Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Questo protocollo può essere utilizzato per schermare librerie di saggi lentivirali o retrovirali per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è rapida, media e poco costosa e che utilizza attrezzature e reagenti comunemente accessibili alla maggior parte degli investigatori. Per espandere e purificare ogni vettore lentivirale nella libreria, aggiungere prima 1,3 millilitri di brodo di Luria integrati con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina ad ogni pozzo di una piastra di pozzo profonda 96 pozzi.

Inoculare ogni bene con due microlitri di materiale glicerolo per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 225 giri al minuto. Il giorno successivo, trasferire ogni coltura batterica in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per la centrifugazione. Purificare ogni vettore con un kit di miniprep batterico appropriato secondo le istruzioni del produttore.

Per ogni vettore nella libreria preparata, seminare un pozzo di una piastra di 24 po 'con una per 10 alla quinta cellule 293FT e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per preparare una miscela di trasfezione che verrà impostata per ogni vettore nella libreria, prima elutare ogni vettore lentivirale ad una concentrazione finale di 50 nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Trasferire cinque microlitri di ogni diluizione in singoli pozzi di una piastra PCR a 96 pozzoli.

Fai un super mix di trasfezione mescolando 1,25 microlitri per x di reagente di trasfezione uno con 23,75 microlitri per x di tampone di trasfezione preri warmed. Incubare il super mix di trasfezione a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere 125 nanogrammi per x di psPAX2 e 125 nanogrammi per x di VSVG al super mix con pipettazione delicata.

Aliquotare immediatamente il super mix in ogni tubo di una striscia PCR e utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 25 microlitri della miscela in ogni pozzo di vettore virale diluito. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 30 microlitri di ogni miscela di trasfezione da ogni pozzo in un pozzo corrispondente di celle 293FT nella piastra da 24 po porcili precedentemente preparata. Incubare le cellule per 24 ore prima di sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di crescita completo fresco per un'altra incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare.

Il giorno dopo, utilizzare una pipetta multicanale per raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo e aliquota 220 microlitri di ogni supernatante in due pozzi in una nuova piastra da 96 po 'per generare una piastra supernatante virale arrayed. Per preparare le cellule A375 per l'infezione, seminare una volta 10 alla quinta colonna in una piastra di 24 po 'in 0,5 millilitri di mezzo di crescita completo per pozzo per ogni vettore virale nella libreria. Includere un pozzo extra che non verrà infettato per fungere da controllo per la selezione dei farmaci.

Dopo un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare, scongelare il supernatante lentivirale congelato impostato a temperatura ambiente prima di sostituire il mezzo di crescita da ogni pozzo della piastra di coltura cellulare preparata con 200 microlitri di mezzo di crescita integrati con 20 microgrammi per millilitro di polibrene. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 200 microlitri di supernatante virale da ogni 96 bene ad ogni pozzo della piastra da 24 porri. Riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 24-48 ore.

Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di crescita integrati con puromicina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altre 48 ore. Dopo la selezione di puromicina di 48 ore, ordinare le cellule in tre o quattro gruppi in modo che tutti i pozzi di un singolo gruppo abbiano una densità cellulare simile e aggiungere 200 microlitri di tripside-EDTA a un pozzo rappresentativo di ogni gruppo per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripina con 400 microlitri di terreno di crescita integrati con puromicina e contare il numero di cellule da ogni pozzo tripsinizzato.

Diluire ogni sospensione cellulare a una concentrazione di due volte 10-quinta cella per millilitro con mezzo di crescita integrato con puromicina e semi 500 microlitri di cellule da ogni pozzo nella stessa posizione del pozzo in una nuova piastra da 24 pozzetti. Dopo aver utilizzato bene i conteggi di ciascun rappresentante per stimare il numero di cellule in ogni pozzo rimanente in ciascun gruppo, aggiungere ad ogni pozzo il volume appropriato di tripside-EDTA per ottenere una concentrazione di una volta e 10 alla sesta cella per millilitro. Durante la tripsininazione, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 400 microlitri di mezzo di crescita integrati con puromicina ai pozzi corrispondenti appropriati nella nuova piastra da 24 pozza.

