Name: Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Impara la termoforesi su microscala etichettata per misurare le costanti di dissociazione delle interazioni proteina-lipidi usando Vam7 e acido fosfatidico. Questo metodo rapido e riproducibile supporta lo sviluppo farmaceutico iniziale.

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Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione della National Science Foundation (MCB 1818310) alla RAF. Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Chemical Biology Core Facility/Protein Crystallography Unit presso l'H. Lee Moffitt Cancer Center (NIH/NCI: P30-CA076292).

1. Preparazione dei materiali
<ol><li>Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7,41.</li>
	<li>Preparare il colorante NTA-Atto 647 N. Diluire il colorante NTA-Atto 647 N a 100 nM da una soluzione DMSO al 100% in PBS senza Tween.</li>
	<li>Esprimere Vam7-His8 – Proteina come proteina di fusione in E. coli e purificare utilizzando Ni-NTA e cromatografia di esclusione dimensionale8.</li>
	<li>Titolare l'analita nel buffer PBS. Se l'analita si trova in un tampone diverso, l'MST etichettato non è particolarmente sensibile alle differenze tampone minori rispetto a molecole come il DMSO, a meno che il contenuto del tampone analitico non interagisca con la proteina marcata.</li>
</ol>2. Preparazione del dispositivo MST
<ol><li>Accendere l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo.</li>
	<li>Aprire il software di controllo e assicurarsi che il laptop sia acceso e connesso sul computer collegato al dispositivo.</li>
	<li>Immettere le impostazioni di fluorescenza e MST per questo esperimento. Impostare MST Prima su 3 s, MST su 30 s e Recupero fluorescenza (Fluo.) dopo 1 s. Prima misura la fluorescenza iniziale e non richiede lunghi tempi; MST è la quantità effettiva di tempo per raggiungere l'equilibrio dopo l'induzione del calore.</li>
	<li>
Tabella dei capillari: per ogni tubo capillare, inserire il nome del bersaglio (ligando), il nome del ligando (analita), la concentrazione del bersaglio e la massima concentrazione di titolazione e utilizzare il rapporto di titolazione di riempimento automatico. Ad esempio, immettere 50 nM per la concentrazione target di Vam7-His8, Vam7-His8 per il nome del target, (acido fosfatidico 1,2-diottanoil) Di-C8 PA per il nome del ligando e la concentrazione più alta il ligando selezionando 1:1 e trascinando verso il basso fino agli slot di riempimento automatico 2-16.</li>
	<li>Eseguire una scansione cap per selezionare il LED appropriato (20% LED (preset)) in base al segnale della proteina bersaglio e regolare tra 200 e 2000 unità di fluorescenza per MST etichettato. Le scansioni del cappuccio dovrebbero mostrare picchi arrotondati uniformi a forma di campana.</li>
	<li>Selezionare un intervallo di potenze MST e immettere i valori per ciascuno per testare l'adattamento di legame più robusto e premere Start Cap Scan + Measurement, scansionando valori diversi per determinare le migliori condizioni operative per una determinata interazione in fase di test.</li>
	<li>Determinare la potenza MST con la migliore vestibilità utilizzando il software di analisi e il preset per la termoforesi con Tjump. Analizza gli adattamenti in base alla maggior parte della separazione di fluorescenza tra la concentrazione più bassa e più alta rispetto alla potenza MST con la migliore vestibilità e seleziona la potenza MST per le prove di replica.</li>
	<li>Determinare se si è verificato il fotosbiancamento tra la prima e la seconda esecuzione accedendo al software di analisi e passando l'analisi alla modalità esperto. Quindi, selezionare la fluorescenza anziché la termoforesi per l'analisi. Selezionare la modalità esperto e quindi il fotosbiancamento.</li>
