Name: Un modello di inoculazione ritardata dellinfezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Scopri un modello di inoculazione ritardata per infezioni croniche da Pseudomonas aeruginosa in ferite cutanee di topi immunocompetenti. Questo metodo permette di studiare la patogenesi batterica senza soppressione immunitaria.

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Il vettore di costruzione luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 è stato un dono gracile di J. Hardy. Gli schemi sono stati creati con BioRender.com. Ringraziamo il laboratorio di G. Gurtner per i loro consigli sul modello di infezione da ferita. Ringraziamo anche T. Doyle dello Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging per la sua esperienza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R21AI13370, R21AI13340, R01AI12492093, e le sovvenzioni di Stanford SPARK, il Falk Medical Research Trust e la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) a P.L.B. C.R.D è stata supportata da T32AI0007502. Una Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering e una Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship hanno supportato J.M.S.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.
1. Preparazione e crescita dei batteri
<ol><li>Condurre tutto il lavoro con P. aeruginosa e gli animali con precauzioni BSL-2 in base al comitato istituzionale per la biosicurezza del ricercatore e alle linee guida del comitato per l'uso degli animali. Eseguire tutti i passaggi qui descritti che coinvolgono P. aeruginosa, compresa l'inoculazione del topo, in un mobile di biosicurezza.</li>
	<li>Il ceppo luminescente PAO1:lux di P. aeruginosa è disponibile dal nostro laboratorio su richiesta. Streak PAO1, conservato come brodo di glicerolo congelato, su agar di Lysogeny Broth (LB). Per il ceppo luminescente PAO1:lux, l'agar LB deve contenere antibiotici selettivi (100 carbenicillin/mL e 12,5 g/mL di kanamycin). Coltivare a 37 gradi centigradi in un'incubatrice batterica.</li>
	<li>Scegli una colonia isolata e coltiva durante la notte a 37 ml in mezzo 3 ml LB, pH 7.4. Per i ceppi luminescenti, il brodo deve contenere 100 g/mL di carbenicillina. Crescere in condizioni aerobiche tremanti.</li>
</ol>2. Preparazione della procedura
<ol><li>Chiedi a tutto il personale che esegue un intervento chirurgico di indossare un abito pulito / cappotto Lab, maschera per il viso, rete per capelli e guanti.</li>
	<li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, tra cui forbici e pinze. Utilizzare la tecnica asettica per sterilizzare gli strumenti tra gli animali.</li>
	<li>Pulire la tavola chirurgica con etanolo e preparare un campo chirurgico pulito.</li>
</ol>3. Rimozione dei capelli
<ol><li>Anestesizza i topi C57BL/6J di 8-12 settimane utilizzando l'1%-3% dell'isoflurane. Gli investigatori devono seguire le linee guida del personale veterinario della loro istituzione per l'anestesia quando utilizzano l'isoflurane.<ol>
<li>Iniziare l'anestesia erogare l'1-3% di isoflurane e regolare la portata dell'ossigeno a 1,5 L/min. Posizionare il mouse nella camera di induzione.</li>
		<li>Pizzica la punta del mouse per valutare la profondità dell'anestesia. Quando il mouse non risponde più alla stimolazione, rimuoverlo dalla camera di induzione e posizionarlo sul banco chirurgico con il naso nel cono naso isoflurane.</li>
		<li>Applicare il lubrificante oculare su entrambi gli occhi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesare il mouse per ottenere un peso pre-procedura linea di base.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione prona. Iniettare il topo sottocutaneamente con cloruro sterile preriscaldato dello 0,9% di sodio, 250 l ad ogni fianco per un totale di 500 l.</li>
	<li>Rasare l'area dorsale del mouse utilizzando un rasoio elettrico. La rasatura deve avvenire in una posizione diversa rispetto alla stazione chirurgica per prevenire la contaminazione dei capelli della ferita.</li>
	<li>Applicare un sottile strato di lozione per la depilazione. Lascia che la lozione si sieda per 20-60 s. Rimuovere i capelli e la lozione in eccesso con una garza inumidita in acqua tiepida. Dopo la depilazione, procedere alla procedura di ferita eccisionale.</li>
