Name: In Vivo Augmentazione dellinduzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara a indurre cellule T regolatorie gut-homing in vivo mediante cellule dendritiche ingegnerizzate. Questo metodo immunoterapeutico è efficace anche in ambienti fortemente pro-infiammatori.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio dell'Assistente Segretario della Difesa per gli Affari Sanitari attraverso il Peer Reviewed Medical Research Program sotto il premio N. . W81XWH-15-1-0240 (XT). Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelli dell'autore e non sono necessariamente approvati dal Dipartimento della Difesa. Questo lavoro è stato anche parzialmente sostenuto da Research Innovation Grants del Dipartimento di Medicina dell'Università di Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT] e 325491 [DJB]).

Tutti i protocolli di studio sugli animali in vivo sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso istituzionale degli animali (IACUC) dell'Università di Loma Linda, nonché dall'Ufficio per la revisione della cura e l'uso degli animali (ACURO) del Comando per la ricerca medica e il materiel dell'esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) Dipartimento della Difesa.
1. Preparazione del Lentivirus che esprime sia 1-idrossilasi e RALDH2 (lenti-CYP-ALDH Virus)
<ol><li>Giorno 0: Al mattino presto, preparare 5 x 105 cellule / mL di 293T cellule nel mezzo di coltura cellulare CM-10-D.</li>
	<li>Seme 20 mL/piastra in 150 mm x 25 mm piatti di coltura. Colture le cellule a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 24 h. La confluenza raggiungerà l'80-90% dopo 24 h.</li>
	<li>Giorno 1: Fare 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, e 1.5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Fare 2 M CaCl2 e conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Per ogni piatto di coltura da 150 mm x 25 mm, preparare una miscela di precipitazione del DNA in un tubo di coltura sterile da 50 mL. Aggiungete in primo luogo 1.620 luna di 2x HBS, 9,5 g di PMD2G (VSVG), 17,5 g di pCMVR8,74 (Capsid), 27 g di plasmide LentiP-ALDH (un vettore lentivirale che trasporta sia CYP27B1 che ALDH1a2). In secondo luogo, aggiungere H2O ad un volume finale di 3.037,5 l.</li>
	<li>Nell'ultimo, aggiungere 202,5 luna di 2 M CaCl2 dropwise mescolando la soluzione alle concentrazioni finali di 1x HBS e 125 mM CaCl2. CaCl2 deve essere l'ultimo ad essere aggiunto. Lasciare le miscele di trasfezione a temperatura ambiente per 20 min con miscelazione occasionale. Per più piatti di coltura da 150 mm x 25 mm, aumentare di conseguenza.</li>
	<li>Aggiungete il 3.240 l di miscela di precipitazione del DNA a un piatto di coltura da 150 mm x 25 mm contenente le cellule da 293T. Ruotare delicatamente il piatto di coltura da un lato all'altro aggiungendo la miscela di precipitazione del DNA. Incubare il piatto a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 24 h.</li>
	<li>Giorno 2: Rimuovere la soluzione di trasfezione di fosfato di calcio, lavare delicatamente con 1x PBS e alimentare nuovamente la coltura cellulare con il mezzo di coltura cellulare CM-4-D. Incubare le cellule a 37 e 5% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Giorno 3: Raccogliere i supernatanti in bottiglie sterili e conservare a 4-8 gradi centigradi. Ricostituire la coltura cellulare con un nuovo mezzo di coltura cellulare CM-4-D. Colture le cellule a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2 per altri 24 h.</li>
	<li>Giorno 4: Raccogliere i supernatanti in bottiglie di stoccaggio sterili. Filtrare i supernatanti dal Giorno 3 e dal Giorno 4 attraverso un filtro 0,45 m. Per concentrare il virus pseudotipo VSVG, trasferire i supernatanti in tubi di centrifuga e girare a 4.780 x g per 24 h a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Giorno 5: Versare i supernatanti dai pellet (il pellet è spesso visibile) e lasciare che i tubi si scarichino su un tovagliolo di carta in un armadio sterile di biosicurezza per diversi minuti.</li>
	<li>Risospendere i pellet con il pipeting con PBS sterile contenente il 5% di glicerolo. Il volume per la sospensione sarà di 33,3 ìl per 150 mm x 25 mm piatto di coltura.</li>
	<li>Aliquota 200 l/tubo e conservare a -80 gradi centigradi. Fare un'aliquota separata di 50 gradi/fiala a scopo di titolazione. I titori devono essere compresi nell'intervallo di 108–109 unità trasduttrici (TUs)/mL.</li>
	<li>Aggiungere la candeggina nei piatti della cultura e scartarli. NOTA: Queste cellule trasfetate sono la più grande preoccupazione per la sicurezza nel protocollo poiché tutti gli elementi lentivirali sono espressi nelle cellule.</li>
</ol>2. Generazione di controller di dominio derivati del midollo osseo (BMDC)
<ol><li>Raccogliere tibie e feor da 4-5 topi di balsamo/c in un tubo di polipropilene sterile da 50 mL contenente il mezzo di coltura6.</li>
	<li>Trasferire il tibi e i femori in un piatto di coltura da 100 mm x 20 mm contenente il mezzo di coltura. Rimuovere tessuti come i muscoli dai tibi e femori utilizzando forbici sezionanti e pinze.</li>
