Sistema di cocultura multidimensionale per modellare la progressione del carcinoma squamoso polmonare
17 marzo 2020
È stato sviluppato un sistema di modelli in vitro per catturare i cambiamenti architettonici dei tessuti durante la progressione del carcinoma squamoso polmonare (LUSC) in una co-coltura tridimensionale (3D) con fibroblasti associati al cancro (CAF). Questo sistema organoide fornisce una piattaforma unica per studiare i ruoli dei diversi cambiamenti delle cellule tumorali-intrinseche ed estrinseci che modulano il fenotipo tumorale.
Il nostro sistema di coltura cattura la plasticità fenotipica delle cellule carcinoma polmonari squamose in risposta alle interazioni tumore-stroma e come queste interazioni regolano la morfologia tumorale durante la progressione del carcinoma a cellule squamose polmonari. Il principale vantaggio del nostro sistema è la sua capacità di modellare la biologia cellulare squamosa polmonare in un contesto 3D preservando la plasticità delle cellule maligne. Questa cocultura 3D fornisce un sistema unico per indagare le interazioni tra cellule tumorali e stroma e potrebbe essere adattata per monitorare le risposte delle cellule carcinoma a cellule squamose polmonari e dei fibroblasti associati al cancro al trattamento farmacologico.
Per iniziare, scongelare flaconcini di matrice di membrana basale in un frigorifero di quattro gradi Celsius durante la notte. Raffreddare pipette di plastica da due millilitri e punte a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, riscaldare i reagenti utilizzati per dissociare le cellule TUM622, il buffer HEPES, la tripside/EDTA e il tampone di neutralizzazione della tripina in un bagno d'acqua celsius di 37 gradi.
Togliere la matrice di membrana basale scongelata dal frigorifero e mettere il flaconcino sul ghiaccio. Raffreddare le piastre di coltura tissutale su un dispositivo di raffreddamento a piattaforma metallica posto sul ghiaccio. Posizionare tubi di centrifuga su un rack di raffreddamento metallico sul ghiaccio.
Calcolare la quantità di cellule necessarie in base al numero di pozzi e alla concentrazione di cellule in ogni pozzo da preparare. Trasferire la sospensione cellulare TUM622 in un tubo di centrifuga raffreddato e girare verso il basso a 300 volte g in una centrifuga a secchio sospesa a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Con una pipetta aspirante attaccata a una punta non filtrata, aspirare attentamente il supernatante, lasciando circa 200 microlitri del mezzo nel tubo.
Toccare delicatamente sul lato del tubo per rimuovere e dissociare il pellet e quindi restituirlo al rack di raffreddamento. Utilizzando le pipette preraffreddate a due millilitri, mescolare delicatamente la matrice sul ghiaccio pipettando su e giù alcune volte. Pipetta a una velocità uniforme e moderata in modo che non vengono introdotte bolle nella matrice durante questa procedura.
Trasferire 1,1 millilitri della matrice in ogni tubo di centrifuga. Utilizzando punte preraffreddate, pipettare la matrice in ogni tubo su e giù circa 10 volte per effettuare una sospensione cellulare uniforme. Trasferire 310 microlitri della sospensione della matrice cellulare in ogni pozzo di una piastra preraffreddata da 24 pozza.
Posizionare la pipetta con un angolo di 90 gradi sulla superficie della piastra e aggiungere la sospensione al centro del pozzo. La sospensione si diffonde e copre l'intero pozzo. Per facilitare l'analisi dell'immunofluorescenza a valle, trasferire 60 microlitri di sospensione a matrice cellulare nel centro del pozzo di uno scivolo a camera a due porri.
Ciò consente alla matrice di formare una struttura simile a una cupola con un volume molto più piccolo. Riportare la piastra e la camera scivolare di nuovo nell'incubatore di coltura tissutale e incubare per 30 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi. Successivamente, esaminare la piastra e scorrere al microscopio luminoso per assicurarsi che le singole celle siano distribuite uniformemente all'interno della matrice.
Aggiungere un millilitro di coltura 3D pre-riscaldata mezzo completo in ogni pozzo della piastra e 1,5 millilitri di mezzo di coltura 3D in ogni pozzo dello scivolo della camera, quindi restituirli all'incubatore. Dopo aver preparato le sospensioni cellulari di TUM622 e CAF come descritto in precedenza, contare la densità cellulare CAF mescolando 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di tripano blu. Aggiungere 10 microlitri della miscela a ciascuna delle due camere dell'emocitometro per contare e calcolare la densità cellulare.
Per co-incorporare cellule TUM622 e FF nella matrice della membrana basale, calcolare innanzitutto il numero desiderato di celle utilizzate per la placcatura in base alle informazioni sulla densità cellulare. I CEM vengono seminati con un rapporto 2:1 di cellule TUM622. Trasferire il volume calcolato di TUM622 e la sospensione cellulare CAF nello stesso tubo di centrifuga.
