Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse
14 gennaio 2020
Vi presentiamo un protocollo per l'estrazione di murini periciti cerebrali. Basato su un'estrazione pericito orientata all'arricchimento senza antibiotici, questo protocollo è uno strumento prezioso per gli studi in vitro che forniscono un'elevata purezza e un'alta resa, diminuendo così il numero di animali sperimentali utilizzati.
Recentemente, il ruolo dei periciti cerebrali è diventato evidente nei disturbi neurologici e nella funzione cerebrale. Pertanto, lo sviluppo di un metodo di coltura affidabile per queste cellule è imperativo. Il nostro protocollo per l'estrazione di periciti cerebrali murini rappresenta uno strumento affidabile per gli studi in vitro e per fornire ai periciti un'elevata purezza e resa cellulare.
A dimostrare la procedura con Anupriya Mehra sarà Lucie Dehouck, una tecnico del mio laboratorio. Inizia posizionando il cervello da uno specifico topo C57BL/6 maschio privo di agenti patogeni da quattro a sei settimane su una pulitura sterile e priva di pelucchi asciutti e usando forcep di punta curva per rimuovere il cervelletto, lo striato e i nervi occipitali. Usa un batuffolo di cotone per rimuovere tutte le meningi visibili e capovolgere il tessuto cerebrale.
Aprire i lobi con leggeri tratti verso l'esterno e rimuovere tutti i vasi sanguigni visibili. Quindi posizionare il tessuto cerebrale privo di meningi in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente 15 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.To omogeneizzare il tessuto, trasferire il campione cerebrale in un tubo di malta della smerigliatrice di tessuto Dounce e aggiungere tre o quattro millilitri di tampone di lavaggio B al tubo. Utilizzare un pestello sciolto per tritare il tessuto 55 volte, quindi sciacquare il pestello con tampone di lavaggio B e tritare il liquame tissutale con un pestello stretto 25 volte.
Al termine dell'omogeneizzazione, aliquotare allo stesso modo il liquame tra due tubi da 50 millilitri e aggiungere 1,5 volte il volume di albumina di siero bovino freddo al 30%. Quindi scuotere vigorosamente i tubi per mescolare il liquame. Per isolare la frazione vascolare, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti in due nuovi tubi.
Conservare il pellet nel tampone di lavaggio B sul ghiaccio. Resuspend i pellet in tre millilitri di tampone di lavaggio freddo B sul ghiaccio. Centrifuga i supernatanti raccolti e ripeti questo passo ancora una volta.
Scartare i supernaganti e rimescolare i pellet in tre millilitri di tampone di lavaggio B.Quindi mettere in comune i pellet rimescolati e portare il volume finale della sospensione della cella raggruppata a 10 millilitri con tampone di lavaggio fresco a freddo B.Dissociare ulteriormente le celle con una pipetta di 10 millimetri sei volte fino a quando non sono visibili ciuffi rimanenti di pellet e utilizzare un gruppo filtro sottovuoto e un colino in rete di nylon per filtrare la sospensione cellulare. Posizionare il colino in una piastra di Petri e sgombare la rete con tampone di lavaggio fresco B e raschiare per recuperare eventuali capillari. Quindi eseguire una seconda filtrazione con un filtro fresco.
Dividere il filtrato equamente tra due tubi e raccogliere le cellule per centrifugazione. Dopo aver scartato i supernatanti, mettere in comune i pellet in un unico tubo contenente tampone di lavaggio prebellimato B con enzimi e aggiungere collagenasi/dispasi prebellita al tubo. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua del tavolo tremante per 33 minuti precisamente a 37 gradi Celsius prima di interrompere la reazione con 30 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e scartare con cura il supernatante.
Resostigliere rapidamente ma con cura il pellet nel tampone di lavaggio B sei volte e centrifugare nuovamente la sospensione. Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 18 millilitri di mezzo DMEM completo e semina due millilitri di sospensione cellulare in DMEM completo in nove pozzi di tre piastre a sei pozzi rivestite di Matrigel. Posizionare le colture cellulari in un incubatore sterile di anidride carbonica di 37 gradi Celsius 5% per 24 ore prima di rimuovere accuratamente i detriti da ogni pozzo e aggiungere nuovi supporti DMEM.
Dopo 48 ore, cambiare il mezzo in ogni pozzo ogni 48 ore. Il giorno da otto a 10 quando le cellule raggiungono la confluenza del 100%, passaggiamo le cellule in mezzo di coltura pericita su nuove piastre di gelatina rivestite con sei pozzi e restituiranno le cellule all'incubatore di coltura cellulare per altri sei-sette giorni con monitoraggio. Quindi dividere di nuovo le cellule il giorno 17 in mezzo pericito in nuove piastre rivestite di gelatina.