</ol>3. Preparazione di campioni per MST etichettato
<ol><li>Portare la soluzione Vam7-His8 ad una concentrazione di 200 nM in PBS senza Tween.</li>
	<li>Portare il colorante NTA-Atto 647 a 100 nM in PBS senza Tween.</li>
	<li>Mescolare il colorante Vam7-His8 e NTA-Atto 647 con un rapporto volumetrico 1:1 e lasciare riposare a temperatura ambiente coperto dalla luce per 30 min. Determinare la concentrazione appropriata di proteina bersaglio come nel paragrafo 2.5 (vedere Supplemento sull'utilizzo di KD del colorante Ni-NTA come dimostrato in video).</li>
	<li>Centrifuga miscela di colorante nta-Atto 647 N e proteine per 10 minuti in una stanza buia utilizzando una centrifuga da tavolo a circa 8.161 x g.</li>
	<li>Conservare la miscela a 4 °C dopo l'esperimento o sul ghiaccio durante l'esperimento per riutilizzarla entro poche ore, se necessario, al fine di evitare che le proteine si denatrino.</li>
	<li>Utilizzare il cercatore di concentrazione NT per determinare l'intervallo di concentrazione necessario per la titolazione.</li>
	<li>Portare Di-C8 PA alla concentrazione massima appropriata in acqua.</li>
	<li>Titolare l'analita utilizzando una diluizione seriale 1:1 nel tampone PBS per 16 concentrazioni in base al passaggio precedente. A differenza di SPR, la termoforesi non è così sensibile alle differenze tampone.</li>
</ol>4. MST dei campioni
<ol><li>Accendere il dispositivo e il laptop collegato.</li>
	<li>Premere la freccia su sulla parte anteriore della macchina e far scorrere il rack capillare verso l'esterno.</li>
	<li>Caricare i capillari nel rack con la massima concentrazione in posizione 1.</li>
	<li>Nel software di controllo, selezionare il canale rosso corrispondente a NTA-Atto 647 N.</li>
	<li>Immettere le informazioni sulla concentrazione, la posizione e il nome per ciascun capillare nella Tabella dei capillari.</li>
	<li>Eseguire una scansione capillare premendo Start Cap Scan al 20% di LED (preset) e regolare in base a unità di fluorescenza tra 200 e 2000 utilizzando le impostazioni di intensità del LED o la concentrazione del ligando (proteina etichettata).</li>
	<li>Selezionare un intervallo di potenza MST.</li>
	<li>Avvia Scansione cap + Misurazione MST.</li>
	<li>Analizza utilizzando il software di analisi.</li>
</ol>5. Analisi dei dati MST
NOTA: Il software di analisi fornito da Nanotemper è proprietario e viene eseguito utilizzando M.O. Affinity Analysis. Esistono diversi modi per misurare le affinità di legame in base alla fluorescenza o alla termoforesi. Le versioni più recenti di questo software sono preimpostate per valutare automaticamente i dati utilizzando la termoforesi e sono preimpostate per utilizzare la termoforesi con Tjump sfruttando entrambe le misurazioni. In alternativa, si può selezionare Tjump da solo o Thermophoresis da solo. Inoltre, il software di analisi consente misurazioni di affinità stimate utilizzando la fluorescenza iniziale. È possibile accedere a queste impostazioni solo in modalità esperto.
<ol><li>Impostare la strategia di valutazione nel software di analisi su expert facendo clic sulla casella per il fulmine accanto a un set di dati nella schermata Selezione dati. Il software di analisi è preimpostato per l'analisi MST; tuttavia, un ricercatore può selezionare Crea nuova analisi e selezionare Analisi di fluorescenza iniziale per stimare le affinità di legame in base alla fluorescenza iniziale. La modalità Expert è disponibile anche per la fluorescenza iniziale. Nell'analisi descritta di seguito, la termoforesi e il Tjump sono stati utilizzati per determinare il KD del presentato di Vam7-His8 con il suo substrato naturale, l'acido fosfatidico lipidico.</li>
</ol>

