Name: Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Scopri un metodo rapido ed economico per identificare i regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali utilizzando librerie RNAi e un reporter Dual-Luciferase. Questa tecnica a media velocità è accessibile alla maggior parte dei ricercatori.

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Ringraziamo Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross per aver assistito nella preparazione dei vettori shRNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).

NOTA: un riepilogo schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione della libreria vettoriale lentivirale
NOTA: lo schermo dimostrato ha utilizzato una libreria di shRNA disposti acquistati come scorte di glicerolo in piastre di 96 pozze, ma le librerie possono anche essere assemblate manualmente sulla base di un elenco di candidati. Controlli appropriati devono essere considerati e inclusi in qualsiasi libreria. Ciò include uno shRNA di controllo non targeting (shNTC), uno shRNA di controllo che colpisce il fattore di trascrizione in fase di studio e, se possibile, una lucifera lelina mirata a shRNA.
<ol><li>Aggiungere 1,3 mL di Luria Broth (LB) (1% bacpton bacpton, 0,5% di estratto di lievito, 1% NaCl, pH 7,5) contenente 100 g/mL di anchilina a ciascun pozzo di una piastra di pozzo profondo 96. Inoculare ogni pozzo con 2 oltere di lesicerolo e crescere a 37 gradi durante la notte con agitazione costante a 225 giri/min.</li>
	<li>Trasferire ogni coltura batterica in un tubo centrifuga di 1,5 ml e pellet i batteri per centrifugazione a 21.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.</li>
	<li>Purificare ogni vettore utilizzando un mini-prekit kit batterico seguendo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di ogni vettore utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>Conservare i plasmidi a -20 gradi centigradi. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>2. Imballaggio della biblioteca lentivirale in serie
NOTA: Tutti i lavori che coinvolgono il lentivirus, tra cui imballaggi, infezioni e successive colture di cellule infette, devono seguire rigorosamente le norme e i regolamenti istituzionali in materia di biosicurezza.
<ol><li>Espandere le celle 293FT utilizzando supporti a crescita completa (il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4 mM L-glutamine, 4.500 mg/L di glucosio e pirevate di sodio, integrati con 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL di penicillina, 100 streptomici e 2 mM di siero-glutamina lmutuale).</li>
	<li>Per ogni vettore nella libreria dal passaggio 1.4, eseguire il seeding di un 24-po 'con 1 x 105 293FT celle. NOTA: Si raccomanda di confezionare alcuni pozzi aggiuntivi di un vettore virale di controllo per testare il tipero del virus prima di procedere al passaggio 3 (vedi sotto).</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h. NOTA: Un protocollo generale per l'imballaggio del lentivirus descritto in precedenza14 è stato scalato a 24 pozzi per questo protocollo. Utilizza psPAX2 per l'imballaggio lentivirale e VSVG come proteina del cappotto. Se si desidera il virus ectropico, un vettore che fornisce Eco può essere utilizzato al posto di VSVG. Si raccomanda vivamente che questo protocollo è ottimizzato per ottenere un titer virale che dà tra 30%-70% efficienza infezione delle cellule bersaglio (vedi Discussione). Vedere la Tabella supplementare 1 per un elenco di tutti i vettori utilizzati.</li>
	<li>Impostare una miscela di trasfezione per ogni vettore virale dal passaggio 1.4 come descritto di seguito. Ogni trasfezione deve contenere 250 ng del vettore virale, 125 ng di psPAX2, 125 ng di VSVG, 1,25 l di reagente di trasfezione 1 e 23,75 l di buffer di trasfezione (vedi Tabella dei materiali).<ol>
<li>Diluire ogni vettore lentivirale a 50 ng/L con acqua priva di nuclenonsi, quindi trasferire 5 (250 ng) in un pozzo di una piastra PCR di 96 pozze.</li>
		<li>Fare in modo che la super miscela di trasfezione si munti di 1,25 x di reagente di trasfezione 1 e 23,75 X del buffer di trasfezione preriscaldato, dove "X" è il numero totale di trasfettanti più diversi in più per tenere conto della perdita di volume durante la pipettaggio.</li>
		<li>Incubare la super miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 125 ng X di psPAX2 e 125 ng - X di VSVG al tubo di trasfezione super mix da Passo 2.4.3 e pipet delicatamente su e giù per mescolare. Procedere rapidamente al passaggio 2.4.5.</li>
