiare i diversi parametri.Fare clic su sfoglia e selezionare il rispettivo esperimento. I tag della nave sono già arruolati nella colonna. Per definire il fattore DOE desiderato, selezionate il parametro e fate clic sulla colonna etichettata, fattore DOE.Selezionare new" e aggiungere le unità, l'abbreviazione, nonché il limite inferiore e superiore dei fattori. Nella scheda risposte definire i valori da considerare per l'analisi dei dati. Fare clic su modifica risposte DOE e definire il nome della risposta, dell'abbreviazione, delle unità e dei limiti minimi e massimi.Una volta definite le risposte, selezionare la variabile ambra per ogni risposta e definire. Una risposta può essere automaticamente associata a una variabile bioreattore microbico. Scegliere la variabile richiesta dall'elenco a discesa.Modificare l'equazione per ogni risposta in base al requisito. Le scelte tra i dati minimo, massimo, primo, ultimo e medio. Per creare una progettazione, utilizzare la Creazione guidata Avvia progettazione per selezionare il tipo di progettazione sperimentale e per aggiungere o rimuovere il numero di repliche e punti centrale.Selezionare l'obiettivo, che determina la scelta dei progetti e dei modelli. Completare e creare pacchetti di lavoro che possono essere importati nel software di autocoltura Amber come descritto nel protocollo di testo. Nella scheda esperimento fare clic su crea esperimento DOE e cercare il pacchetto di lavoro creato utilizzando il software DOE.Inizializzare il processo facendo clic su Avvia. Una volta eseguito l'esperimento, esportare i dati utilizzando i risultati DOE di esportazione. Viene visualizzata la finestra risultati DOE di esportazione e le righe che indicano il contenitore e la stazione delle impostazioni cultura sono elencate nella tabella.Selezionare le righe desiderate e fare clic sull'esportazione delle righe selezionate"o esportare i dati sperimentali"per memorizzare tutti i risultati e salvare il file per ulteriori analisi. Importare i dati nel modulo Amber DOE passando alla scheda risultati e selezionando importa risultati. Cercare il file di dati desiderato e fare clic su Analizza risultati.La crescita cellulare nei bioreattori microbo automatizzati è paragonabile ai bioreattori multiuso. Confrontando la concentrazione cellulare da tre diverse scale, si osserva che il bioreattore microbo automatizzato da 15 millilitri imita il bioreattore di vetro da due litri. Anche i risultati del pallone agitare vengono confrontati per mostrare il beneficio dell'ambra.L'influenza della diversa velocità di agitazione e PH è studiata nei bioreattori microbe automatizzati. Qui è mostrato un confronto tra la concentrazione cellulare vitale, o VCC, e la concentrazione di anticorpi monoclonali nei diversi bioreattori microbici. Si può osservare l'influenza negativa di PH 6.9 sul VCC.Inoltre, la crescita delle cellule è migliorata significativamente sotto la coltura a PH 7.3 rispetto a PH 7.1. Qui sono mostrati i appezzamenti di contorno di risposta della concentrazione di anticorpi vcc e monoclonali. I valori sono comparabili nei recipienti con la stessa PH e la diversa velocità dell'agitatore, indicando che la velocità dell'agitatore raccolta per questo processo non ha alcuna influenza significativa sull'uscita del processo.Ogni istruzione data alla macchina deve essere scritta con cura per evitare errori durante l'esecuzione dell'esperimento. Il software è flessibile e può eseguire una serie di esperimenti contemporaneamente, riducendo così la quantità di tempo necessaria per ottimizzare un processo. La progettazione dell'esperimento è utile nel campo del bioprocesso, poiché i risultati forniscono una comprensione del processo basata sulla conoscenza, che può essere estesa ad altri organismi in una certa misura.

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Scopri come ottimizzare i processi biotecnologici con microreattori automatizzati e Design of Experiments. Questo metodo consente di eseguire esperimenti in parallelo per analizzare proteine con colonne Protein A.

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dellammasso cinese (Video) | JoVE Journal

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