Name: Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Scopri un metodo rapido ed economico per analizzare la popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide. Questa tecnica consente di isolare e identificare le cellule staminali tumorali per studiare le proprietà di stemness.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 e 81972787; Fondazione di Scienze Naturali della Città di Tianjin (Cina) 19JCYBJC27300; Tianjin People's Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali, l'Università di Nankai 63191153.

1. Preparazione cellulare
<ol><li>Digestione cellulare e neutralizzazione<ol>
<li>Seminare cellule tumorali (come le cellule MDA-MB-231) in una piastra di 6 pozzi e culturerle in un incubatore a 37 °C fornito con 5% di CO2.</li>
		<li>Raccogli le cellule quando la loro densità raggiunge circa il 90%. Aspirare accuratamente il mezzo di coltura e lavare accuratamente le cellule 2x con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). NOTA: Per esaminare gli effetti degli inibitori della via di segnalazione (ad esempio, inibitore di FRA1) o attivatori (ad esempio, attivatore STAT3) sulle caratteristiche di staminali delle cellule tumorali, le cellule tumorali vengono sementi in una piastra di 6 po po 'e pretrattate con inibitori o attivatori per un certo periodo di tempo prima del raccolto.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA ad ogni pozzo della piastra a 6 pozzetti, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 1-3 minuti (min) e toccare delicatamente la piastra per staccare le cellule. NOTA: La digestione prolungata influenzerà il profilo SP a causa di cambiamenti nella vitalità cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di PBS integrato con il 2% di siero bovino fetale (FBS) ad ogni pozzo della piastra a 6 pozzi per terminare la digestione e pipettare delicatamente le cellule su e giù 3-5x per disperdere i grumi cellulari.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di sospensione cellulare a un pozzo di una nuova piastra da 6 porri ed esaminarla al microscopio. Se si osservano grumi cellulari, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μM. NOTA: questo è un passaggio facoltativo.</li>
		<li>Trasferire le celle in un tubo di centrifuga da 15 ml. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min per le celle a pellet. Rimuovere il supernatante e riprenotarli in 3 mL di PBS integrati con FBS al 2%. Pipettare le celle su e giù 3-5x per mescolare accuratamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conteggio celle<ol>
<li>Aggiungere 50 μL della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e mescolarlo con una soluzione blu trypan da 50 μL. Pipetta 10 μL della miscela per contare il numero di cellule viventi usando un metodo standard, come un emocitometro.</li>
		<li>Diluire le cellule in PBS integrato con FBS al 2% ad una concentrazione finale di 1 x 106 celle/mL. Aggiungere 1 ml della sospensione cellulare a una provetta rotonda in polistirolo di 5 ml e preparare due provette campione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Colorazione cellulare con Hoechst 33342
<ol><li>Aggiungere hoechst 33342 a un tubo per raggiungere un'adeguata concentrazione finale. NOTA: Ad esempio, la concentrazione appropriata di Hoechst 33342 è di 3 μg/mL per le celle MDA-MB-231.</li>
	<li>Aggiungere un bloccante (ad esempio Fumitremorgin C, Verapamil o Reserpine) ad un altro tubo ad un'adeguata concentrazione finale e incubare il tubo a 37 °C per 30 minuti prima di aggiungere la stessa concentrazione di Hoechst 33342 descritta al passaggio 2.1. NOTA: Per le celle MDA-MB-231, il blocco appropriato è il reserpina (40 μM). La reserpina viene utilizzata come controllo di blocco per verificare l'assenza di celle nell'area SP gated.</li>
	<li>Preparare diversi tubi contenenti celle e aggiungere Hoechst 33342 a diversi gradienti di concentrazione. Dopo un saggio di citometria del flusso, scegliere la giusta concentrazione in base al profilo e alla proporzione di SP. NOTA: Questo è un passaggio opzionale utilizzato per definire la corretta concentrazione di Hoechst 33342.</li>
	<li>Preparare diversi tubi contenenti celle, aggiungere il bloccante a diversi gradienti di concentrazione, incubare i tubi a 37 °C per 30 minuti, quindi aggiungere Hoechst 33342 a una concentrazione appropriata. Dopo il saggio di citometria del flusso, scegliere la giusta concentrazione in base all'assenza di cellule nell'area SP gated. NOTA: Questo è un passaggio facoltativo utilizzato per definire la corretta concentrazione di bloccante.</li>
	<li>Posizionare i tubi in un incubatore a 37 °C e incubarli per 60 minuti, scuotendo i tubi ogni 10 minuti. NOTA: Scuotere accuratamente i tubi è importante per la colorazione, perché garantisce un contatto completo tra le cellule e il colorante per risultati di colorazione migliori.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 200 x g, 4 °C per 5 minuti e aspirare attentamente il supernatante, perché le cellule formano pellet molto sciolti e instabili.</li>
	<li>Celle resuspend di ogni tubo in 1 ml di PBS ghiacciato integrato con FBS al 2% e pipettare le celle su e giù 3-5x per mescolare accuratamente. Aggiungere 1 μL di 1 mg/mL di propididio ioduro (PI) alla sospensione di ciascun tubo per identificare le cellule morte. NOTA: Tutte le procedure in questo passaggio devono essere eseguite a 4 °C per inibire l'efflusso di Hoechst 33342 dalle cellule tumorali. I tubi devono essere protetti dall'esposizione diretta alla luce.</li>
</ol>3. Analisi per citometria del flusso
NOTA: Le istruzioni per l'uso del software del citometro di flusso (vedi Tabella dei materiali) sono descritte in questa sezione e nelle figure supplementari 1-10.