		<li>Immediatamente aliquota la miscela dalla fase 2.4.4 in ogni tubo di una striscia PCR, quindi utilizzare pipetta multicanale per trasferire 25 : la miscela in ogni pozzo contenente vettore virale dalla fase 2.4.1.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 20 min.</li>
		<li>Trasferire tutti i 30 gradi da ogni 96-po da Passo 2.4.6 in un pozzo del 24-pozzo contenente 293 celle FT dal Passo 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 24 h e quindi sostituire i supporti in ogni pozzo della piastra di 24 pozze con 500 gradi di supporti di crescita completa. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per altri 24 h.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta multicanale, raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo e 220 L (abbastanza per 1 infezione aliquota nel Passo 3 più qualche volume extra) in due 96-pozzi ciascuno. Queste sono le placche supernatali virali schierate.</li>
	<li>Conservare le placche supernate virali in serie a -80 gradi centigradi. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Si consiglia inoltre di testare alcuni dei virus di controllo supplementare che è stato confezionato (vedi sopra) sulle cellule da infettare prima di procedere al passo 3. Questo per garantire che il titolo sia sufficiente per ottenere almeno il 30% di efficienza dell'infezione.</li>
</ol>3. Infezione delle cellule per lo schermo
NOTA: Le cellule del melanoma umano (A375) sono state utilizzate per dimostrare questo approccio, ma questo metodo può essere applicato a tutte le cellule aderenti che infettano con lentivirus. Tuttavia, la coltura cellulare e le condizioni di placcatura devono essere ottimizzate per ogni riga di cella (vedere Discussione).
<ol><li>Espandere le cellule per essere infettati in mezzi di crescita completa.</li>
	<li>Seme 24-bene piastre con 1 x 105 celle in 0,5 ml di supporti di crescita completa per bene. Seme uno bene per ogni vettore virale da testare (compresi i controlli) e includere un pozzo extra che non sarà infettato che servirà come un controllo per la selezione di droga nel Passo 3.7.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.</li>
	<li>Infettare ogni bene dalla Fase 3.2 con un supernatante virale diverso dal supernatante lentivirale congelato array come segue.<ol>
<li>Preparare un supporto di crescita completo che contenga 20 g/mL di polibrene.</li>
		<li>Scongelare i supernatani della biblioteca lentivirale dalla fase 2.7 alla temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare i mezzi di crescita dalle lastre di 24 pozzetti della Fase 3.2 e aggiungere immediatamente 200 l di supporti di crescita contenenti polibrene ad ogni pozzo.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 200 l di supernatante virale da ogni 96-po dal passo 3.4.2 ai 24 pozzi dal Passo 3.4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 - 48 h. NOTA: Alcune linee cellulari possono richiedere più di 24 h per esprimere gli shRNA e diventare resistenti alla panina. Il vettore virale qui utilizzato fornisce un Turbo-GFP-IRES-puro-puror con uno shRNA a base di miR30 nel 3'UTR di puroR (Figura 1). L'efficienza dell'infezione e l'espressione del gene di resistenza alla puromicina e dello shRNA sono stati monitorati da proteine fluorescenti verdi.</li>
	<li>Preparare un supporto di crescita completo che contenga 2,5 g/mL di puromycina. NOTA: la concentrazione di selezione della puromicina varia da una cella all'altra. Si raccomanda di eseguire una curva di uccisione antibiotica per ogni linea cellulare da disattendere prima dello schermo.</li>
	<li>Aspirare i media da ogni pozzo e sostituirli con 500 - L di puromycin contenenti supporti di crescita completi. NOTA: Assicurarsi di aggiungere anche la puromicina a un pozzo di controllo non infetto che può essere utilizzato nei passaggi successivi per garantire che la selezione della puromicina sia completa.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 48 h. NOTA: È meglio selezionare per 48 h, quindi la densità di placcatura e il titer virale devono essere ottimizzati in modo che le cellule non siano sovraconfluenti prima di 48 h.</li>
	<li>Assicurarsi che le cellule infette siano verdi al microscopio fluorescente e che le cellule di un controllo non infettate siano tutte trattate con puromycinsiano siano tutte morte prima di procedere al passaggio 4.</li>
</ol>4. Semina le cellule per la trasfezione del giornalista a doppia luciferasi
NOTA: una trasfezione di prova deve essere eseguita per determinare la densità di semina ottimale per ogni nuova linea cellulare.
