Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico

Questo metodo consente di chiarire l'ecologia su microscala e il comportamento dei microrganismi che navigano in gradienti chimici dinamici e di scoprire i loro trade-off nascosti, la cinetica dei nutrienti e le dinamiche della popolazione in microambientati ecologicamente rilevanti. Combinando la tecnologia microfluidica con la fotolisi, generiamo impulsi chimici controllati, dove il chemioattrattante localizzato diventa improvvisamente disponibile su microscala, per misurare la risposta chemiotattica delle popolazioni microbiche esposte per la prima volta a gradienti chimici instabili. Progettare il canale utilizzando il software CAD e stamparlo su una pellicola trasparente per creare la maschera fotografica.

Fabbrica il maestro con una litografia morbida in una stanza pulita, secondo il manoscritto. Preparare una miscela PDMS combinando l'elastomero con il suo agente polimerizzante con un rapporto 10 a uno in un bicchiere da 40 millilitri. Con un coltello di plastica, mescolare vigorosamente fino a quando il liquido non è omogeneo.

Degasa immediatamente la miscela PDMS in una camera a vuoto per 45 minuti a temperatura ambiente. Per accelerare il processo, rilasciare periodicamente il vuoto per far scoppiare le bolle che si formano sull'interfaccia. Rimuovere la polvere dalla superficie del master con un detergente pressurizzato.

Quindi versare la miscela PDMS degassata sul master e cuocerla in forno a 80 gradi Celsius per due ore. Tagliare il PDMS con una lama intorno alle microstrutture a una distanza di circa cinque millimetri, quindi sbucciare con cura il PDMS dal master. Fori di punzonatura per fungere da ingresso e uscita del microcanale.

Sigillare il microcanale con nastro adesivo per evitare l'accumulo di polvere. Progetta la forma 3D utilizzando il software di progettazione 3D e stampa il master per lo stampo PDMS con una stampante 3D ad alta risoluzione. Dopo aver preparato e degassato la miscela PDMS come fatto in precedenza, pulire la superficie del master tamponando con nastro adesivo.

Metti il maestro su una bilancia. Quindi, evitando la regione centrale del master, versare 23,4 grammi di miscela PDMS non curata per ottenere l'altezza desiderata di PDMS abbinando l'altezza del master a 0,5 millimetri. Rimuovere eventuali bolle rimanenti con l'aiuto di aria compressa.

Posizionare il PDMS gettato sul master in un forno a 45 gradi Celsius per cuocere per almeno 12 ore. Quindi, staccare delicatamente lo strato PDMS indurito e punzonare i fori di ingresso e uscita per l'iniezione della sospensione batterica. Attivare sia la superficie di una piastra di Petri che lo stampo PDMS con plasma di ossigeno per due minuti.

Legare lo stampo PDMS sulla piastra di Petri premendo delicatamente lo stampo alla piastra di Petri. Evitare di premere dove si trovano le feature. Posizionare la piastra di Petri incollata allo stampo 3D PDMS in un forno a 45 gradi Celsius per almeno 12 ore per rafforzare il legame chimico.

Successivamente, attivare la membrana in policarbonato nanoporous in una camera al plasma di ossigeno per un minuto a temperatura ambiente. Sotto una cappa chimica, diluire una soluzione commerciale di 3-amminopropiltrietossisilano in acqua deionizzata all'1% in volume utilizzando un tubo di polipropilene. Trasferire la soluzione diluita di 3-amminopropiltrietossisilano in una piastra di Petri e immergere la membrana attivata nella soluzione di 3-amminopropiltrietossisilano per 20 minuti.

Quindi, rimuovere la membrana dalla soluzione di 3-amminopropiltrietossisilano con una pinzetta e posizionarla su una pulizia della stanza per asciugare. Per la fabbricazione dei canali microfluidici PDMS che si trovano sulla membrana e consentono il lavaggio dell'arena batterica, ripetere la fabbricazione del dispositivo microfluidico per il singolo esperimento di impulso chimico come fatto in precedenza. Per legare i canali di lavaggio PDMS alla membrana funzionalizzata, attivare prima sia il canale di lavaggio PDMS che la membrana in policarbonato con una camera al plasma di ossigeno per due minuti.

Subito dopo il trattamento al plasma, mettere a contatto la membrana funzionalizzata e il canale di lavaggio PDMS premendo delicatamente il canale di lavaggio PDMS sulla membrana. È importante premere delicatamente insieme il PDMS e la membrana, oppure la membrana potrebbe essere irreversibilmente incollata al soffitto del microcanale PDMS di altezza di 200 micrometri. Quindi, attivare sia la membrana in policarbonato del canale di lavaggio PDMS in laminato incollato che lo stampo PDMS 3D precedentemente legato alla piastra di Petri posizionandoli in una camera al plasma di ossigeno per due minuti.

