Test di emocompatibilità degli impianti che si contattono con il sangue in un modello di flusso a ciclo continuo che imita il flusso sanguigno umano

Questo protocollo presenta un modello per l'indagine sull'emocompatibilità dei dispositivi di contatto con il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Standard Internazionale. Il modello è ideale per imitare le condizioni fisiologiche che corrispondono all'impianto poiché lo sfondo basso per eventi trombotici e la bassa concentrazione di anticoagulanti consentono un'ampia analisi del parametro del sangue. Questo metodo è ideale per la ricerca sui biomateriali poiché fornisce un modo semplice per valutare l'emocompatibilità.

Inoltre, può essere utilizzato per studi preclinici. Per il carico di eparina, mescolare prima 5.000 unità internazionali di eparina non diluita con cloruro di sodio allo 0,9% per ottenere 15 unità internazionali per millilitro di concentrazione di eparina. Successivamente, aggiungere 900 microlitri della soluzione diluita di eparina a tre monovette neutre e tre monovette riservate per donatore e conservare le monovette caricate con eparina a quattro gradi Celsius.

30 minuti prima della raccolta del campione di sangue, posizionare i monovette a temperatura ambiente. Quando le monovette si sono riscaldate, raccogliere nove millilitri di sangue in ciascuno dei tre monovetti per donatore prima di mettere in comune tutti i 27 millilitri di sangue di ogni donatore in un unico contenitore di plastica. Per preparare il ciclo di flusso, caricare almeno un tubo per condizione con l'impianto di interesse tagliato al laser neurovascolare e posizionare un'estremità di ogni tubo in un serbatoio pieno di cloruro di sodio allo 0,9%.

Posizionare un tubo scaricato nel serbatoio e collegare tutti i tubi alla testa della pompa. Quindi inserire l'altra estremità di ogni tubo in un cilindro di misura e regolare le impostazioni della pompa peristaltica su una portata di 150 millilitri al minuto utilizzando un timer durante il controllo del livello di riempimento nel cilindro di misura. Per i test di emocompatibilità, utilizzare una siringa da 12 millilitri per riempire ogni tubo con sei millilitri di sangue.

Dopo aver formato un circuito, utilizzare una lunghezza di 0,5 centimetri di tubi di collegamento in silicone per chiudere saldamente i tubi e posizionare i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi avviare il tubo di 60 minuti. Per l'analisi dell'emocromo intero, aggiungere 1,2 millilitri di sangue non perfuso o 1,2 millilitri di sangue da ciascun tubo dopo la perfusione in singole monovette contenenti EDTA.

Invertire con cura i monovette cinque volte e caricare le fiale in un analizzatore di sangue per un'analisi del numero di sangue di ogni campione. Al termine dell'analisi, posizionare le monovette sul ghiaccio per 15-60 minuti. Per la raccolta del plasma di citrato, riempire monovette contenenti citrato con 1,4 millilitri di sangue non perfuso o perfuso e invertire con cura ogni monovetta cinque volte.

Separare il plasma per centrifugazione e trasferire tre aliquote da 250 microlitri della frazione plasmatica in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri. Quindi congelare i campioni di plasma in azoto liquido e conservarli a meno 20 gradi Celsius fino alla loro analisi. Per la raccolta del plasma EDTA, dopo l'incubazione di quattro gradi Celsius dopo la misurazione del conteggio del sangue, separare il plasma per centrifugazione e trasferire tre aliquote di 250 microlitri della frazione plasmatica in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri.

Quindi congelare i campioni di plasma in azoto liquido per meno 20 gradi Celsius. Per la raccolta del plasma CTAD, riempire le monovette contenenti CTAD con 2,7 millilitri di sangue appena estratto o perfuso e invertire accuratamente i tubi cinque volte. Posizionare le monovette sul ghiaccio per 15-60 minuti prima di raccogliere il plasma mediante centrifugazione.

Trasferire 700 microlitri di ogni frazione plasmatica centrale in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri e centrifugare nuovamente i tubi di reazione riempiti. Quindi trasferire due aliquote da 100 microlitri della frazione centrale in singoli tubi di reazione da 1,5 millilitri e congelare i tubi in azoto liquido per il loro stoccaggio a meno 20 gradi Celsius. Per misurare i livelli di TAT nei campioni di plasma citrato, aggiungere 50 microlitri di tampone campione ELISA in ogni pozzo di una piastra inferiore piatta da 96 po 'e 50 microlitri di standard plasmatico, controllo del plasma e campioni di plasma non diluiti in duplicati ai pozzi appropriati della piastra.

Dopo aver sigillato la piastra, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 15 minuti con un delicato scuotimento. Al termine dell'incubazione, lavare la piastra tre volte con 300 microlitri di soluzione di lavaggio per porcile prima di aggiungere 100 microlitri di anticorpo TAT coniugato contro l'uomo per ogni pozzo. Dopo un'incubazione di 15 minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento, lavare il piatto tre volte con 300 microlitri di soluzione di lavaggio fresco per pozzo.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di soluzione di cromogeno appena preparata per pozzo per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzo e leggere la densità ottica su un fotometro a 490-500 nanometri utilizzando i dati della curva standard come linea di tendenza per calcolare la concentrazione tat di ciascun campione. Per preparare gli impianti per la microscopia elettronica a scansione, utilizzare le forcep per rimuovere gli impianti dai tubi e risciacquare brevemente ogni impianto tre volte in cloruro di sodio fresco allo 0,9% per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, conservare gli impianti in singoli contenitori di glutaraldeide al 2% in PBS senza calcio e magnesio durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva, incubare gli impianti in singoli contenitori di PBS per 10 minuti prima di disidratare gli impianti in concentrazioni ascendenti di etanolo per 10 minuti per concentrazione come indicato. Direttamente dopo la raccolta del sangue e la perfusione, non vengono rilevati cambiamenti nel numero di globuli bianchi o rossi o nei valori dell'ematocrito.

Tuttavia, una diminuzione dei livelli di emoglobina viene rilevata dopo la perfusione all'interno del sistema di loop di flusso. Si osserva anche una diminuzione del numero di piastrine, che aumenta quando uno stent non rivestito è presente all'interno del tubo. In particolare, questa perdita si riduce quando il sangue viene incubato con uno stent rivestito di fibrina-eparina.

La concentrazione complessa tat è leggermente aumentata in risposta alla perfusione. Quando viene aggiunto uno stent a metallo nudo, tuttavia, viene rilevato un aumento significativo del TAT che indica una profonda attivazione del sistema di coagulazione. L'uso di uno stent rivestito di fibrina-eparina impedisce questa attivazione.

La perfusione porta ad una maggiore attivazione della cascata di complimenti che non è influenzata dalla presenza di stent non rivestiti o rivestiti di fibrina-eparina. Allo stesso modo, i granulociti neutrofili sono attivati come evidenziato dalla quantificazione dei livelli di elastasi neutrofila polimorfonucleare. La visualizzazione mediante microscopia elettronica a scansione rivela che la presenza di una fitta rete di cellule del sangue e proteine sulla superficie dello stent non rivestito dopo la perfusione che non si osserva sugli stent rivestiti di fibrina-eparina.

È della massima importanza confermare che il sangue soddisfa i criteri di inclusione per ottenere campioni e utilizzare sangue appena prelevato il più rapidamente possibile. Il sangue umano può contenere virus ematici e altri agenti e comporta il rischio di infezione, quindi assicurati di indossare sempre DPI appropriati durante la manipolazione dei campioni.