<ol><li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Chapman, D., Hochstrasser, R., Millar, D., Youderia, nP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+without+primary+sequence+tryptophan+residues%3A+mutant+trp+repressors+with+aliphatic+substitutions+for+tryptophan+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins without primary sequence tryptophan residues: mutant trp repressors with aliphatic substitutions for tryptophan side chains.</a> Gene. 163 (1), 1-11 (1995).</li>
<li>Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Starr, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+induces+conformational+changes+in+Sec18+protomers+that+prevent+SNARE+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid induces conformational changes in Sec18 protomers that prevent SNARE priming.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3100-3116 (2019).</li>
<li>Miner, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Central+Polybasic+Region+of+the+Soluble+SNARE+%28Soluble+N-Ethylmaleimide-sensitive+Factor+Attachment+Protein+Receptor%29+Vam7+Affects+Binding+to+Phosphatidylinositol+3-Phosphate+by+the+PX+%28Phox+Homology%29+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Central Polybasic Region of the Soluble SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-sensitive Factor Attachment Protein Receptor) Vam7 Affects Binding to Phosphatidylinositol 3-Phosphate by the PX (Phox Homology) Domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (34), 17651-17663 (2016).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+phosphoinositide+partitioning+into+plasma+membrane+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Short-chain phosphoinositide partitioning into plasma membrane models.</a> Biophysical Journal. 105 (11), 2485-2494 (2013).</li>
<li>Zhao, H., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+guide+to+biochemical+approaches+for+analyzing+protein-lipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple guide to biochemical approaches for analyzing protein-lipid interactions.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (15), 2823-2830 (2012).</li>
<li>Kaufmann, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+proteins%3A+virulence+factors+of+intracellular+disease+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunitat+und+Infektion%22%5BJournal%5D)">Stress proteins: virulence factors of intracellular disease agents.</a> Immunitat und Infektion. 17 (4), 124-128 (1989).</li>
<li>le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).</li>
<li>Corradi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Diversity+in+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging Diversity in Lipid-Protein Interactions.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 5775-5848 (2019).</li>
<li>Rainard, J. M., Pandarakalam, G. C., McElroy, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Microscale+Thermophoresis+to+Characterize+Hits+from+High-Throughput+Screening%3A+A+European+Lead+Factory+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Using Microscale Thermophoresis to Characterize Hits from High-Throughput Screening: A European Lead Factory Perspective.</a> SLAS Discovery. 23 (3), 225-241 (2018).</li>
<li>Sparks, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+competitive+inhibitor+of+phosphatidic+acid+binding+by+the+AAA%2B+protein+NSF%2FSec18+blocks+the+SNARE-priming+stage+of+vacuole+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small-molecule competitive inhibitor of phosphatidic acid binding by the AAA+ protein NSF/Sec18 blocks the SNARE-priming stage of vacuole fusion.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (46), 17168-17185 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun potenziale conflitto di interessi.

La determinazione di Vam7-His8binding a DiC8-PA ha fornito un KD robusto per l'interazione data, che è un'affinità leggermente inferiore rispetto alla KD misurata di Vam7-His8 ai liposomi PA (non pubblicata). Questa differenza è molto probabilmente dovuta alla mancanza di una membrana, che generalmente si traduce in una minore affinità per le interazioni di legame lipidico specifiche della membrana e quindi dimostra il ruolo dell'impalcatura della membrana liposom...