<ol><li>Orpsinizzare ogni pozzo dal passo 3.9 e trasferire circa 1 x 105 celle in pozzi nella posizione corrispondente sulla nuova piastra 24-well come segue. NOTA: Questo protocollo è progettato per lo screening di librerie con centinaia di shRNA, quindi non è possibile contare ogni pozzo di cellule infette. Pertanto, i passaggi seguenti sono stati utilizzati per stimare il numero di celle in ogni pozzo per contribuire a garantire una densità di placcatura approssimativamente uguale.<ol>
<li>Raggruppare i pozzi da Passo 3.9 in 3 - 4 gruppi in modo che tutti i pozzi in un gruppo hanno una densità di cellule simile.</li>
		<li>Provate bene 1 rappresentativo da ogni gruppo con 200 gradi L di trypsin-EDTA (1x PBS integrati con 0,5 mM EDTA e 0,1% di prova) per 5 min a 37 . Quindi neutralizzare la trypsin-EDTA aggiungendo 400 l di puromycina contenente supporti di crescita completa.</li>
		<li>Contare bene ogni rappresentante per determinare il numero totale di celle e diluire la sospensione cellulare da ogni rappresentante a 2 x 105 celle/mL dell'utilizzo di supporti di crescita completi.</li>
		<li>Seme 0,5 mL (1 x 105 celle) di ciascuno bene dalla fase 4.1.3 nella posizione corrispondente su una nuova piastra di 24 pozze e incubare questa nuova piastra di 24 pozze a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 24 h.</li>
		<li>Per ogni gruppo dal passaggio 4.1.1, utilizzare il numero di cella totale determinato nel passaggio 4.1.3 per calcolare il volume di trypsin-EDTA da aggiungere a ogni pozzo in modo che la sospensione delle celle risultante sia 1 x 106 celle / mL.</li>
		<li>Aggiungere il volume appropriato di trypsin-EDTA ad ogni pozzo e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi. NOTA: Per lo schermo più grande si consiglia di provare e riaffiorare le piastre a 24 pozzetti in gruppi piuttosto che tutte in una volta per garantire la vitalità delle cellule.</li>
		<li>Durante l'incubazione di cui sopra, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 400 l di mezzi di crescita completa contenenti puromicina ai pozzi corrispondenti su una nuova piastra di 24 pozzetti.</li>
		<li>Trasferire 100 l di sospensione cellulare (circa 1 x 105 celle) da ogni pozzo alla posizione corrispondente sulle nuove piastre da 24 pozze preparate nel passo 4.1.7.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 4.1.6 a 4.1.8 per tutte le piastre di pozze raggruppate dal passaggio 4.1.1, una piastra alla volta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.</li>
</ol>5. Trasfezione del giornalista a doppia luciferalità
<ol><li>Transfect ogni bene dal Passo 4.2 con il reporter dual-luciferate costruisce come segue. NOTA: La quantità totale di DNA e il rapporto ottimale di vettore reporter luciferasi lucciole al controllo Renilla luciferase vettore deve essere determinato prima di iniziare questo saggio. Qui, 400 ng di una miscela di DNA che contiene 20 parti firefly luciferasi reporter e 1 parte di controllo Renilla luciferase è stato utilizzato.<ol>
<li>Effettuare la miscela di diluizione di trasfezione (Tube A) e la miscela di diluizione del reporter (Tube B) mescolando i volumi indicati di ciascun reagente (Tabella 1) moltiplicato per il numero totale di trafetti (più diversi extra). NOTA: questo protocollo è ottimizzato per il reagente 2 (vedere Tabella dei materiali). Se viene utilizzato un reagente di trasfezione diverso, la trasfezione deve essere ottimizzata prima di questo passaggio.</li>
		<li>Mescolare la miscela di diluizione di trasfezione (Tube A) con la miscela di diluizione del reporter (Tube B) e incubare a temperatura ambiente per 15 min per produrre la miscela di trasfezione.</li>
		<li>Durante l'incubazione di cui sopra, sciacquare ogni 24-po dal Passo 4.2 con 0.25 mL di salina buffer fosfato (PBS), e aggiungere 447 L di supporti di crescita completa ad ogni pozzo.</li>