</ol>4. Chirurgia della ferita escissione a tutto spessore
<ol><li>Iniettare buprenorfine sostenuta 0,6–1 mg/kg sottocutaneamente utilizzando un ago da 25 G nella zona centrale dorsale del mouse. La buprenorfine a lento rilascio fornisce sollievo dal dolore oltre 48-72 h.</li>
	<li>Disinfettare il sito chirurgico. Pulire la superficie dorsale con uno sterile tampone betadine. Pulire betadine in eccesso con un tampone di alcool sterile. Questo dovrebbe essere eseguito 3 volte (alternando tra betadine e alcol), swabbing muovendosi dal centro in modo circolare al bordo. Lasciare asciugare all'aria l'area.</li>
	<li>Creare un drappo che circonda il sito chirurgico utilizzando garza sterile o involucro di plastica.</li>
	<li>Allungare la pelle tesa caudally. Utilizzare un punzone sterile di biopsia cutanea di 6 mm di diametro per fare un'incisione iniziale attraverso l'epidermide dorsale sinistra. Ripetere sull'epidermide dorsale destra.</li>
	<li>Utilizzare pinze per tendare la pelle dal centro dell'area della ferita delineata a sinistra. Accise gli strati epidermici e dermici con le forbici. Ripetere sulla zona della ferita delineata a destra per creare ferite escisionali simmetriche.</li>
	<li>Lavare le ferite con 50 litri di salina sterile. Lasciare asciugare il sito chirurgico e la pelle circostante. Quindi, coprire le ferite e il dorsum con una medicazione trasparente.</li>
	<li>Riposizionare il mouse in una gabbia pulita. Casa 1 animale per gabbia.</li>
	<li>Posizionare la gabbia su una piastra di riscaldamento e monitorare fino a quando il mouse si sveglia.</li>
	<li>Quando si esegue l'intervento chirurgico di cui sopra su più animali, utilizzare uno sterilizzatore di perline caldo per pulire tutti gli strumenti chirurgici tra gli animali.</li>
	<li>Lasciare 24 h per i topi per recuperare dalla procedura chirurgica e per la formazione di una matrice provvisoria della ferita sulle ferite prima di procedere all'inoculazione con i batteri.</li>
</ol>5. Inoculazione con P. aeruginosa
<ol><li>Diluire la coltura di pPA1:lux durante la notte a OD600 x 0,05 in 75 mL di supporti LB contenenti 100 carbenicilline g/mL e far crescere i batteri fino a quando la coltura è in fase esponenziale precoce (OD600 x 0,3). Questo dovrebbe richiedere circa 2-3 h.</li>
	<li>Diluire PAO1:lux in PBS ad una concentrazione di (7,5 x 2,5) x 102 CFU/mL. Assicurarsi di preparare l'eccesso di inoculum per garantire un volume sufficiente e per consentire la placcatura dopo l'esperimento. Se si trasporta tra le strutture (cioè dal laboratorio al vivaio), utilizzare il doppio contenimento in una scatola di prova delle perdite chiaramente contrassegnata come Biohazard.</li>
	<li>Eseguire tutti i lavori con P. aeruginosa e topi utilizzando dispositivi di protezione personale approvati in un armadio di sicurezza biologico approvato Animal Biosafety Level 2 (ABSL-2). Le attrezzature riutilizzabili come la bilancia di pesatura devono essere coperte con impacchi agguati per evitare contaminazioni.</li>
	<li>Anestesizza recidiva utilizzando il 3% dell'isoflurane come descritto sopra. Pesare il mouse e registrare il peso. Iniettare il topo sottocutaneamente con cloruro sterile preriscaldato dello 0,9% di sodio, 250 l ad ogni fianco per un totale di 500 l.</li>
	<li>Se la medicazione trasparente del mouse si è staccata durante la notte, rimuovere con attenzione la crosta risultante e indossare una nuova medicazione.</li>
	<li>Utilizzare una siringa per cocchieri di sicurezza da 500 l 27 G per iniettare 40 gradi di sospensione PAO1:lux attraverso la medicazione trasparente della pellicola in ogni ferita. Per evitare la contaminazione incrociata dal lato contralaterale, devono essere utilizzati topi diversi.</li>
	<li>Posizionare nuovamente il mouse nella sua gabbia su una piastra di riscaldamento e monitorare fino a quando non si sveglia. Tutti i topi devono essere alloggiati singolarmente in gabbie separate per evitare contaminazioni incrociate.</li>
	<li>Fornire pasta integratore nutrizionale ad alto contenuto calorico inserita tra pellet alimentari sul pavimento della gabbia.</li>