Incastro la membrana tra due strati PDMS e premi insieme. Posizionare la piastra di Petri incollata alla struttura del sandwich in un forno a 45 gradi Celsius per almeno 12 ore per rafforzare il legame chimico. Per iniziare, mantenere la camera millifluidica sotto vuoto per 20 minuti.

Quindi, posizionare la piastra di Petri contenente la camera millifluidica su uno stadio di microscopio. Con una pipetta, riempire la camera sotto la membrana con la sospensione batterica diluita della soluzione di GFP-fluorescente Vibrio ordalii in una soluzione di glutammato 4-metossi-7-nitroindolinil-gabbia-L-glutammato in acqua di mare artificiale. Dopo aver riempito il canale con le sospensioni batteriche, succhiare la soluzione in eccesso con un tovagliolo di carta e sigillare l'ingresso e l'uscita con spine PDMS premendoli delicatamente nei fori.

Riempire una siringa con una soluzione artificiale di acqua di mare di un millimolare 4-metossi-7-nitroindolinil-gabbia-L-glutammato e attaccare i tubi all'ingresso e all'uscita del canale di lavaggio sopra la membrana. Collegare il tubo a un serbatoio di rifiuti e assicurarsi che il tubo sia interamente immerso nel serbatoio dei rifiuti fluidi per evitare oscillazioni di pressione. Impostare la portata sulla pompa della siringa su 50 microlitri al minuto.

Avviare la pompa della siringa per stabilire il flusso nel canale di lavaggio sopra la membrana. Avviare il software che controlla il fascio LED e lo stadio del microscopio e generare sequenze di impulsi definite dall'utente in luoghi diversi e con intensità diverse. Registra video usando un obiettivo 4x a intervalli di tempo regolari per un periodo di diverse ore e su più posizioni contigue per coprire una superficie di grandi dimensioni.

In questo studio, i dispositivi microfluidici e millifluidici sono stati utilizzati per studiare la risposta chemiotattica batterica e i profili di accumulo in condizioni nutritive dinamiche. Le proiezioni di intensità massima mostrano la posizione batterica, indicata da tracce bianche, su un intervallo di 0,5 secondi immediatamente dopo il rilascio dell'impulso e 40 secondi dopo il rilascio dell'impulso. Le traiettorie batteriche sono state mostrate anche in nero 60 secondi dopo il rilascio dell'impulso.

La regione ombreggiata rappresenta l'impulso chimico rilasciato dalla fotolisi al tempo zero secondo nel mezzo del campo visivo, che successivamente si diffuse. La concentrazione batterica, così come la dinamica temporale della velocità di deriva radiale a seguito di un rilascio di impulsi al centro del campo visivo sono mostrati qui. I valori negativi della velocità di deriva corrispondono al moto chemiotattico diretto verso il centro dell'impulso.

Le statistiche sul nuoto sono presentate qui per una popolazione batterica in assenza di gradienti chimici. Le traiettorie rappresentano le proiezioni bidimensionali del moto batterico tridimensionale nel microcanale. La distribuzione di probabilità della velocità di nuoto batterica misurata era adatta a una distribuzione gamma.

Dalle traiettorie batteriche, è stata estratta la distribuzione di probabilità del tempo tra riorientamenti successivi. Il modello di riorientamento, la distribuzione della velocità di nuoto e le statistiche di riorientamento degli organismi sono stati usati per informare un singolo modello basato. Questo metodo è stato testato sui batteri marini Vibrio ordalii che eseguono chemiotassi verso l'amminoacido glutammato, ma la metodologia proposta è ampiamente applicabile a diverse combinazioni di specie e chemioattratti, nonché a processi biologici oltre la chemiotassi, come la dinamica della popolazione e della comunità in condizioni spazialmente eterogenee e dinamiche.

Le tecniche classiche in ecologia microbica e microbiologia, come le crescita delle colture batch o dei chemostati, hanno ampiamente ignorato le caratteristiche spazio-temporali degli habitat microbici. La creazione quasi istantanea di impulsi chimici su microscala mediante fotolisi mira a riprodurre il tipo di impulsi nutritivi che i batteri marini incontrano in natura da una serie di fonti, ad esempio la diffusione diffusiva di pennacchi dietro particelle organiche che affondano o la diffusione di nutrienti da cellule fitoplancton lysed. La soluzione di amminosilano è acutamente tossica e deve essere maneggiata con estrema cura.

Lavoriamo esclusivamente sotto il cofano dei fumi e indossiamo dispositivi di protezione come camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti. Ci prendiamo cura anche dei rifiuti che abbiamo generato.