La termoforesi su microscala è una tecnica relativamente nuova nel determinare le costanti di disassociazione (KD) e le costanti di inibizione (IC50) tra ligandi biochimicamente rilevanti. Il principale rivenditore commerciale di MST (ad esempio, NanoTemper) offre due tecnologie MST popolari: 1) MST senza etichetta che richiede un tag fluorescente e 2) termoforesi etichettata utilizzando la fluorescenza intrinseca delle proteine dipendente dal numero di residui aromatici presenti in ciascuna proteina1. Uno svantaggio della termoforesi senza etichetta è che nella maggior parte dei casi non consente la misurazione delle interazioni proteina-proteina. Tuttavia, potrebbe essere possibile progettare proteine senza aminoacidi aromatici come il triptofano per l'uso nella termoforesi senza etichette2.
MST misura il movimento delle particelle in risposta all'induzione di campi di temperatura microscopici avviati da un laser a infrarossi nelle tecnologie attualmente disponibili1. MST può essere utilizzato per misurare le interazioni proteina-proteina, le interazioni proteina-lipide, proteina-piccola molecola, esperimenti di competizione e persino interazioni tra piccole molecole purché si possa produrre una sufficiente separazione del segnale. Inoltre, MST consente la misurazione di interazioni basate su membrana-proteina incorporate in liposomi o nanodischi. La termoforesi etichettata sfrutta l'uso di tag etichettati fluorescentemente che consentono la separazione chimicamente controllabile del segnale tra ligando e analita. I valori di KD possono essere ottenuti utilizzando la termoforesi per interazioni che coinvolgono il legame proteico a basse concentrazioni nanomolari, che nella maggior parte dei casi è una concentrazione di proteine molto più bassa di quella richiesta per la calorimetria isotermica (ITC)3. Inoltre, mST non ha severi requisiti di buffering come richiesto per la risonanza plasmonica di superficie (SPR)4 e la termoforesi etichettata può anche essere utilizzata per misurare costanti di legame di proteine di interesse da soluzioni proteiche non completamente purificate5 con tag fluorescenti inseriti geneticamente6. Uno svantaggio di MST è che i parametri cinetici non possono essere ottenuti facilmente per MST come in SPR2.
Le misurazioni della termoforesi dipendono dalla differenza di temperatura locale di una soluzione. Questo calore può essere generato da un laser a infrarossi. Il dispositivo MST ha un rilevatore di fluorescenza accoppiato a un raggio infrarosso (IR) e può rilevare i cambiamenti di fluorescenza dai cambiamenti di concentrazione locali delle molecole fluorescenti nel punto in cui è mirato il laser IR. Il dispositivo MST utilizza un laser mirato IR accoppiato direttamente a un rilevatore di fluorescenza focalizzato nello stesso punto in cui il calore viene generato nella soluzione. Ciò consente un rilevamento robusto delle variazioni di temperatura corrispondenti all'esaurimento delle molecole nel punto di calore generato dal laser IR. La fluorescenza misurata generalmente diminuisce più vicino al laser IR in risposta agli aumenti di temperatura. Le differenze misurate di conseguenza possono essere dovute a molteplici fattori tra cui carica, dimensione o entropia di solvatazione. Queste differenze sono misurate come cambiamenti nella fluorescenza in risposta all'induzione del calore o al movimento delle molecole dalle parti calde a quelle più fredde del capillare.
Quando si carica un capillare con una determinata soluzione, è importante lasciare aria a entrambe le estremità del capillare e non caricare il capillare completamente pieno. Il capillare commerciale contiene circa 10 μL di soluzione. Si possono ottenere misurazioni accurate con 5 μL di soluzione purché la soluzione sia manipolata al centro del capillare, non ci siano bolle d'aria (potenzialmente degas prima del caricamento capillare), e si è attenti a caricare il rack per non spingere la soluzione dal centro del capillare, dove è mirato il laser a infrarossi. Se il laser non viene completamente a contatto con la soluzione, il risultato sarà molto probabilmente una delle tre uscite inutilizzabili per quella concentrazione: 1) rilevamento di fluorescenza nulla o bassa, 2) rilevamento di fluorescenza più elevata (potenzialmente con picco frastagliato) o 3) rilevamento di fluorescenza all'interno di altri valori da una data titolazione, ma con un picco frastagliato e non arrotondato.
Per la termoforesi marcata è ottimale avere un segnale di fluorescenza superiore a 200 e inferiore a 2000 unità di fluorescenza7. Il dispositivo MST utilizza un intervallo di intensità LED da 0 a 100, che può essere selezionato per ottenere un segnale superiore a 200 o inferiore a 2000. In alternativa, si possono utilizzare diverse concentrazioni del ligando etichettato per modificare il segnale di fluorescenza a un livello ottimale. È importante eseguire una scansione del tappo con una determinata misurazione MST come riferimento durante l'analisi dei dati, poiché una scansione del tappo scadente può spesso portare a un punto che può essere successivamente determinato come un outlier. Ogni corsa dovrebbe richiedere circa 30 minuti se si misura una singola potenza MST con una scansione del tappo. I dispositivi commerciali consentono cambiamenti nella potenza MST. Nelle versioni precedenti del software questo poteva essere impostato da 0 a 100; e nelle versioni successive si può selezionare MST basso, medio o alto. Per ottenere tracce robuste, un ricercatore potrebbe dover provare ciascuna di queste e decidere quale impostazione MST si traduce nei dati più robusti per una determinata interazione.