	<li>Utilizzare l'inoculum rimanente per strisciare una piastra di agar LB. Conta le colonie per confermare il numero di batteri somministrati.</li>
</ol>6. Immagini in vivo di ferite infette
<ol><li>Seguire i protocolli di contenimento BSL-2 per il trasporto di topi da e verso lo strumento di imaging, incluso l'uso di un contenitore secondario. Fare attenzione a non trasferire o rilasciare alcuna biancheria da letto animale durante il trasferimento del mouse alla camera di induzione o strumento di imaging.</li>
	<li>Indurre l'anestesia del topo con isoflurane inalato 1-3% in una camera di induzione come descritto al punto 3.1.</li>
	<li>Una volta che il mouse è anetizzato, posizionarlo in posizione prona nella camera di imaging di un sistema di imaging ottico con il naso nel cono naso isoflurane.</li>
	<li>Aprire il programma software.</li>
	<li>I parametri di acquisizione variano in base al numero di animali immagine simultaneamente e all'intensità della bioluminescenza. I parametri di base da impostare includono il tempo di esposizione, la binning, il f/stop e il campo visivo (FOV). Le impostazioni di avvio predefinite sono il tempo di esposizione di 30 secondi, il binning basso (2), f/stop 1.2 e FOV 25. Regolare queste impostazioni in base alle esigenze del ricercatore.</li>
	<li>Analizzare i dati di luminescenza utilizzando un programma di imaging (vedere Tabella dei materiali). La luminescenza sarà rappresentata come un'immagine pseudocolore sovrapposta a una fotografia a colori dei topi.<ol>
<li>Creare una regione di interesse (ROI) nel sito della ferita e misurare il flusso medio (fotoni/secondo) rilevato. Si noti che i dati possono anche essere segnalati come radianza (fotoni/secondo/cm2/steradian), ma finché la distanza della piattaforma di imaging dalla fotocamera rimane costante tra l'imaging, il flusso è sufficiente.</li>
		<li>Misura lo sfondo creando un ROI in un'area casuale della piattaforma di imaging. Sottrarre il numero di sfondo di fotoni al secondo.</li>
		<li>Esportare i dati in un foglio di calcolo per un'ulteriore analisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'imaging come descritto sopra con la frequenza con cui spesso ogni giorno per monitorare la progressione dell'infezione.</li>
</ol>7. Gestione postoperatoria
<ol><li>Monitorare i topi secondo le linee guida stabilite dal protocollo IACUC del ricercatore. Monitoriamo tutti i topi ogni giorno per i primi 4 giorni, poi a giorni alterni fino alla fine dell'esperimento. Pesare i topi una volta al giorno per i primi 4 giorni post-intervento chirurgico in un BSC. Iniettare 250 L dello 0,9% di cloruro di sodio sottocutaneamente nei giorni post-infezione 1 e 2.</li>
	<li>Verificare la presenza di segni di dolore/angoscia nei topi, tra cui postura curva, cappotto trasandato, letargia, difficoltà di respirazione, smorfia facciale e perdita di peso.</li>
	<li>Se gli animali mostrano segni di deterioramento della salute, consultare un veterinario. Qualsiasi topo che sembra mostrare segni peggiori di dolore / angoscia e una perdita di peso di 20% o superiore dovrebbe essere eutanasia.</li>
</ol>8. Escissione della ferita
<ol><li>Alla fine dell'esperimento, sacrificare i topi usando l'inalazione di CO2, seguita da lussazione cervicale. Smaltire la carcassa animale secondo i protocolli ABSL-2 dell'istituzione.</li>
	<li>Ascisso letti ferita utilizzando forbici sterili e pinze in un BSC. Collocare ogni letto della ferita in PBS sterile da 1 mL in un tubo di polipropilene da 1,5 ml. Mitare il tessuto della ferita con le forbici. Tutte le ferite devono essere trattate come ASBL-2, anche se non sono considerate infette.</li>
	<li>Incubare su uno shaker a 300 giri/min per 2 h a 4 gradi centigradi. Vorticare ogni tubo per 10 s e diluire in serie gli effluenti batterici in PBS. Piastrare gli effluenti batterici diluiti su LB agar per enumerare il carico batterico.</li>
	<li>Considerare le ferite infettate se il segnale luminescente nella ferita è superiore alla luminescenza di fondo e più batteri vengono rilevati nell'effluente della ferita rispetto alle ferite inocuizzate con PBS come controllo.</li>
</ol>

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<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da divulgare.