Una volta staccate le cellule, mescolare delicatamente il contenuto di ogni pozzo e trasferire 100 microlitri di ogni sospensione cellulare all'apposito pozzo corrispondente nella nuova piastra da 24 pozzi. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Per trasfetto le cellule con i costrutti del reporter a doppia luciferasi, preparare la miscela di diluizione della trasfezione come indicato nella tabella.

Per preparare la miscela di diluizione del reporter, mescolare i volumi di ogni reagente moltiplicati per il numero totale di transfettezioni più diversi volumi extra. Quindi, mescolare la miscela di diluizione di trasfezione con la miscela di diluizione del reporter e incubare la soluzione risultante a temperatura ambiente per 15 minuti per produrre la miscela di trasfezione. Durante l'incubazione, sciacquare ogni pozzo della piastra di coltura cellulare con 250 microlitri di PBS e aggiungere 447 microlitri di mezzo di crescita fresco completo ad ogni pozzo.

Quindi utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 53 microlitri di miscela di trasfezione ad ogni pozzo della piastra di coltura cellulare. Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per misurare l'attività della luciferasi, diluire il tampone dilisi passiva 5X dal kit di attività della luciferasi in una diluizione uno-a-cinque con acqua deionizzata e scongelare i volumi necessari di reagente A e tampone B reagente dal kit.

Quando i reagenti sono pronti, sostituire il supernatante in ogni pozzo con 75 microlitri di tampone di lisi passiva e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente con scuotimenti occasionali. Durante l'incubazione, diluire il substrato B del reagente 50X dal kit a una concentrazione uno-a-50 con tampone B del reagente scongelato. Al termine dell'incubazione, aggiungere 30 microlitri di tampone di lisi passiva a quattro pozzi di controllo vuoti e trasferire 30 microlitri di lisato da ciascun pozzo in pozzi duplicati di una piastra di dosaggio bianca inferiore piatta da 96 po '.

Quando tutto il lisato è stato placcato, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente A a ciascun pozzo e leggere il segnale luciferasi lucciola con un lettore di piastre. Quindi utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 microlitri di reagente B ad ogni pozzo e leggere il segnale Renilla luciferasi con un lettore di piastre. Come previsto, YAP2SA aumenta l'attività della luciferasi della lucciola ma non l'attività della renilla luciferasi rispetto al vettore di controllo.

Al contrario, YAP2SA S94A non aumenta l'attività della luciferasi lucciola. È importante sottolineare che YAP2SA non altera l'attività di un costrutto promotore minimo privo degli elementi di associazione MCAT TEAD. Nelle cellule trasfette con il costrutto reporter YAP-TAZ-TEAD, i tornanti corti YAP e TAZ tandem hanno ridotto significativamente i livelli di luciferasi della lucciola, ma il controllo del tornante corto di controllo non mira non lo fa.

Al contrario, nelle cellule trasfette con il costrutto minimal reporter, l'RNA a forcina corta YAP-TAZ non altera significativamente i livelli di luciferasi lucciola. Anche il segnale Renilla in ogni pozzo non è significativamente alterato dal controllo corto del tornante non mirato o dall'RNA a forcina corta YAP-TAZ. Come previsto, gli RNA a tornanti corti rivolti a YAP e TAZ, SARC o PI3 chinasi riducono significativamente l'attività YAP-TAZ-TEAD.

Gli RNA a forcina corta rivolti a ATM, CDH1, CSK, ERBB2 e gelsolina aumentano ciascuno livelli normalizzati di luciferasi lucciola coerenti con gli studi pubblicati che mostrano che queste proteine erano YAP e /o TAZ. Nonostante i ruoli stabiliti per ATR, CCNE2 ed ERBB4 in altri tipi di cellule, gli RNA a tornanti corti che prendono di mira questi geni non cambiano significativamente i livelli normalizzati di luciferasi lucciola nelle cellule A375. Seguendo questa schermata, i regolatori identificativi devono essere convalidati utilizzando altre letture per la loro attività del fattore di trascrizione.

Dovrebbe essere confermato anche l'efficace abbattimento del regolatore identificato da parte del saggio. Ricordarsi di usare cautela e di seguire le linee guida di sicurezza quando si lavora con lentivirus infettivi, in particolare se i virus sono infettivi per l'uomo.