Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide
23 febbraio 2021
Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.
L'analisi delle cellule della popolazione laterale è uno dei metodi comunemente usati per isolare e identificare le cellule staminali tumorali dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. Questo test è conveniente, veloce ed economico. Questo metodo può contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.
Molti fattori possono influenzare la percentuale di cellule SP in questa analisi, quindi è fondamentale esplorare le condizioni corrette prima dell'esperimento formale. Semina le cellule tumorali in una piastra di sei po', e incubale in un incubatore Celsius di 37 gradi fornito con anidride carbonica al 5%. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 90% aspira il mezzo di coltura e lava le cellule due volte con tre millilitri di PBS.
Quindi, aggiungere 500 microlitri dello 0,25% di tripsiderina-EDTA a ciascun pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti. Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle, aggiungere tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS a ciascun pozzo e pipettare le celle su e giù da tre a cinque volte per disperdere i grumi cellulari. Esaminare la sospensione cellulare al microscopio.
Se sono presenti grumi cellulari, passare la sospensione attraverso un filtro da 70 micrometri. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugarle a 200 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS, pipettando le celle su e giù da tre a cinque volte per mescolare.
Contare le cellule al microscopio usando un emocitometro e diluirle in PBS integrato con 2%FPS ad una concentrazione finale di una per 10 alle sei cellule per millilitro. Preparare due provette a cinque millilitri, polistirolo, fondo tondo e aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a ciascun tubo. Etichettare una provetta come provetta e l'altra come tubo di controllo del bloccante.
Preparare una soluzione di bloccante diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungilo al tubo di controllo del bloccante e mescola bene, quindi incuba il tubo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Agitare il tubo ogni 10 minuti.
Preparare una soluzione di Hoechst 33342 diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungerlo separatamente alla provetta e al tubo di controllo del bloccante e mescolare bene, quindi incubare i tubi a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Agitare i tubi ogni 10 minuti.
Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 volte g e quattro gradi Celsius, quindi aspirare attentamente il supernatante. Rimorsi le celle in ogni tubo con un millilitro di PBS ghiacciato integrato con 2%FBS, quindi pipettare le celle su e giù per mescolare. Aggiungere un microlitro di ioduro di propidio di un milligrammo per millilitro, o PI, a ciascun tubo e mescolare.
Fare clic sulla scheda Parametri nel software del citometro di flusso. In primo luogo, scegliete i parametri rispettivamente di FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. In secondo luogo, scegliere la scala logaritmica per il parametro PI.
Infine, scegliete le scale di area e larghezza rispettivamente per i parametri FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. Eseguire prima le celle dalla provetta, quindi eseguire le celle dal tubo di controllo del bloccante utilizzando le stesse tensioni e cancelli. Raccogli da 20 a 100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.
Questo metodo è stato utilizzato per rilevare la proporzione di cellule SP nella linea cellulare del cancro al seno umano MDA-MB-231. La trama a punti di FSC-A contro PI-A mostrava una popolazione di cellule morte, detriti cellulari e la principale popolazione di cellule negative PI, che fu sottoposta ad ulteriori analisi. Una singola popolazione cellulare gateed dal grafico a punti di FSC-A contro FSC-W e il grafico a punti di SSC-A rispetto a SSC-W è stato utilizzato per analizzare la proporzione di cellule SP, che era di circa lo 0,9% nelle celle non trattate e circa lo 0,09% nelle celle trattate con reserpina.
Diverse concentrazioni di colorazione di Hoechst 33342 sono state testate su celle MDA-MB-435, ed è stato determinato che due microgrammi per millilitro erano ottimali per l'analisi SP. Basse concentrazioni hanno reso difficile distinguere le cellule SP dalle altre popolazioni, mentre alte concentrazioni hanno causato la scomparsa delle cellule SP. Verapamil e reserpina sono stati testati per determinare il blocco corretto per le celle MDA-MB-435.
Circa lo 0,4% delle cellule ha espulso il colorante dopo il trattamento con verapamil, ma il rapporto è sceso a circa lo 0,1% dopo il trattamento con reserpina, dimostrando che la reserpina è un bloccante più appropriato per questa linea cellulare. Questo protocollo è stato utilizzato anche per determinare la proporzione di cellule SP nelle cellule adenocarcinoma polmonari umane A549 trattate con attivatore STAT3 colivelin e nelle cellule tumorali del seno umano T47D trattate con inibitore FRA1 SKLB816. Questo saggio fornisce indizi sull'effetto regolatore delle vie di segnalazione sulle caratteristiche delle cellule staminali tumorali e facilita la scoperta di nuovi meccanismi, che possono in ultima analisi guidare la terapia mirata dei tumori.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo pratico, rapido ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale in linee cellulari di tumori solidi. L'analisi delle cellule della popolazione laterale è fondamentale per isolare e identificare le cellule staminali tumorali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Le cellule della popolazione laterale sono importanti per lo studio delle cellule staminali tumorali.
- Questo metodo aiuta a comprendere le proprietà di staminalità delle cellule tumorali.
- Molti fattori influenzano la percentuale di cellule SP.