		<li>Dopo l'incubazione di 15 minuti, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 53 ll di miscela di trasfezione in ogni pozzetto delle piastre di 24 pozze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.</li>
</ol>6. Quantificazione dell'attività a doppia luciferalità
<ol><li>Misurare l'attività luciferasi utilizzando un lettore di lamiere e un kit di prova reporter a doppia luciferalasi come descritto di seguito. NOTA: questo protocollo è ottimizzato per il kit di analisi reporter indicato (vedere Tabella dei materiali) e segue il protocollo consigliato dal produttore.<ol>
<li>Preparare abbastanza 1x buffer di lisi passiva per tutti i pozzi più diversi extra (75 è necessario per bene) diluindo 5x buffer di lisi passiva (fornito in kit) 1 a 5 con acqua deionizzata. Anche scongelare il reagente A e il buffer B del reagente (fornito nel kit, per ogni pozzo è necessario 100 l di ciascuno).</li>
		<li>Aspirare il supporto da ogni pozzo della piastra 24-po' dal Passo 5.2.</li>
		<li>Aggiungere 75 luna di 1x tampone di lisi passiva ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 min con occasionalmente agitazione.</li>
		<li>Preparare il reagente B diluindo il substrato 50x reagente B (fornito in kit) 1:50 con buffer reagente B scongelato.</li>
		<li>Aggiungere 30 l di 1x buffer di lisi passiva a 4 pozze per lo svuotamento (vedere la tabella supplementare 2).</li>
		<li>Trasferire 30 luna di lispetto dalla fase 6.1.3 in pozze duplicate di una piastra di analisi bianca inferiore piatta 96-well.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 -L di reagente A ad ogni pozzo e leggere il segnale luciferasi lucciola con un lettore di piastre.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 -L di reagente B da Passo 6.1.4 a ogni pozzo e leggere il segnale Di Renilla luciferaree con un lettore di piastre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elaborare i dati non elaborati come segue (per una descrizione dettagliata, vedere la tabella supplementare 2).<ol>
<li>Escludere i campioni con un segnale molto basso di Renilla luciferate come valori bassi indicano che il costrutto virale era tossico o che troppo poche cellule trasfette sono state valutate. NOTA: Come spiegato nella discussione, il segnale di Renilla luciferase significativamente "basso" può portare a risultati anomali. Qui sono stati esclusi i pozzi in cui il segnale di Renilla luciferate era superiore a 1 deviazione standard al di sotto della media (cfr. tabella supplementare 2). Questo si basava su studi precedenti eseguiti utilizzando questo sistema di reporter in queste cellule14, ma può differire in altre linee cellulari.</li>
		<li>Normalizzare il valore di luciferasi lucciola cruda di ogni pozzo per il valore crudo Renilla luciferase dello stesso pozzo per ottenere il rapportoluccio/Renilla.</li>
		<li>Calcolare laRenilla media dei rapporti lucciola/Renilla di tutti i pozzi di controllo di replica e quindi dividere bene il rapporto lucciola/Renilla di ogni altro con quel numero per ottenere un cambio di piega.Renilla</li>
		<li>Assegnare il campione di controlloRenilla e impostare il suo valore del rapporto lucciola/Renilla a 1.</li>
		<li>Calcolare laRenilla media dei rapporti lucciola/Renilla dei pozzi duplicati e tracciare con la deviazione standard. NOTA: La deviazione standard non viene utilizzata per l'analisi statistica, ma come mezzo per identificare i pozzi in cui le repliche differiscono in modo significativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, dimostriamo un approccio per lo screening a medio velocità delle librerie virali di serie in combinazione con un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi che può essere utilizzato per identificare e testare nuovi regolatori di fattori di trascrizione. È fondamentale caratterizzare e ottimizzare il sistema di reporter per ogni riga di cella prima di qualsiasi schermata. Gli esperimenti dovrebbero essere fatti per confermare che il reporter risponde all'attività alterata del fattore di trascr...