Spin down e aspirare tutto il mezzo. Resuspend nella matrice della membrana basale e piastra 310 microlitri della miscela in ogni pozzo di una piastra da 24 porri. Per l'immunofluorescenza, trasferire 60 microlitri di miscele TUM622 e CAF su vetrine da camera come descritto in precedenza.
Per coculare TUM622 con CAF sovrapposti nella matrice a membrana basale, impostare prima la monocoltura TUM622 come descritto in precedenza, trasferire il doppio del numero di sospensioni CAF in un tubo di centrifuga e girare verso il basso a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e rimescolare le CAF nel mezzo di coltura, trasferire il doppio del numero di celle CAF che sono state rimescolate nel mezzo di coltura in ciascuno dei pozzi contenenti le celle TUM622 incorporate. Le tipiche cellule TUM622 in coltura 2D sono arrotondate con grandi nuclei mentre le FF sono piatte e allungate.
Sementi in coltura 3D, singole cellule TUM622 erano in grado di formare organoidi con morfologie acinarlike quando incorporate. Tra i cinque e i sette giorni, un lume divenne evidente nelle strutture dell'acinarlike e rimase vuoto in seguito. Ogni acinus, composto da un monostrato di cellule che circondavano il lume cavo, mostrava una corretta polarità basale apicale simile a quella dell'epitelio polmonare in vivo.
Queste strutture acinarlike erano iperplastiche e continuarono a crescere fino a 24 giorni prima che la matrice extracellulare si disintegrasse completamente. Nelle coculture TUM622-CAF, sovrapposte o co-incorporanti, la presenza di CAF ha notevolmente migliorato il numero e le dimensioni degli sferoidi formati. È interessante notare che, quando TUM622 acini entrò in stretta vicinanza con i TF, indusse gli acini a diventare invasivi e migrare verso i CEM, formando strutture simili a lacrima.
Per garantire una robusta formazione di strutture acinarlike, è fondamentale mantenere la matrice della membrana basale nella sua forma liquida durante l'intero processo di incorporamento delle cellule. Gli organoidi TUM622 possono essere utilizzati per una varietà di analisi a valle, tra cui immunofluorescente, immunoistochimica, citometria a flusso, RNA ed estrazione proteica e possono anche essere modificati per lo screening farmacologico. Utilizzando questo sistema come piattaforma, si può indagare come i cambiamenti intrinseci delle cellule tumorali e estrinsece cellulari nel microambiente tumorale possano influenzare l'architettura epiteliale tumorale e la formazione di carcinomi.
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Panoramica
Questo studio presenta un sistema modello in vitro per esplorare i cambiamenti architetturali del tessuto durante la progressione del carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC). La coltura tridimensionale in co-coltura con fibroblasti associati al cancro (CAFs) consente di indagare le alterazioni intrinseche ed estrinseche alle cellule tumorali che influenzano il fenotipo tumorale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Biologia Cellulare
Sfondo
- Il carcinoma polmonare a cellule squamose (LUSC) mostra plasticità fenotipica.
- Le interazioni tra tumore e stroma svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della morfologia tumorale.
- I sistemi di coltura 3D sono essenziali per modellare la biologia tumorale complessa.
- Comprendere queste interazioni può contribuire allo sviluppo di terapie mirate.
Scopo dello studio
- Modellare la biologia delle cellule squamose polmonari in un contesto 3D.
- Studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti associati al cancro.
- Valutare l'adattabilità del sistema per risposte ai trattamenti farmacologici.
Metodi Utilizzati
- Sviluppo di un sistema di co-coltura 3D.
- Scongelamento e preparazione della matrice della membrana basale.
- Dissociazione delle cellule TUM622 mediante tamponi specifici.
- Monitoraggio delle interazioni tumore-stroma in vitro.
Risultati principali
- Il sistema cattura efficacemente la plasticità delle cellule LUSC.
- Le interazioni con i CAF influenzano in modo significativo la morfologia del tumore.
- È fattibile l'adattamento per il monitoraggio del trattamento farmacologico.
- Il modello fornisce informazioni sulla biologia del tumore e sulle risposte al trattamento.
Conclusioni
- Il sistema di co-coltura 3D è uno strumento prezioso per lo studio del carcinoma polmonare a cellule squamose.
- Comprendere le interazioni tra tumore e stroma può orientare le strategie terapeutiche.