	<li>Tagliare entrambe le estremità del tibi e femori per esporre la cavità del midollo osseo.</li>
	<li>Disegnare 10 mL di coltura in una siringa da 10 mL attaccata ad un ago da 30 G.</li>
	<li>Inserire con attenzione l'ago nella cavità del midollo osseo e scovare il midollo osseo in un tubo di polipropilene sterile sterile da 50 mL pulito. Ripetere questa procedura se necessario, per assicurarsi che il midollo osseo sia stato completamente svuotato.</li>
	<li>Pellet le cellule del midollo osseo per centrifugazione (400 x g)a 2–8 gradi centigradi per 5 min. Aspirate il supernatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet con 5 mL di 1x tampone di lisi di globuli rossi.</li>
	<li>Incubare le cellule a temperatura ambiente per 4-5 min con scosse occasionali.</li>
	<li>Interrompere la reazione aggiungendo 30 mL di mezzo di coltura.</li>
	<li>Pellet le cellule per centrifugazione (400 x g) a 2–8 s per 5 min. Risogli nuovamente le cellule in 10 mL di CM-10-R mezzo di coltura cellulare. Se necessario, le cellule possono essere passate attraverso un colino cellulare di 40 m per rimuovere i detriti.</li>
	<li>Eseguire un numero di celle e regolare le celle a 1 x 106 celle/mL utilizzando il supporto di coltura delle celle CM-10-R.</li>
	<li>Aggiungere il fattore di stimolazione della colonia murine ricombinante/macrofago (GM-CSF, concentrazione finale 100 U/mL) e murino interleucolo-4 (IL-4, concentrazione finale - 10 U/mL). NOTA: le soluzioni stock di GM-CSF e IL-4 sono conservate rispettivamente a -80 gradi centigradi a -80.000 U/mL (1.000x) e 10.000 U/mL (1.000x).</li>
	<li>Distribuisci le cellule in 6 piastre di coltura ben a 4 mL/pozzo e colture le cellule a 37 e 5% CO2 per 48 h.</li>
	<li>Rimuovere le cellule non aderenti con pipettaggio delicato.</li>
	<li>Aggiungere un nuovo mezzo di coltura cellulare CM-10-R contenente i valori GM-CSF (100 U/mL) e IL-4 (10 U/mL). Coltura le cellule per altri 48 h.</li>
	<li>Raccogliere cellule non aderenti (BMC) per la trasduzione da parte del virus lenti-CYP-ALDH.</li>
</ol>3. Trasduzione di controller di dominio con il virus lenticchio-CYP-ALDH per generare cellule DC-CYP-ALDH
<ol><li>Preparare 1 x 106 dC/pozzo in un volume totale di 0,5 mL di CM-10-R misura di coltura cellulare contenente 50 -L di virus e 8 g/mL di protamina in una piastra di coltura a 6 pozze.</li>
	<li>Colture le cellule a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Sostituire il mezzo con un nuovo mezzo di coltura cellulare CM-10-R e le cellule a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per altri 24 h. A questo punto, è possibile valutare le attività ezymatiche di 1-idrossilasi e RALDH2 (vedere il passaggio 4). Se necessario, ripetere i passaggi da 3.1 a 3.3 per una seconda trasduzione.</li>
	<li>Aggiungere il lipopolissaccharide (100 ng/mL) e la coltura delle cellule per 24 h.</li>
	<li>Raccogliere le cellule (cellule DC-CYP-ALDH) per esperimenti.</li>
</ol>4. Valutazione dell'iperespresso 1-idrossistio e RALDH2 nelle cellule DC-CYP-ALDH
<ol><li>Valutazione dell'iperstima dell'iperstima nelle cellule DC-CYP-ALDH<ol>
<li>Seme 1.0 x 106 celle DC-CYP-ALDH /bene in 2 mL di CM-10-R cellulare coltura medio in 12 piastre di coltura bene.</li>
		<li>Aggiungere 25(OH)D alla concentrazione finale di 2,5 m. Incubare le cellule DC-CYP-ALDH per 24 ore.</li>
		<li>Raccogliere i supernatanti e conservarli a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Saggio per 1,25(OH)2D concentrazioni nei supernatanti utilizzando un radioimmunoassay disponibile in commercio (RIA) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Determinare l'espressione di 1-idrossilasi nelle cellule DC-CYP-ALDH mediante lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) utilizzando un anticorpo anti-CYP27B1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valutazione della RALDH2 sovraespressa nelle cellule DC-CYP-ALDH NOTA: L'espressione e l'attività del RALDH2 sovraespresso sono determinate utilizzando un kit di rilevamento di dishydrogenasi di aldeide commerciale (ALDH) (vedi Tabella dei materiali).<ol>
<li>Seme 1 mL di DC-CYP-ALDH o celle di controllo (1 x 105 celle / mL nel buffer di asino) in ciascuno dei due tubi da 5 mL (uno etichettato come "Controllo" e l'altro etichettato come "Test").</li>
		<li>Aggiungere 10 -L di soluzione di ethylaminobenzaldedeide (DEAB) (1,5 mM in 95% di etanolo) a ciascuno dei tubi di controllo e mescolare immediatamente. DEAB è un inibitore RALDH2.</li>
		<li>Aggiungere 5 oL del substrato di fluorescenza RALDH attivato (300 m) alle prove di controllo e di prova e mescolare immediatamente.</li>
		<li>Incubare i tubi per 45 min.</li>
		<li>Pellet le cellule per centrifugazione a 400 x g a 2–8 gradi centigradi per 5 min. Aspirate i supernatanti.</li>
		<li>Ricostituire le cellule in 200 - L di assaggio tampone.</li>
		<li>Tenere le cellule sul ghiaccio e procedere per l'analisi da parte del FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers%2C+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li>
<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