Lo scopo di questo saggio è quello di utilizzare librerie virali per identificare i regolatori di fattori di trascrizione in modo relativamente rapido e poco costoso. L'attività trascrizionale aberrante è associata al cancro e alla metastasi1,2,3,4,5,6, quindi prendere di mira i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali è un promettente approccio terapeutico. Tuttavia, i fattori di trascrizione sono spesso difficili da indirizzare farmacologicamente7 e molti sono necessari per la normale funzione cellulare nei tessuti adulti8,9,10. Puntare sulle vie associate al cancro che attivano aberrante i fattori di trascrizione per guidare la malattia è un approccio più fattibile con il potenziale di avere effetti collaterali meno gravi. La disponibilità commerciale di librerie di RNAi lentivirali e retrovirali con matrice, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF consente ai ricercatori di testare l'importanza di numerosi geni in un singolo esperimento. Tuttavia, è necessaria una lettura affidabile per l'attività trascrizionale alterata.
Qui, descriviamo l'uso di un saggio di saggio di prosaggio di un giornalista trascrizionale a doppia luciferasi e di librerie lentivirali di matrice per identificare le proteine che regolano i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. In questo saggio, gli shRNA che colpiscono i geni associati al cancro vengono consegnati alle cellule tumorali dei mammiferi tramite la trasduzione lentivirale e le cellule vengono selezionati per un'integrazione stabile utilizzando la micina. Le cellule vengono successivamente trascate con un costrutto reporter che esprime luciferasi di lucciole guidate da un promotore specifico per il fattore di trascrizione che viene studiato e un costrutto di controllo che esprime Renilla luciferasi da un promotore di vulcaniamente attivo che non risponde al fattore di trascrizione in fase di studio. Dimostriamo questo approccio con uno schermo proof-of-concept per i regolatori di YAP e TA, gli eftrattieri critici a valle del percorso Hippo8,10,11. L'attività anomala di YAP e TAz promuove diversi passaggi della cascata metastatica11 ed è osservata in molti tumori11,12,13. Tuttavia, il modo in cui YAP e TAa diventano attivati aberrantemente in alcune cellule tumorali non è ancora completamente compreso. YAP e TAA non legano il DNA, ma vengono reclutati per promuovere da altri fattori di trascrizione. I membri della famiglia di fattori di trascrizione del dominio TEA (TEAD) sono i principali partner di associazione per YAP e TAA e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni dipendenti da YAP e TAz. Il nostro costrutto reporter esprime luciferasi di lucciole da parte di un promotore yAP/TAz-TEAD-responsive e studi precedenti hanno dimostrato che rileva fedelmente i cambiamenti nell'attività trascrizionale YAP-TEAD2,14,15.
Il nostro approccio è rapido, medio-velocità, e non richiede strutture di screening, robot automatizzati, o sequenziamento profondo di librerie in pool. I costi sono relativamente bassi e ci sono numerose librerie disponibili in commercio tra cui scegliere. Le attrezzature e i reagenti necessari sono relativamente standard nella maggior parte dei laboratori. Può essere utilizzato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione se un reporter basato su luciferate esiste o viene generato. Usiamo questo approccio per vagliare gli shRNA nelle cellule tumorali, ma qualsiasi linea cellulare che può essere trasfetata con una ragionevole efficienza potrebbe essere utilizzata con qualsiasi tipo di libreria in serie.