Dal passaggio zero al passaggio due, ci sono specifiche caratteristiche morfologiche con cui si possono identificare le cellule endoteliali e il conseguente graduale aumento dei periciti. In una coltura di passaggio zero, le cellule endoteliali allungate che si sviluppano da microvessel sono in abbondanza. Questa abbondanza si riduce dopo il passaggio uno e assente dopo il passaggio due.
Al contrario, i periciti appaiono come rare cellule quadrilatere nelle prime culture e diventano abbondanti con il passaggio due. La valutazione dell'espressione di NG2, CD146 e PDGFR beta può essere utilizzata per valutare la purezza della coltura di periciti mediante PCR quantitativa, immunocitochimica e macchia occidentale. La digestione enzimatica è un passo fondamentale per il successo del protocollo.
Assicurati di monitorare rigorosamente le concentrazioni enzimatiche e il tempo di incubazione.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo affidabile per l'estrazione di periciti cerebrali murini, essenziali per comprendere il loro ruolo nei disturbi neurologici e nella funzione cerebrale. Il metodo sottolinea un approccio di arricchimento privo di antibiotici che consente di ottenere un'elevata purezza e un alto numero di cellule, riducendo al minimo il numero di animali sperimentali necessari.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Periciti cerebrali
- Disturbi neurologici
- Studi cellulari in vitro
Sfondo
- L'importanza dei periciti cerebrali per la salute cerebrale
- Necessità di metodi affidabili di coltura cellulare
- Sfide nei protocolli di estrazione esistenti
Metodi Utilizzati
- Estrazione cellulare senza antibiotici
- Modello murino (topo C57BL/6)
- Centrifugazione, digestione enzimatica e coltura cellulare
Risultati principali
- Elevata purezza e vitalità dei periciti isolati
- Chiara differenziazione morfologica tra periciti e cellule endoteliali
- Valutazione della purezza della coltura cellulare mediante marcatori NG2, CD146 e PDGFR beta
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'isolamento e la coltura di periciti cerebrali murini
- Questo studio migliora la comprensione della funzione dei periciti in contesti neurologici
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento affidabile dei periciti cerebrali con elevata purezza e resa è fondamentale per promuovere la validazione dei bersagli neurovascolari e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. Questo protocollo consente una modellizzazione in vitro scalabile della funzione e della patologia della barriera ematoencefalica, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nelle ricerche neurologiche precoci. L'estrazione ad alta resa riduce l'uso di animali, in linea con le priorità etiche e operative nella ricerca e sviluppo del settore biofarmaceutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi di vie specifiche dei periciti coinvolte nei disturbi neurovascolari.
- Supporta la validazione funzionale delle target fornendo colture pure di periciti per studi meccanicistici.
- Facilita la previsione e l'affidabilità nella selezione delle target del sistema nervoso centrale e nella riduzione del rischio associato alle ipotesi biologiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce colture standardizzate di periciti ad alto rendimento per saggi in vitro riproducibili.
- Consente la valutazione quantitativa dell'espressione dei marcatori dei periciti per la validazione dei saggi.
- Permette la preparazione scalabile di sistemi cellulari pertinenti alle malattie per lo screening di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli in vitro dei periciti agli studi traslazionali sui biomarcatori nella ricerca neurovascolare.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica dei meccanismi della barriera ematoencefalica.
- Riduce il rischio biologico in fase avanzata migliorando la fedeltà del modello e il suo valore predittivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo ad alto rendimento di isolamento dei periciti si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo di modelli preclinici per programmi legati al sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione dei periciti e sull'integrità neurovascolare.
- Screening: Fornisce colture riproducibili di periciti validate mediante marcatori per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa dell'espressione di NG2, PDGFR-β e CD146 per la valutazione della purezza della coltura.
- Ricerca traslazionale: Offre una piattaforma per allineare i risultati ottenuti in vitro con studi biomolecolari in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo scalabile e standardizzato adattabile tra diversi gruppi di ricerca neurovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione di target neurovascolari.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro per la coltura dei periciti.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale nello sviluppo del portafoglio CNS.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi dei target e modelli neurovascolari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione del cervello murino e nelle tecniche di coltura cellulare.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per centrifugazione, filtrazione e analisi dei marcatori molecolari.
- Richiede un rigoroso rispetto del protocollo per la digestione enzimatica e i tempi, al fine di garantire resa e purezza cellulare.
- La standardizzazione tra i gruppi di lavoro è essenziale per la riproducibilità e la confrontabilità tra studi.
- L'adattamento ad altre specie o modelli di malattia potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