- Condizioni sperimentali appropriate sono fondamentali per ottenere risultati accurati.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la misurazione delle cellule della popolazione laterale.
- Migliorare la comprensione della biologia delle cellule staminali tumorali.
- Facilitare la ricerca sugli effetti di vari segnali sulle cellule tumorali.
Metodi Utilizzati
- Sezionare le cellule tumorali in una piastra a sei pozzetti.
- Incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
- Aspirare il mezzo di coltura quando la densità cellulare raggiunge circa il 90%.
- Lavare le cellule con PBS prima dell'analisi.
Risultati principali
- Il metodo è efficiente ed economico.
- Permette l'isolamento delle cellule staminali tumorali da tessuti neoplastici.
- Condizioni adeguate sono essenziali per una misurazione accurata delle cellule SP.
- Questo approccio contribuisce alla comprensione della biologia delle cellule tumorali.
Conclusioni
- Il metodo presentato è uno strumento prezioso per la ricerca sul cancro.
- Agevola l'identificazione delle cellule staminali tumorali.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per esplorare la biologia tumorale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento delle cellule staminali tumorali mediante analisi della popolazione laterale permette una riduzione del rischio meccanicistica dei percorsi di staminalità tumorale, supportando la validazione degli obiettivi nella scoperta oncologica. Questo saggio fornisce dati quantitativi e riproducibili sulle popolazioni di cellule con caratteristiche staminali, orientando l'identificazione dei composti promettenti e la selezione dei modelli preclinici. L'elevata convenienza economica e l'adattabilità attraverso diverse linee di tumori solidi migliorano la continuità traslazionale, dall'individuazione iniziale allo screening mirato ai percorsi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche quantificando l'attività di efflusso delle cellule con caratteristiche di staminalità associate alla funzione dei trasportatori ABC.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dell'obiettivo mediante blocco farmacologico (ad esempio, verapamil, reserpina) per confermare la specificità del fenotipo SP.
- Valore traslazionale: Fornisce un supporto predittivo collegando la modulazione di geni o vie metaboliche (ad esempio, attivatore di STAT3, inibitore di FRA1) a variazioni nella frequenza della popolazione SP.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi isolando frazioni arricchite in SP.
- Valore operativo: Standardizza i saggi di efflusso del colorante ottimizzando la concentrazione di Hoechst 33342 (2 µg/mL) e la titolazione del bloccante per garantire riproducibilità.
- Valore traslazionale: Permette flussi di lavoro scalabili e riutilizzabili su diverse piattaforme per valutare gli effetti dei composti sulle proprietà delle cellule staminali tumorali in diverse linee cellulari (MDA-MB-231, MDA-MB-435, A549, T47D).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Misura le proprietà di staminalezza come sistema rilevante per la malattia per modellare i meccanismi di iniziazione tumorale, metastasi e recidiva.
- Valore operativo: Facilita decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio correlando la modulazione della frazione SP con l'efficacia degli inibitori delle vie di segnalazione.
- Valore traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori collegando le fluttuazioni della frazione SP agli effetti dei segnali extracellulari e intracellulari sulla staminalezza delle cellule tumorali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Posizionato nella fase iniziale della scoperta, questo metodo supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico prima dell'identificazione del capostazione, con risultati che informano la continuità preclinica.
- Biologia della scoperta: Permette la chiarificazione dei percorsi biologici quantificando come le perturbazioni genetiche o farmacologiche influenzano la capacità di autorinnovamento derivata dalla popolazione SP.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso una preparazione standardizzata delle cellule, la colorazione e l'impostazione dei parametri di selezione citofluorimetrica (FSC-A vs. PI-A, FSC-W, SSC-W).
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (percentuale di popolazione SP) per confrontare diverse condizioni (ad esempio, non trattate rispetto a trattate con reserpina).
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica valutando la modulazione della capacità di autorinnovamento in modelli di adenocarcinoma polmonare e di cancro al seno.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come una capacità modulare applicabile a diversi tipi di tumori solidi, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle cellule staminali tumorali attraverso la lettura funzionale diretta dell'efflusso del colorante.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante concentrazione cellulare standardizzata (1×10⁶ cellule/mL), incubazione (37°C, 5% CO₂) e controlli di blocco.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando con chiarezza statistica i regolatori del percorso della staminalità (ad esempio, STAT3, FRA1).
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base all'efficacia della modulazione della frazione SP in diversi modelli, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella compensazione e nel gating della citometria a flusso per i parametri Hoechst Blu/Rosso e PI.
- Dipende dall'accesso a citofluorimetri in grado di effettuare la scala logaritmica del PI e il rilevamento del segnale in area/larghezza.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione, lavaggio e bloccaggio delle cellule, al fine di ridurre al minimo la variabilità.
- Richiede considerazioni adattative per diversi tipi di tumore, poiché la concentrazione ottimale di Hoechst e l'efficacia del bloccante variano (ad esempio, MDA-MB-435 rispetto ad A549).
- Limite pratico: la sensibilità dell'analisi della popolazione SP dipende dall'esclusione corretta delle cellule morte e dei detriti mediante gating del PI, come mostrato nei grafici a punti di MDA-MB-231.
