Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

Questo metodo può essere utilizzato per valutare come nuovi agenti o strategie terapeutiche, influenzare o aumentare la risposta citotossica delle cellule T durante il cancro al pancreas. Questa tecnica consente ai tumori di essere rapidamente digeriti e stimolati in vitro, consentendo l'analisi simultanea di più parametri della risposta delle cellule T, che possono essere facilmente adattati per altre applicazioni. Per iniziare, usa le forcep, trasferisci il tumore su una piastra di Petri.

Conservare cinque millilitri di mezzo di digestione in un tubo da 50 millilitri sul ghiaccio per evitare l'inizio dell'attività enzimatica. Prendi una piccola aliquota di questa soluzione, per coprire il tumore sulla piastra di Petri. Utilizzare un bisturi sterile e forza per tagliare il tumore a piccoli pezzi, di circa tre millimetri di lunghezza.

Raschiare i pezzi tumorali nel tubo e invertire delicatamente il tubo fino a quando tutti i pezzi non sono immersi nei mezzi di digestione. Trasferire il tubo su un dispositivo di scuotimento per 20 minuti a 37 gradi celsius da digerire. Assicurarsi che tutti i pezzi di tumore siano sommersi e non attaccati al bordo del tubo.

Immediatamente dopo la fase di digestione, posizionare il tubo sul ghiaccio per rallentare l'attività enzimatica. Aggiungere EDTA per ottenere una concentrazione finale di 20 millimolare e vortice brevemente il campione da mescolare al fine di rallentare ulteriormente l'attività enzimatica. Aprire il tubo e sciacquare qualsiasi digestione tumorale dal coperchio del tubo con mezzo RPMI fresco.

Quindi preparare un colino da 70 micron, posizionarlo su un tubo aperto da 50 millilitri sul ghiaccio. Pre-bagnare il filtro con mezzo. Rimospendare le cellule digerite e lavare i lati del tubo utilizzando una Stripette da 25 millilitri o più grande.

L'apertura più ampia della Stripette consente al digest spesso di passare facilmente. Trasferire tutto il digest sul colino, utilizzando la Stripette da 25 millilitri. Schiacciare su e giù il tumore sopra il filtro usando uno stantuffo per siringhe millilitro.

Lavare continuamente le cellule attraverso il colino con RPMI. Assicurati di lavare con abbastanza forza per far passare le cellule. Continuare a lavare fino a quando tutte le cellule non sono passate attraverso il colino.

Centrifugare il tubo per cinque minuti a 300 volte G e quattro gradi Celsius. Resuspend con cura il pellet di cella e completare l'RPMI e passare direttamente attraverso un altro filtro per rimuovere qualsiasi matrice extracellulare o grumi di grandi dimensioni che non possono essere adeguatamente rimorsi. Se non è richiesta alcuna stimolazione, macchiare immediatamente le cellule isolate per l'analisi della citometria del flusso o rimornerne in un mezzo di congelamento del 10%DMSO e FBS e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire la stimolazione, conta prima le cellule. Diluire le cellule in mezzo completo per ottenere una concentrazione di due volte dieci a sei per 100 microlitri. Piastra 100 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra a 96 pota con fondo a U.

Aggiungere 100 microlitri di mezzo completo, contenenti una preparazione 2X di PMA e ionomicina. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi celsius, ma 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, a 20 microlitri di una preparazione 10X di Brefeldin A e Monensin, e mezzi completi per raggiungere una concentrazione finale di 1,06 micromolare e 2,0 micromolare, rispettivamente.

Rimettere la piastra nell'incubatrice per altre quattro ore. Dopo aver iniettato 1000 cellule TB32048 nel pancreas, i tumori ortotopici impiegano circa 30 giorni per svilupparsi. Dopo la digestione e la stimolazione dei tumori ortotopici raccolti, è stata eseguita una fluorescenza meno una per determinare la fluorescenza di fondo per la gating.

E Brefeldin A Monensin fu eseguito solo il controllo per determinare la produzione basale di citochine. Per l'incubazione interferone-gamma con Brefeldin A e Monensin, non ha comportato alcun aumento della gamma di interferone rispetto al controllo FMO, sia in campioni di milza che di tumore. Tuttavia, l'aggiunta di PMA e ionomicina, ha aumentato la percentuale di gamma di interferone intracellulare rilevabile sia nelle cellule T positive CD4 sia spleniche che derivate dal tumore e positive da CD8.

Le cellule T positive e CD8 positive del CD4, usate come controllo positivo, hanno una produzione gamma di interferone relativamente più elevata rispetto ai sottoinsiemi di cellule T infiltrarsi nel tumore. L'indicazione dell'immunosoppressione si verifica all'interno del tumore. Usando la stessa strategia per TNF alpha, un'alta percentuale di cellule T positive CD4 spleniche era positiva per il TNF alfa intracellulare.

Rispetto alle cellule T positive CD4 che si infiltrano nel tumore. Le cellule T positive cd8 spleniche e infiltrarsi nel tumore, hanno prodotto livelli simili di TNF alfa. Assicurarsi che il tumore sia sufficientemente tritato e che tutti i pezzi siano immersi nei mezzi di digestione.

Quando si schiaccia il tumore, assicurarsi di essere delicato e lavare accuratamente le cellule. Il protocollo di digestione tumorale può essere combinato con lo smistamento cellulare assistito dal flusso, per purificare i singoli sottoinsiemi delle cellule immunitarie per un'analisi aggiuntiva, funzionale o dell'espressione genica. Abbiamo usato questo metodo per caratterizzare il modo in cui le cellule B modellano la risposta immunitaria durante il cancro al pancreas, generando tumori ortotopici sia nei topi knockout delle cellule B che in quello impoverito delle cellule B.