- Questo modello potrebbe migliorare lo sviluppo di trattamenti oncologici mirati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
La modellizzazione delle interazioni tra tumore e stroma in un contesto tridimensionale fisiologicamente rilevante affronta una lacuna fondamentale nella scoperta di farmaci per il carcinoma polmonare a cellule squamose, dove i tradizionali sistemi bidimensionali non riescono a riprodurre la compromissione dell'architettura epiteliale e i fenotipi invasivi. Questa piattaforma di organoidi consente una riduzione meccanicistica dei rischi associati ai bersagli, preservando la plasticità fenotipica delle cellule tumorali e riproducendo le influenze dinamiche del microambiente, sostenendo così una maggiore affidabilità predittiva nelle campagne di validazione dei bersagli e di screening fenotipico. L'adattabilità del sistema per analisi successive lo posiziona come una risorsa riutilizzabile che copre l'intero flusso di lavoro dalla fase iniziale della scoperta fino allo sviluppo preclinico, riducendo l'insuccesso biologico nei portafogli oncologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche modellando il modo in cui le interazioni tra tumore e stroma regolano l'architettura epiteliale durante la progressione del carcinoma.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione di morfologie invasive indotte da CAF e della formazione di strutture simili ad acini in un sistema rilevante per la malattia.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale catturando la plasticità fenotipica delle cellule del carcinoma polmonare a cellule squamose in risposta a segnali microambientali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti mantenendo morfologie simili ad acini con corretta polarità apicale-basale per periodi prolungati di coltura.
- Valore operativo: Standardizza le letture del saggio mediante parametri strutturali quantificabili, come dimensione e numero di sferoidi e formazioni invasive a forma di lacrima in risposta a segnali dello stroma.
- Valore di scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma per il monitoraggio del trattamento farmacologico, poiché la coltura eterologa può essere adattata per valutare le risposte delle cellule tumorali e dei fibroblasti associati al cancro agli interventi terapeutici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Modella la dinamica dei sistemi rilevanti per la malattia riproducendo caratteristiche chiave dell'architettura tissutale del carcinoma polmonare a cellule squamose e delle interazioni stromali osservate nella tumorigenesi.
- Continuità preclinica: Collega la fase di scoperta con la validazione preclinica consentendo l'analisi di meccanismi intrinseci ed estrinseci alle cellule tumorali che promuovono la compromissione dell'epitelio, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento proporzionate al rischio.
- Allineamento dei biomarcatori: Favorisce la scoperta di biomarcatori traslazionali grazie alla compatibilità con flussi operativi successivi di immunofluorescenza, immunohistochimica e estrazione di RNA e proteine.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto guida e alla validazione preclinica, grazie alla sua capacità di modellare le interazioni dinamiche tra tumore e stroma e di fornire letture fenotipiche quantitative.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi rivelando come il co-embedding o il sovrasfratto di CAF favorisca la formazione di sferoidi e induca morfologie invasive a forma di lacrima negli acini TUM622.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante la formazione riproducibile di coculture 3D, consentendo una valutazione standardizzata degli effetti dei composti sui sistemi di cocultura tumore-stroma.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative della formazione di strutture acino-simili, dello sviluppo della cavità luminale, delle dimensioni dei sferoidi e dei modelli di migrazione invasiva per confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici modellando la rottura dell'architettura epiteliale e l'invasione indotta dallo stroma, processi chiave nella progressione del carcinoma rilevanti per gli interventi terapeutici.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma adattabile piuttosto che come tecnica monouso, compatibile con applicazioni di immunofluorescenza, citometria a flusso e screening farmacologico in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile modellando la plasticità fenotipica delle cellule tumorali e le modifiche morfologiche dipendenti dallo stroma in un sistema tridimensionale di carcinoma polmonare a cellule squamose.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso rapporti cellulari definiti (2:1 CAF:TUM622), protocolli standardizzati per la manipolazione della matrice e fenotipi strutturali quantificabili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo i rischi associati ai bersagli, grazie all'osservazione dell'invasione indotta dal microambiente e della compromissione dell'epitelio, abbattendo il rischio di fallimento biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio identificando bersagli la cui modulazione influisce sulle interazioni tra tumore e stroma e sulle transizioni da acinare a invasivo in un modello fisiologicamente rilevante.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare primaria, nella manipolazione della matrice extracellulare 3D e nelle tecniche sterili per l’allestimento della coltura in cocultura.
- È subordinato all’accesso alla matrice della membrana basale, a strumentazione con controllo termico (4 °C, 37 °C) e a microscopia ottica invertita per la valutazione della morfologia.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nei protocolli di preparazione cellulare, di miscelazione della matrice e di semina, al fine di garantire una formazione uniforme di strutture simili ad acini tra diversi utilizzatori.
- Richiede valutazioni di adattamento qualora si estenda ad altri tipi di fibroblasti o modelli tumorali oltre ai CAF associati al carcinoma polmonare a cellule squamose TUM622.
- I limiti pratici includono la necessità di mantenere la matrice in stato liquido durante l’incorporazione e la finestra limitata di coltura prima del disfacimento della matrice (~24 giorni), come supportato dal materiale di origine.