Abbiamo sviluppato un nuovo modello di infezione della ferita P. aeruginosa ritardata. La strategia di ritardare l'inoculazione con i batteri fino a 24 h dopo il ferimento eccisionale consente la valutazione delle infezioni della ferita in un lasso di tempo di 1 settimana. Utilizzando un ceppo luminescente di P. aeruginosa, è possibile monitorare la progressione dell'infezione durante il corso di infezione. Il più lungo decorso dell'infezione rispetto ad altri modelli di infezione da P. aeruginosa</...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un batterio a forma di asta Gram-negative con crescente rilevanza per la salute umana e la malattia. È responsabile di un'estesa morbilità e mortalità in contesti nosocomiali, in particolare per quanto riguarda le infezioni delle ferite nei pazienti immunocompromessi1,2. L'emergere di ceppi multifarmacoresistenti di questo agente patogeno ha fornito ulteriore impulso per l'indagine sui fattori che contribuiscono alla virulenza Di P. aeruginosa, i meccanismi della resistenza agli antibiotici P. aeruginosa e nuovi metodi per la prevenzione e il trattamento di questa infezione mortale3. Di conseguenza, la necessità di modelli animali di infezione da ferite croniche come strumenti per studiare queste domande di ricerca non è mai stata maggiore.
Purtroppo, molti modelli animali di infezione da P. aeruginosa tendono a simulare l'infezione acuta con rapida risoluzione dell'infezione o il rapido declino a causa della sepsi4,5, che non simula adeguatamente la natura spesso cronica di queste infezioni. Per risolvere questo inconveniente, alcuni modelli utilizzano l'impianto di corpi estranei come perline di agar, impianti in silicone o gel alnati6,7,8. Altri modelli utilizzano topi immunocompromessi a causa dell'età avanzata, dell'obesità o del diabete, o attraverso mezzi farmacologici come la neutropenia indotta da ciclofosofe9,10,11,12. Tuttavia, l'uso di materiali estranei o di ospiti compromessi immunitari probabilmente altera il processo infiammatorio locale, rendendo difficile comprendere la fisiopatologia coinvolta nelle infezioni croniche delle ferite negli ospiti con sistemi immunitari altrimenti normali.