I dottori Xiaolei Tang e David J. Baylink sono inventori di un brevetto in attesa relativo a questo studio.

In questo articolo viene descritto l'uso di cellule DC-CYP-ALDH, per aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici. I nostri dati hanno dimostrato che le cellule DC-CYP-ALDH possono sintetizzare localmente alte concentrazioni de novo sia di 1,25 (OH)2D e RA in vitro in presenza di substrati corrispondenti (cioè, 25[OH]D e retinolo, rispettivamente). Poiché sufficienti concentrazioni ematiche di 25(OH)D e retinolo possono essere facilmente raggiunte attraverso i supplementi...

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epitelialemucosale 1,2. Per questo motivo, attualmente disponibili farmaci approvati U.S. Food and Drug Administration (FDA) inibiscono le funzioni dei mediatori infiammatori o bloccano l'homing delle cellule immunitarie nell'intestino. Tuttavia, i mediatori infiammatori e le cellule immunitarie che sono mirati sono necessari anche per le difese immunitarie. Di conseguenza, gli inibitori del mediatore infiammatorio compromettono la difesa immunitaria sistemica e i bloccanti dell'homing delle cellule immunitarie indeboliscono la difesa immunitaria intestinale, entrambe le quali possono portare a gravi conseguenze3,4. Inoltre, gli bloccanti delle cellule immunitarie possono anche bloccare l'homing delle cellule T (Treg) regolatorie nell'intestino e quindi possono peggiorare la tolleranza immunitaria intestinale già compromessa nei pazienti affetti da IBD. Inoltre, il blocco delle cellule di Treg homing nell'intestino può anche portare alla soppressione immunitaria sistemica a causa dell'accumulo di cellule Treg nel sangue5. Infine, gli inibitori e i bloccanti funzionano in modo transitorio e, di conseguenza, richiedono amministrazioni frequenti. La frequente somministrazione di questi inibitori e bloccanti può esacerbare ulteriormente gli effetti collaterali spiacevoli.
Recentemente, abbiamo proposto una nuova strategia che può potenzialmente mitigare o addirittura eliminare gli effetti collaterali associati ai farmaci attuali per il trattamento Con IBD6. Questa strategia aumenta l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6. La logica di questa strategia è che le cellule Treg gut-homing specificamente casa per l'intestino e quindi non compromettere le difese immunitarie sistemiche. Inoltre, poiché le cellule Treg possono potenzialmente formare memoria7,8, cellule Treg gut-homing possono potenzialmente fornire un controllo stabile dell'infiammazione cronica dell'intestino nei pazienti Con IBD e, quindi, il trattamento non dovrebbe essere somministrato con la stessa frequenza. Inoltre, poiché questa strategia aumenta l'induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo, non ha la preoccupazione di instabilità in vivo in un ambiente altamente proinfiammatorio che è associato con il trasferimento adottivo di cellule Treg generate in vitro9,10. A questo proposito, le cellule Treg generate in vitro sono una delle strategie proposte per il trattamento delle malattie autoimmuni11,12,13 e rigetto del trapianto14,15. Infine, in questa strategia, le cellule dendritiche (DC) sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo: vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA perché 1,25(OH)2D possono indurre l'espressione di molecole regolatorie (ad esempio, forchetta box P3 [foxp3] e interleutra-10 [IL-10])16,17 e che l'AR può stimolare l'espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T18. Poiché sia 1,25(OH)2D che RA possono anche tollerare i controller di dominio28,29, ragioniamo che i controller di dominio ingegnerizzati saranno mantenuti stabilmente in uno stato tolerogenico in vivo e quindi eludere le preoccupazioni inpresentisti che sono associate con DC tolerogeni generati in vitro (TolDC)19,20,21. A questo proposito, i TolDC sono anche una delle strategie proposte per l'aumento in vivo delle funzioni cellulari Treg19,20,21. Per sostenere il nostro ragionamento, abbiamo dimostrato che i CONTROLLER di dominio ingegnerizzati, al momento della consegna in vivo, possono aumentare l'induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6.
Un ulteriore vantaggio della nostra strategia proposta è che 1,25(OH)2D ha anche altre funzioni che possono potenzialmente beneficiare i pazienti con IBD. Queste altre funzioni includono la capacità di 1,25(OH)2D per stimolare la secrezione di antimicrobici22 e per sopprimere la carcinogenesi23. Infezioni e tumori sono spesso associati con IBD24,25.
