Deprivazione visiva monoculare e misurazione della plasticità della dominanza oculare nella Corteccia visiva primaria del mouse
8 febbraio 2020
Qui, presentiamo protocolli dettagliati per la deprivazione visiva monoculare e l'analisi della plasticità della dominanza oculare, che sono metodi importanti per studiare i meccanismi neurali della plasticità visiva durante il periodo critico e gli effetti di geni specifici su sviluppo visivo.
La privazione visiva monoculare è un eccellente protocollo sperimentale per indurre la plasticità della risposta corticale visiva primaria. Normalmente, i neuroni nel segmento binoculare della corteccia visiva primaria nel topo rispondono circa il doppio della stimolazione dell'occhio contralaterale rispetto all'occhio ipsilaterale. Tuttavia, suturando chiuso l'occhio contralaterale durante il periodo critico per la plasticità dominanza oculare si traducono nella rapida perdita di reattività da parte dei neuroni V1 alla stimolazione oculare contralaterale e anche seguita da un successivo aumento della risposta all'occhio ipsilaterale.
Qui, introduciamo il protocollo sperimentale per la deprivazione monoculare e suggeriamo un metodo comunemente usato per analizzare la tendenza nella dominanza oculare durante la privazione visiva. Metti gli strumenti chirurgici in una scatola di alluminio e autoclavati sotto i 120 gradi centigradi per mezz'ora. Preparare la soluzione di agarosio al 2% nel bollitore per il bagno d'acqua e mantenerla a 75 gradi centigradi.
Applicare un sottile strato di unguento per gli occhi su entrambi gli occhi. Al microscopio anatomico con illuminazione, suturare le palpebre. Fai circa quattro punti.
Creare da due a tre nodi del thread. Applicare tre microlitri di colla ad asciugatura istantanea 502 sulla testa del nodo per aumentare la stabilità del nodo. Quindi tagliare il filo abbastanza corto.
Quando il topo è completamente sveglio, posizionalo in una gabbia di attesa separata. Prima della registrazione elettrofisiologia, utilizzare l'isoflurane per anestetizzare il mouse. Rimuovere i punti ed esporre il bulbo oculare.
Tagliare con cura la palpebra. Lava gli occhi con soluzioni di lenti a contatto e controlla gli occhi per chiarezza. È possibile utilizzare solo il mouse con buone condizioni dei bulbi oculari.
Dopo aver anestetizzato il mouse, posizionare il mouse su una cornice stereotassica. Utilizzare una pastiglia riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante tutta la procedura. Applicare l'unguento per gli occhi sulla superficie degli occhi per mantenerlo umido.
Rimuovere i capelli del mouse per esporre la sua pelle. Incidere un otto millimetri moltiplicato per otto millimetri di area della pelle tra entrambe le orecchie per esporre il cranio e rimuovere il tessuto del cuoio capelluto. Quindi rimuovere il tessuto connettivo sovrascriente con perossido di idrogeno.
Praticare un buco nel cranio sopra il cervelletto. Fissare una piccola vite ossea nel foro come riferimento. Eseguire una piccola craniotomia di un millimetro di diametro nella regione binoculare V1.
Rimuovere con cura il frammento di cranio senza ferire il cervello. Coprire la superficie corticale esposta con il 2%di agarosio per evitare l'essiccazione. Fissare un elettrodo di tungsteno sul telaio stereotassico.
Posizionare l'elettrodo di tungsteno verticalmente sulla regione V1 binoculare per assicurarsi che le cellule registrate reagiscano a entrambi gli occhi. Lo stimolo è separato di 30 gradi in un blocco casuale. In ogni misurazione sono stati presentati da tre a cinque blocchi.
Maschera un occhio con una piastra di plastica non trasparente. Presenta LCD1 da posizionare in 23 centimetri dagli occhi del mouse. Far avanzare lentamente il microelettrodo dal micromanipolatore idraulico dell'olio.
Interrompere l'avanzamento segnale ad alto rapporto di rumore del segnale quando l'elettrodo è avanzato allo strato quattro e iniziare la misurazione. Amplificamo le attività di spike a un fattore 1.000 e lo filtriamo da 300 a 10 kilohertz e poi lo assaggiamo a 40 kilohertz. Quindi mascherare l'altro occhio e misurare la risposta dell'occhio contralaterale.
I segnali misurati da singoli elettrodi sono attività della popolazione. Utilizzare il software per separare picchi di celle diverse. Per prima cosa, filtra il segnale da 500 a 5.000 hertz.
Impostare due cursori, uno per la deflessione positiva e uno per i picchi di deflessione negativi. Configurare i modelli di picco. Impostare l'area dei modelli in cui viene visualizzata la variazione maggiore tra le diverse classi di picchi.
Utilizzare l'analisi dei componenti principali per separarli in cluster. Classificare i picchi di un limite usando l'algoritmo K means. Correlare l'orientamento con la velocità di fuoco a picco e tracciare le curve di regolazione dell'orientamento per gli occhi ipsilateri e contralaterali.
Quindi calcolare l'indice OD per le singole celle che rappresenta la risposta contralaterale e ipsilaterale Assegnare un punteggio OD per ogni cella in base all'indice OD. Calcolare l'indice di distorsione contralaterale in base alla formula. Questo diagramma mostra le curve di regolazione dell'orientamento dell'occhio ipsilaterale e contralaterale nel topo monocolare privato e non privato.