Abbiamo sviluppato un modello cronico di infezione da ferita da P. aeruginosa nei topi che comporta un'inoculazione ritardata con batteri dopo la ferita escisazionale. L'inoculazione ritardata consente esperimenti che valutano il carico batterico che si estende ad almeno 7 giorni. Questo modello apre nuove opportunità per studiare sia la patogenesi che i nuovi trattamenti delle infezioni croniche di P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 ago sterile</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 ago sterile</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Tampone imbevuto di alcol</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging Aura</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J topi maschi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia monouso, 6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini - Carburo di tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a secco per perle di vetro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>BioReagenti Agar Fisher granulato</td><td></td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina con ago da 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X Sistema di imaging</td><td>Spectral Instruments Spectral Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Leur-Lok da 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Animal Trimmer</td><td>Wahl Lozione</td> depilatoria professionale <td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair con olio per bambini</td><td>Church e Dwight</td><td>n/a</td><td>Disponibile in qualsiasi farmacia</td></tr><tr><td>Pinze ottagonali</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola trasparente per pressare e sigillare</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per insulina SafetyGlide con ago da 30 G</td><td>Siringa per</td> insulina BD <td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td> Integratore alimentare supplicale <td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Henry</td><td>Schein Animal Health</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di pseudomonas aeruginosa wound

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è un grave agente patogeno nosocomial e crescente rilevanza per la salute umana e le malattie, in particolare nell'impostazione di infezioni croniche delle ferite nei pazienti diabetici e ricoverati in ospedale. Vi è un'urgente necessità di modelli di infezione cronica per aiutare nello studio della patogenesi delle ferite e nello sviluppo di nuove terapie contro questo agente patogeno. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza l'inoculazione ritardata 24 ore dopo la ferita escissionale a tutto spessore. L'infezione della matrice provvisoria della ferita presente in questo momento previene la rapida staccazione o la diffusione dell'infezione e stabilisce invece un'infezione cronica della durata di 7-10 giorni senza la necessità di impiantare materiali estranei o di soppressione immunitaria. Questo protocollo imita un tipico decorso temporale di infezione post-operatoria negli esseri umani. L'uso di un ceppo luminescente di P. aeruginosa (PAO1:lux) consente una valutazione giornaliera quantitativa del carico batterico per le infezioni da ferite da P. aeruginosa. Questo nuovo modello può essere uno strumento utile nello studio della patogenesi batterica e nello sviluppo di nuove terapie per le infezioni croniche della ferita P. aeruginosa.

Utilizzando un ceppo luminescente di PAO1 con un plasmide che codifica il luxABCDE reporter system (PAO1:lux), abbiamo eseguito la ferita eccisionale sui topi, inoculato queste ferite con planctonico P. aeruginosa 24 h più tardi, e onere batterico nel tempo(Figura 1 e Figura 2). Un'immagine rappresentativa ottenuta utilizzando un sistema ottico di imaging dimostra che questo modello produce luminescenza rilevabile (<stro...

Descriviamo un protocollo di inoculazione ritardata per generare infezioni croniche delle ferite nei topi immunocompetenti.

Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Questo protocollo è significativo perché descrive un modello per l'infezione cronica della ferita pseudomonas aeruginosa senza la necessità di impianto di materiale estraneo o soppressione immunitaria. L'inoculazione ritardata con Pseudomonas aeruginosa 24 ore dopo il mento escizionale a pieno spessore protalls la rapida clearance e diffusione dei batteri, stabilendo un'infezione che dura da sette a 10 giorni. Questo modello unico sarà uno strumento utile per le indagini sulla patogenesi batterica, sulle interazioni patogene ospiti e sullo sviluppo di nuove terapie per le infezioni croniche della ferita da Pseudomonas aeruginosa.Ad assistermi in una dimostrazione della procedura sarà Dan Liu, uno studente di medicina del Laboratorio Bollyky. Prima di iniziare la procedura, pesare un mouse anestetizzato di otto-12 settimane per ottenere un peso di base e posizionare il mouse nella posizione prona. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, iniettare per via sottocutanea il mouse con 250 microlitri di cloruro di sodio sterile pre-riscaldato allo 0,9% su ciascun fianco.Utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i capelli dalla zona dorsale del mouse e applicare un sottile strato di crema depilatoria sulla pelle esposta. Dopo 20-60 secondi, rimuovere i capelli e la lozione in eccesso con garza inumidita in acqua tiepida. Per la chirurgia della ferita escizionale a pieno spessore, utilizzare prima un ago calibro 25 per iniettare per via sottocutanea da 0,6 a un milligrammi per chilogrammo di buprenorfina a rilascio prolungato nella zona medio-dorsale del mouse e pulire il sito chirurgico in modo circolare con tre betadine sterili alternative e tamponi di alcol.Posizionare un drap di plastica avvolgente sul sito chirurgico e allungare la pelle tesa caudally. Quando la pelle si è asciugata, utilizzare un pugno sterile per la biopsia cutanea di sei millimetri di diametro per fare un'incisione iniziale attraverso l'epidermide dorsale sinistra, seguita da una seconda incisione sull'epidermide dorsale destra. Usa le forcep per tendere la pelle dal centro dell'area della ferita delineata a sinistra e usa le forbici per asportare gli strati epidermico e dermico.Dopo aver ripetuto l'incisione sulla zona della ferita delineata a destra per creare ferite esciciionali simmetriche, lavare entrambe le ferite con 50 microlitri di soluzione salina sterile. Quando il sito chirurgico e la pelle circostante si sono asciugati, coprire le ferite e il dorsum con una medicazione trasparente del film e posizionare il mouse in una gabbia pulita su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a piena rimo clemenza. 24 ore dopo l'intervento, pesare nuovamente il topo riaestetizzato e iniettare l'animale per via sottocutanea con 250 microlitri di cloruro di sodio sterile preri riscaldato allo 0,9% su entrambi i fianchi.Successivamente, caricare 100 microlitri della sospensione del ceppo luminescente P.aeruginosa in una siringa a cappuccio di sicurezza tubercorina da 500 microlitri dotata di un ago calibro 27 e iniettare 40 microlitri di sospensione batterica attraverso la medicazione trasparente del film in ogni ferita. Assicurarsi che la sospensione batterica sia ben miscelata e che la medicazione trasparente sia intatta. Assicurarsi di forare la medicazione trasparente una sola volta con il lato della lunetta dell'ago verso l'alto.Quindi riportare il mouse nella sua gabbia su una pagina di riscaldamento con monitoraggio e fornire pasta di integratori alimentari ipercalorici sandwich tra pellet alimentari sul pavimento della gabbia. Placcare l'inoculo rimanente su una piastra di agar LB e contare le colonie per confermare il numero di batteri che sono stati somministrati. Per l'imaging in vivo delle ferite infette, seguire il livello di biosicurezza due protocolli di contenimento per il trasporto dei topi da e verso lo strumento di imaging e posizionare il topo anestetizzato nella posizione prona all'interno della camera di imaging.Nel software di imaging, impostare il tempo di esposizione, il binning, l'f-stop e il campo visivo in base alle esigenze dell'esperimento. Successivamente, creare una regione di interesse nel sito della ferita e misurare il flusso medio rilevato nei fotoni al secondo. Per misurare lo sfondo, creare un'area di interesse su un'area casuale sulla piattaforma di imaging e sottrarre il numero di sfondo dei fotoni al secondo.Alla fine dell'esperimento, in un armadietto di sicurezza bio, utilizzare forbici sterili e forcep per asportare i letti avvolti e posizionare ogni letto in un millilitro di PBS sterile in un tubo di polipropilene da 1,5 millilitri. Tritare il tessuto della ferita con le forbici e incubare i pezzi di tessuto su uno shaker a quattro gradi Celsius in 300 rotazioni al minuto per due ore. Al termine dell'incubazione, vortice per ogni tubo per 10 secondi prima di diluire serialmente l'effluente batterico in PBS e placcare l'effluente batterico diluito sull'agar LB per quantificare il carico batterico.Questa immagine rappresentativa ottenuta utilizzando un sistema ottico di imaging dimostra che questo modello si traduce in luminescenza rilevabile. In questo esperimento, l'infezione raggiunse il picco al terzo giorno dopo l'inoculazione e persistette sette giorni dopo l'inoculazione basata sia sulla bioluminescenza che sul conteggio delle colonie. La coltura dei batteri isolati dalla ferita dimostra inoltre che le unità quantificate di formazione della colonia per ferita sono correlate alla luminescenza rilevata.Sebbene ci sia una rapida perdita di peso iniziale immediatamente dopo l'iniezione, le iniezioni saline e la nutrizione supplementare possono riportare i topi al loro peso iniziale. La dose calcolata di inoculazione di cui il 50% delle ferite sarà sostanzialmente infettata è stata determinata in circa 7,7 volte 10 alla seconda colonia formando unità per millilitro. Dosi superiori a uno per 10 alla quarta colonia che forma unità per millilitro si traducono in un tasso di infezione del 100%.Vari trattamenti topici e sistemici possono essere applicati dopo le procedure di mento e inoculazione per indagare nuove potenziali terapie per Pseudomonas aeruginosa. Tutto il lavoro con Pseudomonas aeruginosa e topi infetti deve essere condotto con precauzioni di sicurezza BSL-2 in conformità con le linee guida istituzionali del comitato per la biosicurezza e l'uso degli animali del ricercatore.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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