Per generare i CONTROLLER di dominio in grado di produrre concentrazioni locali elevate sia di 1,25(OH)2D che di RA de novo, utilizziamo un vettore lentivirale per progettare dc per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 (CYP27B1) che codifica 25-idrossivitamina D 1-idrossilasi (1-idrossislasi), che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L'altro gene è l'aldeide dehydrogenasi 1 membro della famiglia A2 (ALDH1a2) che codifica retinaldeide dehydrogenasi 2 (RALDH2), che catalizza fisiologicamente la sintesi di RA6.
Poiché l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule Treg gut-homing è potenzialmente importante nel trattamento dell'IBD, nel seguente protocollo ildettagliamo le procedure per la generazione dei DC inesprimibili 1-idrossilasi-RALDH2 (cellule DC-CYP-ALDH) che può essere utilizzato per la futura indagine sulle cellule Treg gut-homing in vivo.

<table><tbody><tr><td>Siringhe da 10 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura da 100 mm x 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura a 12 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td># 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture da 150 mm x 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-idrossicolecalciferolo (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Kit ALDEFLUOR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D terreno</td><td></td><td></td> di coltura cellulare <td>DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 0,055 mM di 2-mercaptoetanolo (2-ME), 1 mM di piruvato di sodio, 0,1 mM di aminoacido non essenziale e 2 mM di L-glutammina.</td></tr><tr>Terreno <td></td><td></td> di <td>coltura cellulare CM-10-R</td><td>Terreno RPMI 1640 (senza glutammina) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 0,055 mM di 2-mercaptoetanolo (2-ME), 1 mM di piruvato di sodio, 0,1 mM di aminoacido non essenziale e 2 mM di L-glutammina.</td></tr><tr>Terreno <td></td><td></td> di <td>coltura cellulare CM-4-D</td><td>Terreno DMEM contenente il 4% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 0,055 mM di 2-mercaptoetanolo (2-ME), 1 mM di piruvato di sodio, 0,1 mM di aminoacido non essenziale e 2 mM di L-glutammina.</td></tr><tr><td>Filtri sottovuoto per flaconi Corning, 0,22 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Filtri sottovuoto per flaconi Corning, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>Forbice da dissezione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td> <td>fetale bovinoThermoFisher Scientific Cat</td><td># 16000044</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ACK tampone di lisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat# 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>I</td><td>CYP27B1 di topo da 1,6 kb su misura e il cDNA ALDH1a2 sono stati amplificati mediante PCR utilizzando rispettivamente un plasmide contenente il cDNA CYP27B1 e un plasmide contenente il cDNA ALDH1a2 (GeneCopoeia). Il frammento di cDNA CYP27B1 amplificato con una sequenza di ingresso ribosomiale KOZAK 5' è stato clonato nel vettore lentivirale pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE (Addgene). Il costrutto risultante è stato designato come lenti-CYP-GFP. Il frammento di cDNA ALDH1a2 amplificato è stato clonato nel lenti-CYP-GFP per sostituire il GFP ed è stato designato come lenti-CYP-ALDH. Questo plasmide bicistronico esprime CYP27B1 controllato dal promotore SFFV e ALDH1a2 controllato dal promotore PGK.</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3755</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>Aghi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 22036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td>#15140148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bilanciata di fossato ( PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td>#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 12259</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polipropilene, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td># AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polipropilene, 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Protamina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P3369</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio controllo dell'isotipo IgG policlonale</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>Dosaggio radioimmunologico per la misurazione 1,25(OH)2D</td><td>Heartland Assays</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, no glutammina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td># 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per celle sterili, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific Cat</td><td># 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi sterili per la conservazione, 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo augmentazione dell'induzione delle cellule t regolatorie gut-homing