<table><tbody><tr><td>Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye</td><td>GE Healthcare</td> PA23031 <td>Per l'etichettatura delle proteine</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prsim</td><td>Software</td><td></td><td></td>Graphpad</tr><tr><td>Monolith NT.115 Capillari (1000 conteggi)</td><td>Capillari Nanotemper</td><td>MO-K022</td><td>per macchina MST</td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>Attrezzatura universitaria</td><td>Nanotemper</td><td></td></tr><tr><td>NTA-Atto 647 N</td><td>Sigma</td><td>2175</td><td>etichetta per i tag His</td></tr><tr><td>Fosfatidilinositolo 3-fosfato diC8 (PI(3)P diC8)</td><td>Echelon</td><td>P-3008</td><td>Lipidi per esperimenti di legame</td></tr></tbody></table>

uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

La capacità di determinare l'affinità di legame dei lipidi alle proteine è una parte essenziale della comprensione delle interazioni proteina-lipidi nel traffico di membrana, nella trasduzione del segnale e nel rimodellamento citoscheletrico. Gli strumenti classici per misurare tali interazioni includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la calorimetria isotermica a titolazione (ITC). Sebbene strumenti potenti, questi approcci hanno battute d'arresto. ITC richiede grandi quantità di proteine purificate e lipidi, che possono essere costosi e difficili da produrre. Inoltre, ITC e SPR richiedono molto tempo, il che potrebbe aumentare significativamente il costo di esecuzione di questi esperimenti. Un modo per aggirare queste restrizioni è utilizzare la tecnica relativamente nuova della termoforesi su microscala (MST). MST è veloce ed economico utilizzando piccole quantità di campione per ottenere una curva di saturazione per un determinato evento di legame. Attualmente sono disponibili due tipi di sistemi MST. Un tipo di MST richiede l'etichettatura con un fluoroforo nello spettro blu o rosso. Il secondo sistema si basa sulla fluorescenza intrinseca degli amminoacidi aromatici nella gamma UV. Entrambi i sistemi rilevano il movimento delle molecole in risposta all'induzione localizzata del calore da un laser a infrarossi. Ogni approccio ha i suoi vantaggi e svantaggi. L'MST senza etichetta può utilizzare proteine native senza tag; tuttavia, molti analiti, compresi i prodotti farmaceutici, fluoresceno nell'intervallo UV, il che può interferire con la determinazione di valori KD accurati. In confronto, l'MST etichettato consente una maggiore diversità di interazioni misurabili a coppie utilizzando sonde marcate fluorescenti attaccate a ligandi con assorbanze misurabili nell'intervallo visibile rispetto ai raggi UV, limitando il potenziale di interferenza dei segnali dagli analiti.