<table><tbody><tr><td>Piastra in polipropilene a 96 pozzetti da 2,0 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td>Per mini-prep batterica</td></tr><tr><td>Tripsina - 2,50%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Componente della piastra per</td></tr><tr><td>saggio bianca a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Per il test a doppia luciferasi</td></tr><tr><td>Ampicillina - 100 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-10835242001-EA</td><td>Per mini-prep batterica</td></tr><tr><td>Bacto-triptone - polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td>Componente del sistema di</td></tr><tr><td>analisi del reporter a doppia luciferasi del brodo LB, che include il reagente LAR II (reagente A), Stop & Glo (substrato del reagente B) e Stop & Tampone Glo (tampone reagente B) - Kit</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Per il dosaggio della doppia luciferasi</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio, magnesio e rosso fenolo - 9,6 g/L</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>Per PBS</td></tr><tr><td>EDTA - 0,5 M</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Componente della tripsina-EDTA</td></tr><tr><td>Etanolo - 100%</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>Per mini-prep fetale batterico</td></tr><tr><td> Siero bovino - 100%</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Componente del terreno di crescita completo</td></tr><tr><td>Bromuro di esadimetrina (polibrene) - 8 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Per l'infezione virale</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/Alto glucosio - 4 mM L-glutammina; 4500 mg/L di glucosio; piruvato di sodio</td><td>GE Healthcare life sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Componente del terreno di crescita completo</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Micropiastra multimodale/EA</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Per il dosaggio della doppia luciferasi</td>L-glutammina - 200 mM Gibco 25030-081 Componente del terreno di crescita completo Lipofectamina 3000 (Reagente di trasfezione 2) - 100%Life technologies L3000008 Per le trasfezioni Biologia molecolare Acqua - 100%VWR 02-0201-0500 Per la diluizione del vettore shRNA per il confezionamento di virus NaCl - polvere <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>Componente del brodo LB</td></tr><tr><td>NanoDrop One Spettrofotometro UV-Vis a microvolume</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Per misurare la concentrazione di DNA vettoriale</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100%</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Per trasfezioni</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina - 10.000 Unità/ml (Penicillina); 10.000 &micro; g/ml (Streptomicina)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente del terreno di coltura completo</td></tr><tr><td>Kit Miniprep Plasmidico Rapido PureLink - Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td>Per mini-prep batterico</td></tr><tr><td>Puromicina - 2,5 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Per la selezione degli antibiotici dopo l'infezione</td></tr><tr><td>Contatore cellulare automatizzato TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Per la conta cellulare</td></tr><tr><td>Reagente per trasfezione del DNA X-tremeGENE 9 (Reagente per trasfezione 1) - 100%</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Per il confezionamento di virus</td></tr><tr><td>Estratto di lievito - polvere</td><td>VWR</td><td>J850</td><td>Componente del brodo LB</td></tr><tr><td>P3000 (Reagente per trasfezione 3) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Per trasfezioni</td></tr></tbody></table>

identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su dual-luciferase

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

I fattori di trascrizione possono alterare l'espressione di numerosi geni bersaglio che influenzano una varietà di processi a valle, rendendoli buoni bersagli per le terapie anti-cancro. Tuttavia, il targeting diretto dei fattori di trascrizione è spesso difficile e può causare effetti collaterali negativi se il fattore di trascrizione è necessario in uno o più tessuti adulti. Identificare i regolatori a monte che attivano aberrantei i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali offre un'alternativa più fattibile, in particolare se queste proteine sono facili da sottofare. In questo articolo, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per combinare librerie di lentivirali di media portata in serie e un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. Il nostro approccio offre un modo rapido, semplice ed economico per testare centinaia di geni in un unico esperimento. Per dimostrare l'uso di questo approccio, abbiamo eseguito uno schermo di una libreria di RNAi lentivirale con array con diversi regolatori di proteine associate sì (YAP) e co-attivatore trascrizionale con motivo legante PD , due co-attivatori trascrizionali che sono gli effetti a valle del percorso di Ippona. Tuttavia, questo approccio potrebbe essere modificato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione o co-fattore e potrebbe anche essere utilizzato per lo screening delle librerie CRISPR/CAS9, cDNA o ORF.

Il nostro costrutto reporter YAP/TAz-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contiene un promotore SV-49 minimo con 5 ripetizioni dell'elemento di legame TEAD canonico (MCAT)15 che guida il gene luciferasi della lucciola ( Figura1). È co-transfettato in cellule insieme al vettore di controllo PRL-TK (Promega), che esprime Renilla luciferate...

Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Questo protocollo può essere utilizzato per schermare librerie di saggi lentivirali o retrovirali per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è rapida, media e poco costosa e che utilizza attrezzature e reagenti comunemente accessibili alla maggior parte degli investigatori. Per espandere e purificare ogni vettore lentivirale nella libreria, aggiungere prima 1,3 millilitri di brodo di Luria integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina ad ogni pozzo di una piastra di pozzo profonda 96 pozzi.Inoculare ogni bene con due microlitri di materiale glicerolo per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 225 giri al minuto. Il giorno successivo, trasferire ogni coltura batterica in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Purificare ogni vettore con un kit di miniprep batterico appropriato secondo le istruzioni del produttore.Per ogni vettore nella libreria preparata, seminare un pozzo di una piastra di 24 po 'con una per 10 alla quinta cellule 293FT e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per preparare una miscela di trasfezione che verrà impostata per ogni vettore nella libreria, prima elutare ogni vettore lentivirale ad una concentrazione finale di 50 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Trasferire cinque microlitri di ogni diluizione in singoli pozzi di una piastra PCR a 96 pozzoli.Fai un super mix di trasfezione mescolando 1,25 microlitri per x di reagente di trasfezione uno con 23,75 microlitri per x di tampone di trasfezione preri warmed. Incubare il super mix di trasfezione a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere 125 nanogrammi per x di psPAX2 e 125 nanogrammi per x di VSVG al super mix con pipettazione delicata.Aliquotare immediatamente il super mix in ogni tubo di una striscia PCR e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 25 microlitri della miscela in ogni pozzo di vettore virale diluito. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 30 microlitri di ogni miscela di trasfezione da ogni pozzo in un pozzo corrispondente di celle 293FT nella piastra da 24 po porcili precedentemente preparata. Incubare le cellule per 24 ore prima di sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di crescita completo fresco per un'altra incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare.Il giorno dopo, utilizzare una pipetta multicanale per raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo e aliquota 220 microlitri di ogni supernatante in due pozzi in una nuova piastra da 96 po 'per generare una piastra supernatante virale arrayed. Per preparare le cellule A375 per l'infezione, seminare una volta 10 alla quinta colonna in una piastra di 24 po 'in 0,5 millilitri di mezzo di crescita completo per pozzo per ogni vettore virale nella libreria. Includere un pozzo extra che non verrà infettato per fungere da controllo per la selezione dei farmaci.Dopo un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare, scongelare il supernatante lentivirale congelato impostato a temperatura ambiente prima di sostituire il mezzo di crescita da ogni pozzo della piastra di coltura cellulare preparata con 200 microlitri di mezzo di crescita integrati con 20 microgrammi per millilitro di polibrene. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 200 microlitri di supernatante virale da ogni 96 bene ad ogni pozzo della piastra da 24 porri. Riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 24-48 ore.Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di crescita integrati con puromicina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altre 48 ore. Dopo la selezione di puromicina di 48 ore, ordinare le cellule in tre o quattro gruppi in modo che tutti i pozzi di un singolo gruppo abbiano una densità cellulare simile e aggiungere 200 microlitri di tripside-EDTA a un pozzo rappresentativo di ogni gruppo per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripina con 400 microlitri di terreno di crescita integrati con puromicina e contare il numero di cellule da ogni pozzo tripsinizzato.Diluire ogni sospensione cellulare a una concentrazione di due volte 10-quinta cella per millilitro con mezzo di crescita integrato con puromicina e semi 500 microlitri di cellule da ogni pozzo nella stessa posizione del pozzo in una nuova piastra da 24 pozzetti. Dopo aver utilizzato bene i conteggi di ciascun rappresentante per stimare il numero di cellule in ogni pozzo rimanente in ciascun gruppo, aggiungere ad ogni pozzo il volume appropriato di tripside-EDTA per ottenere una concentrazione di una volta e 10 alla sesta cella per millilitro. Durante la tripsininazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 400 microlitri di mezzo di crescita integrati con puromicina ai pozzi corrispondenti appropriati nella nuova piastra da 24 pozza.Una volta staccate le cellule, mescolare delicatamente il contenuto di ogni pozzo e trasferire 100 microlitri di ogni sospensione cellulare all'apposito pozzo corrispondente nella nuova piastra da 24 pozzi. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Per trasfetto le cellule con i costrutti del reporter a doppia luciferasi, preparare la miscela di diluizione della trasfezione come indicato nella tabella.Per preparare la miscela di diluizione del reporter, mescolare i volumi di ogni reagente moltiplicati per il numero totale di transfettezioni più diversi volumi extra. Quindi, mescolare la miscela di diluizione di trasfezione con la miscela di diluizione del reporter e incubare la soluzione risultante a temperatura ambiente per 15 minuti per produrre la miscela di trasfezione. Durante l'incubazione, sciacquare ogni pozzo della piastra di coltura cellulare con 250 microlitri di PBS e aggiungere 447 microlitri di mezzo di crescita fresco completo ad ogni pozzo.Quindi utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 53 microlitri di miscela di trasfezione ad ogni pozzo della piastra di coltura cellulare. Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per misurare l'attività della luciferasi, diluire il tampone dilisi passiva 5X dal kit di attività della luciferasi in una diluizione uno-a-cinque con acqua deionizzata e scongelare i volumi necessari di reagente A e tampone B reagente dal kit.Quando i reagenti sono pronti, sostituire il supernatante in ogni pozzo con 75 microlitri di tampone di lisi passiva e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente con scuotimenti occasionali. Durante l'incubazione, diluire il substrato B del reagente 50X dal kit a una concentrazione uno-a-50 con tampone B del reagente scongelato. Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di tampone di lisi passiva a quattro pozzi di controllo vuoti e trasferire 30 microlitri di lisato da ciascun pozzo in pozzi duplicati di una piastra di dosaggio bianca inferiore piatta da 96 po '.Quando tutto il lisato è stato placcato, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente A a ciascun pozzo e leggere il segnale luciferasi lucciola con un lettore di piastre. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente B ad ogni pozzo e leggere il segnale Renilla luciferasi con un lettore di piastre. Come previsto, YAP2SA aumenta l'attività della luciferasi della lucciola ma non l'attività della renilla luciferasi rispetto al vettore di controllo.Al contrario, YAP2SA S94A non aumenta l'attività della luciferasi lucciola. È importante sottolineare che YAP2SA non altera l'attività di un costrutto promotore minimo privo degli elementi di associazione MCAT TEAD. Nelle cellule trasfette con il costrutto reporter YAP-TAZ-TEAD, i tornanti corti YAP e TAZ tandem hanno ridotto significativamente i livelli di luciferasi della lucciola, ma il controllo del tornante corto di controllo non mira non lo fa.Al contrario, nelle cellule trasfette con il costrutto minimal reporter, l'RNA a forcina corta YAP-TAZ non altera significativamente i livelli di luciferasi lucciola. Anche il segnale Renilla in ogni pozzo non è significativamente alterato dal controllo corto del tornante non mirato o dall'RNA a forcina corta YAP-TAZ. Come previsto, gli RNA a tornanti corti rivolti a YAP e TAZ, SARC o PI3 chinasi riducono significativamente l'attività YAP-TAZ-TEAD.Gli RNA a forcina corta rivolti a ATM, CDH1, CSK, ERBB2 e gelsolina aumentano ciascuno livelli normalizzati di luciferasi lucciola coerenti con gli studi pubblicati che mostrano che queste proteine erano YAP e /o TAZ. Nonostante i ruoli stabiliti per ATR, CCNE2 ed ERBB4 in altri tipi di cellule, gli RNA a tornanti corti che prendono di mira questi geni non cambiano significativamente i livelli normalizzati di luciferasi lucciola nelle cellule A375. Seguendo questa schermata, i regolatori identificativi devono essere convalidati utilizzando altre letture per la loro attività del fattore di trascrizione.Dovrebbe essere confermato anche l'efficace abbattimento del regolatore identificato da parte del saggio. Ricordarsi di usare cautela e di seguire le linee guida di sicurezza quando si lavora con lentivirus infettivi, in particolare se i virus sono infettivi per l'uomo.

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