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epiteliale mucosale. Recentemente dimostriamo che le cellule T (Treg) regolatorie gut-homing sono una terapia promettente per l'IBD. Di conseguenza, questo articolo presenta un protocollo per l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule Treg gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo, vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA sulla base di risultati precedenti che mostrano che 1,25(OH)2D possono indurre l'espressione di molecole regolatorie (ad esempio, box forcella P3 e interleucina-10) e che l'AR può stimolare l'espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T. Per generare tali cellule dendritiche ingegnerizzate, utilizziamo un vettore lentivirale per traduciare le cellule dendritiche per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 che codifica 25-idrossivitamina D 1,idrossilasi, che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L'altro gene è la dehydrogenasi di aldeide 1 membro della famiglia A2 che codifica la retinaldedeide dehydrogenasi 2, che catalizza fisiologicamente la sintesi dell'AR. Questo protocollo può essere utilizzato per future indagini sulle cellule Treg gut-homing in vivo.

Le cellule DC-CYP-ALDH hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1 -idrossisciosi. Per determinare se le cellule DC-CYP-ALDH generate da BMDC hanno espresso una quantità significativamente aumentata di 1- idrossiderosi, i BMCC sono stati transdotti con il virus lenticchie-CYP-ALDH per produrre cellule DC-CYP-ALDH derivate dal midollo osseo (cellule BMDC-CYP-ALDH). Successivamente, le cellule BMDC-CYP-ALDH sono state esaminate per l'espressione di 1 -idrossilasi da parte della FACS. I no...

Qui presentiamo un protocollo per l'aumento in vivo dell'induzione delle cellule T regolatorie gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre localmente alte concentrazioni della vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e la vitamina attiva A (acido retinoico o RA) de novo.

In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Questo protocollo descrive una strategia terapeutica potenzialmente nuova che può essere prontamente modificata per applicazioni umane. Questa tecnica migliora direttamente l'induzione delle cellule T regolatorie intestinali nei tessuti linfoidi periferici e può essere implementata stabilmente anche in ambienti altamente pro-infiammatori. Queste tecniche possono anche essere utilizzate per studiare il ruolo della vitamina D attiva e della vitamina A all'interno del sistema immunitario periferico.Questa dimostrazione visiva fornirà istruzioni dettagliate per la generazione di cellule dendritiche ingegnerizzate di alta qualità che sono fondamentali per il successo di questa tecnica. Inizia seminando una volta 10 alle sette cellule 293T in 20 millilitri di mezzo di coltura cellulare CM-10-D in piastre di coltura di 150 per 25 millimetri per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aggiungere 1,62 millilitri di soluzione di HBS concentrata appena preparata, 9,5 microgrammi di plasmide dell'involucro, 17,5 microgrammi di plasmide da imballaggio e 27 microgrammi del plasmide LENTI-CYP-ALDH in un tubo conico da 50 millilitri.Portare il

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In questo protocollo, viene descritto un modello di colite di trasferimento adottivo delle cellule T antigene-antigene specifico per l'intestino. Le cellule T CD4+ sono isolate da topi transgenici CBir1 TCR. Questi sono specifici per un antigene del microbiota intestinale immunodominante CBir1 flagellina, che viene trasferito nei topi Rag1-/- riceventi, portando all'infiammazione intestinale.

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Impara a indurre cellule T regolatorie gut-homing in vivo mediante cellule dendritiche ingegnerizzate. Questo metodo immunoterapeutico è efficace anche in ambienti fortemente pro-infiammatori.

In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing

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