Si tratta di un output di esempio che utilizza l'analisi di affinità. L'MST etichettato è stato utilizzato per determinare la costante di legame del Vam7-His8 al diottanoil (DiC8) PA solubile di uno dei suoi substrati naturali9. La Figura 1 presenta le tracce termoforetiche di uno studio di titolazione 1:1 di DiC8 PA a partire da 500 μM contro 50 nM di Vam7-His8. Vengono mostrate la fluorescenza iniziale (tempo prima dell'accensione del laser a infrarossi), Tjump (tem...

La termoforesi su microscala ottiene rapidamente costanti di legame a basso costo del materiale. La termoforesi su microscala etichettata o senza etichetta è disponibile in commercio; tuttavia, la termoforesi senza etichette non è in grado di gestire la diversità delle misurazioni di interazione che possono essere eseguite utilizzando etichette fluorescenti. Forniamo un protocollo per le misure di termoforesi etichettate.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

La termoforesi su microscala etichettata ottiene costanti di dissociazione, o KD, di diverse interazioni biochimiche in modo efficiente. Questo protocollo e il video accompagnato danno l'affinità approssimativa per Vam7, l'unica proteina SNARE solubile nel lievito, all'acido fosfatidico. Questo è il modo in cui Vam7 si associa a due membrane prima di interagire con altre proteine.Questo metodo ottiene rapidamente KD per diverse interazioni biochimiche a basso costo, con alta riproducibilità e con un costo proteico minimo. Questa tecnica è adatta per lo sviluppo farmaceutico di prima fase, consentendo KD facilmente ottenibili per determinare potenziali composti di piombo. Prima di iniziare un'analisi, accendere l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo MST e aprire il software di controllo.Verificare che il computer sia collegato al dispositivo e in stato connesso e impostare MST Prima su 3 secondi, MST su 30 secondi e Ripristino fluorescenza su dopo 1 secondo. Per ogni tubo capillare, immettere il nome del ligando target, il nome dell'analita ligando, la concentrazione del bersaglio e la concentrazione di titolazione più alta utilizzando il rapporto di titolazione di riempimento automatico. Selezionare un intervallo di potenze MST e immettere i valori per ogni potenza per testare l'adattamento di rilegatura più robusto.Per preparare campioni MST etichettati, diluire una soluzione di Vam7-ottastidina a una concentrazione di 200 nanomolari e un colorante NTA-Atto 647 a una concentrazione di 100 nanomolari, entrambi in PBS. Mescolare il Vam7-ottaistidina e il colorante NTA-Atto 647 con un rapporto volumetrico 1:1 e lasciare che la miscela rimanga a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 30 minuti. Alla fine dell'incubazione, centrifugare la miscela di coloranti e proteine e conservare la soluzione a 4 gradi Celsius per un massimo di alcune ore prima dell'uso.Quindi, preparare il campione, prelevare il ligando tinto ed esporre l'analita. Per la termoforesi su microscala del campione, aprire il dispositivo e far scorrere il rack capillare verso l'esterno. Caricare i capillari campione nel rack con la massima concentrazione in posizione uno e selezionare il canale rosso nel software di controllo.Quindi, caricare il rack nello strumento. Quindi selezionare un intervallo di potenza MST e avviare la misurazione MST Cap Scan e valutare la risposta del cambio. Le tracce termoforetiche di uno studio di titolazione 1:1 di DiC8 PA a partire da 500 micromoli contro 50 nanomolari NTA-Atto 647 etichettati come dominio Vam7 sono mostrate qui.La fluorescenza iniziale, il salto temporale e la termoforesi possono essere osservati, consentendo di calcolare KD da una qualsiasi o una combinazione di queste misurazioni. Da questi risultati è possibile tracciare una curva di saturazione, ad esempio per la termoforesi con l'output del salto temporale, come illustrato nel grafico. Generalmente, i risultati MST sono determinati utilizzando la scala logaritmica, tenendo conto della concentrazione proteica per determinare l'affinità di legame selezionando il modello KD e inserendo la concentrazione proteica.Quando si esegue questo protocollo, assicurarsi che la soluzione sia al centro del capillare e che non ci siano bolle d'aria e che il capillare non abbia polvere o soluzione all'esterno del capillare. La calorimetria a titolazione isotermica o la risonanza plasmonica di superficie potrebbero essere utilizzate per convalidare il KD sperimentale ottenuto. Se esiste un potenziale legame cooperativo, ITC sarebbe il metodo logico successivo eseguito, date le risorse.Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di biologia tradizionale di incorporare tecniche di screening biofisico nella loro ricerca per determinare le relazioni di percorso. Un esempio di questa tecnica è la lisasi cellulare con la proteina bersaglio espressa endogenamente, dove il tag GFP è un nuovo modo per eseguire un tradizionale test di pull-down.