Questo protocollo consente di avere successo nella privazione visiva monoculare e nella misurazione della dominanza oculare da un topo privato e non privato in un periodo critico. Vi abbiamo appena mostrato come realizzare questo esperimento e abbiamo analizzato il cambiamento del dominio oculare durante la privazione visiva. Durante l'esperimento, è importante evitare l'infezione nel processo di sutura e l'interazione durante la registrazione elettrofisiologia.
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Panoramica
In questo articolo vengono presentati protocolli dettagliati per la deprivazione visiva monoculare e l'analisi della plasticità della dominanza oculare, fondamentali per lo studio dei meccanismi neurali alla base della plasticità visiva durante il periodo critico. Vengono inoltre discussi gli effetti di geni specifici sullo sviluppo visivo.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Plasticità visiva
- Dominanza oculare
Sfondo
- La privazione visiva monoculare induce una plasticità della risposta nella corteccia visiva primaria.
- Le risposte normali nella corteccia visiva primaria favoriscono l'occhio controlaterale.
- La sutura dell'occhio controlaterale durante il periodo critico porta a una modificata responsività.
- Questo studio introduce protocolli per l'analisi delle tendenze di dominanza oculare durante la privazione visiva.
Scopo dello studio
- Presentare protocolli per la privazione visiva monoculare.
- Analizzare la plasticità della dominanza oculare.
- Esplorare gli effetti della privazione visiva sulle risposte neurali.
Metodi Utilizzati
- Protocollo chirurgico per la privazione monoculare.
- Analisi della risposta neuronale in V1.
- Preparazione degli strumenti chirurgici e della soluzione di agarosio.
- Configurazione sperimentale per la stimolazione visiva.
Risultati principali
- Perdita della risposta alla stimolazione dell'occhio controlaterale.
- Aumento della risposta alla stimolazione dell'occhio ipsilaterale.
- Dimostrazione della plasticità della dominanza oculare.
- Convalida dei protocolli sperimentali per studi futuri.
Conclusioni
- La deprivazione visiva monoculare è efficace per lo studio della plasticità visiva.
- I protocolli possono essere utilizzati per indagare l'influenza genetica sullo sviluppo visivo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi neurali del trattamento visivo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La deprivazione visiva monoculare con misurazione quantitativa della dominanza oculare fornisce una piattaforma solida per analizzare la plasticità dei circuiti neurali e la funzione genica durante le finestre critiche di sviluppo. Questo approccio consente una validazione affidabile delle proteine bersaglio e una riduzione del rischio meccanicistico nei percorsi di ricerca neurosviluppativa. I suoi risultati riproducibili supportano una continuità traslazionale dalla scoperta iniziale fino alla valutazione del modello preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Consente una valutazione diretta degli effetti specifici per gene sulla plasticità neuronale in vivo.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio quantificando i cambiamenti nella plasticità della dominanza oculare.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico per i bersagli neurosviluppali.
- Fornisce un'elevata affidabilità predittiva per lo sviluppo di interventi che modulano i geni.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative validate (indice di bias controlaterale, curve di sintonizzazione all'orientamento) per lo screening successivo.
- Standardizza la misurazione della reattività neuronale tra diversi gruppi sperimentali.
- Consente confronti riproducibili di manipolazioni genetiche o farmacologiche.
- Permette la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma in modelli di topo transgenico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli di plasticità circuitale neurale rilevanti per la malattia.
- Garantisce continuità dallo studio della funzione genica nella fase di scoperta alla validazione preclinica.
- Guida l'avanzamento dei candidati terapeutici per lo sviluppo neurologico, adeguato al rischio.
- Permette l'identificazione di biomarcatori traducibili associati alla plasticità corticale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso di ricerca che va dalla scoperta alla fase preclinica nel campo dello sviluppo neurologico e del sistema visivo, sostenendo sia la validazione del bersaglio che l'identificazione di composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Quantifica l'adattamento dei circuiti neurali e gli effetti specifici dei geni sulla plasticità.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per il confronto tra diverse condizioni.
- Analisi dati: Fornisce curve di sintonizzazione dell'orientamento, punteggi di dominanza oculare e indici di asimmetria controlaterale per analisi statistiche solide.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a modelli preclinici di disturbi visivi e neurali.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per valutare diverse interazioni genetiche e farmacologiche in vivo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla plasticità neuronale.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni in vivo standardizzate, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go e una selezione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio degli obiettivi e degli interventi nel campo dello sviluppo neurologico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in elettrofisiologia in vivo e procedure chirurgiche.
- Richiede l'accesso a stereotassici, microelettrodi e sistemi di acquisizione di segnali ad alta frequenza.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione intergruppo dei protocolli chirurgici e analitici.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- La progettazione dello studio acuto limita la valutazione longitudinale della plasticità all'interno dello stesso animale.
Domande frequenti di Biofarmaceutica
Chapters in this video
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Introduction
0:59
Monocular Deprivation at Postnatal Day 28 in Mice
3:21
Craniotomy in the Mouse V1 Binocular Region after Monocular Deprivation on the 4th Day
5:25
Visual Stimulation and Electrophysiological Recording
6:19
Off-line Spike Sorting and Data Analysis
7:44
Results
8:12
Conclusion