use-of-microscale-thermophoresis-to-measure-protein-lipid-interactions

Research

Ricerca

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Biochimica

Questo video dimostra la termoforesi su microscala per studiare l'interazione proteina-lipide. Il test rileva l'interazione tra le molecole quantificando il movimento termoforetico delle proteine marcate con fluorescenza in risposta a un gradiente di temperatura. La molecola fluorescente viene miscelata con diverse concentrazioni di molecole lipidiche non fluorescenti e la miscela di molecole nella soluzione viene caricata nei capillari. Un gradiente di temperatura viene applicato ai campioni...

Termoforesi su microscala per studiare le interazioni proteina-lipidi in soluzione

Questo video mostra una tecnica di microgravimetria dissipativa per studiare il legame delle proteine ai doppi strati lipidici. Piccole vescicole unilamellari vengono aggiunte per rivestire la superficie del sensore al quarzo di una microbiana. Utilizzando il legame io-dipendente dello ione calcio della proteina legante i fosfolipidi bersaglio al doppio strato, le variazioni della frequenza di oscillazione del sensore e la dissipazione dell'oscillazione vengono monitorate per determinare la...

Tecnica di microgravimetria dissipativa per studiare l'interazione a doppio strato proteina-lipidi

In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

MicroScale Thermophoresis (MST) è una tecnologia sensibile per caratterizzare le interazioni aptamero-bersaglio. Questo manoscritto descrive un protocollo MST per caratterizzare le interazioni aptamero-piccola molecola.

La mappatura del sito di legame di un Aptamero su ATP Utilizzando MicroScale termoforesi

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e purificazione di proteine che sono etichettati con isotopi stabili e successiva caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala Esperimenti di Termoforesi (MST).

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Questo documento descrive i protocolli per la preparazione dei campioni, la riduzione dei dati e l'analisi dei dati negli studi NSE (Neutron Spin Echo) delle membrane lipidiche. L'etichettatura giudiziosa dei lipidi al deuterio consente l'accesso a diverse dinamiche di membrana su scale di lunghezza e tempo mesoscopiche, su cui si verificano processi biologici vitali.

Spettroscopia eco-spin neutronica come sonda unica per la dinamica della membrana lipidica e le interazioni membrana-proteina

Questo protocollo combina la fotometria di massa con un nuovo sistema microfluidico per studiare le interazioni proteina-proteina a bassa affinità. Questo approccio si basa sulla rapida diluizione di complessi altamente concentrati in soluzione, che consente misurazioni a bassa affinità e amplia l'applicabilità della fotometria di massa.

Analisi della formazione di complessi proteici a concentrazioni micromolari mediante accoppiamento di microfluidica con fotometria di massa

Impara la termoforesi su microscala etichettata per misurare le costanti di dissociazione delle interazioni proteina-lipidi usando Vam7 e acido fosfatidico. Questo metodo rapido e riproducibile supporta lo sviluppo farmaceutico iniziale.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

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