<ol><li>Nel software del citometro di flusso fare clic sul pulsante CARTELLA. Fare clic sul pulsante Esperimento, quindi su Nuovo esperimento ( Figura supplementare1A,B).</li>
	<li>Fare clic sul pulsante OK. "Experiment_001" verrà mostrato nella cartella (Figura complementare 2A,B).</li>
	<li>Fare clic Experiment_001 pulsante di modifica per modificare il nome della cartella in un nome specifico (ad esempio, "20191118-SP"). Fare clic su Invio. Il nuovo nome ("20191118-SP") verrà visualizzato in FOLDER (Supplementary Figure 3A,B).</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione alla nuova cartella dell'esperimento ("20191118-SP"). Fate clic sul pulsante Nuovo tubo (New Tube) per aggiungere un tubo al campione. Fare clic sul pulsante Freccia ( Figuracomplementare 4A-C).</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Parametri e impostare i parametri del citometro di flusso (Figura complementare 5).<ol>
<li>Utilizzare un dmsp (Dichroic Mirror Short-Pass) a 610 nm per separare le lunghezze d'onda di emissione. Utilizzare un filtro BP da 450/20 nm per raccogliere la fluorescenza blu e un EFLP da 675 nm per raccogliere la fluorescenza rossa. NOTA: Hoechst 33342 è eccitato con un laser UV a 355 nm e PI è eccitato a 488 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire i campioni di cella sul citometro di flusso. NOTA: le cellule SP possono essere ordinate per cernita cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) in condizioni sterili. Un totale di 100.000-500.000 cellule dovrebbero essere raccolte per gli esperimenti di follow-up.<ol><li>Eseguire celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro di flusso.<ol>
<li>Posizionare tubi contenenti celle macchiate con Hoechst 33342 sul citometro.</li>
			<li>Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, quindi fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". Visualizzare il tracciato di punti dell'area dell'impulso di dispersione in avanti (FSC-A, asse X impostato sulla modalità lineare) rispetto alla fluorescenza PI (asse Y impostato sulla scala logaritmica). Regolare le tensioni per mostrare le celle viventi nel lato destro e le celle non viventi, che sono brillantemente macchiate di PI, nell'angolo in alto a sinistra. Stabilire quindi un gate poligonale per escludere le celle morte e i detriti cellulari (Figura 1A) facendo clic sul pulsante Porta poligono per gateare il sottoinsieme P1, noto anche come sottoinsieme FSC-A, PI-A (Figura supplementare 6A,B).</li>
			<li>Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". Visualizzare il grafico a punti dell'asse FSC-A (asse X) rispetto alla larghezza dell'impulso di dispersione in avanti (FSC-W, asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante P1 sotto il pulsante Mostra popolazioni. Fate clic sul pulsante Porta rettangolare (Rectangular Gate) per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P2 (noto anche come sottoinsieme FSC-A, FSC-W). Ciò escluderà le celle con grandi volumi(figura complementare 7A-C e figura 1A).</li>
			<li>Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punti, fate clic sull'asse X e impostatelo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". Visualizzare il grafico a punti dell'area dell'impulso di dispersione laterale (SSC-A, asse X) rispetto alla larghezza dell'impulso di dispersione laterale (SSC-W, asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato dei punti e scegliere il pulsante P2 in Mostra popolazioni. Quindi fate clic sul pulsante Porta rettangolare (Rectangular Gate) per creare un gate rettangolare per gateare il sottoinsieme P3 (noto anche come sottoinsieme SSC-A, SSC-W). Ciò otterrà una popolazione cellulare con granularità uniforme (Figura complementare 8A-C e Figura 1A).</li>
			<li>Fate clic sul pulsante Traccia punti (Dot Plot) per visualizzare il tracciato punto, fate clic sull'asse X e impostatelo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". Visualizzate il grafico a punti di Hoechst Red-A (asse X) rispetto all'asse Hoechst Blue-A (asse Y). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante P3 sotto il pulsante Mostra popolazioni. Fate clic sul pulsante Porta poligono (Polygon Gate) per creare un gate poligonale per gateare il sottoinsieme P4 (noto anche come sottoinsieme Rosso-A di Hoechst, Blu-A di Hoechst). Fare clic con il pulsante destro del mouse sul tracciato punti, scegliere il pulsante Mostra gerarchia di popolazione per visualizzare la gerarchia della popolazione. NOTA: La trama dei punti mostrerà tre diverse popolazioni: 1) una popolazione di fase G0-G1 vicino al centro del grafico; 2) una popolazione di fase S-G2/M vicino all'angolo in alto a destra; 3) l'SP. L'SP viene quindi gated per ulteriori analisi(figura complementare 9A-D e figura 1A). Se il grafico a punti di Hoechst Red-A contro Hoechst Blue-A non mostra un profilo SP simile a quello mostrato nella Figura 1A, le tensioni devono essere regolate fino a quando non viene visualizzato un profilo simile. Nel frattempo, regola tutti i cancelli sopra di conseguenza.</li>
			<li>Dopo aver determinato l'area di gate delle celle SP, fare clic su Acquisisci dati per raccogliere 20.000-100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP (Figura complementare 10).</li>
		</ol></li>
		<li>Eseguire le celle macchiate di Hoechst 33342 trattate con bloccante sul citometro a flusso.<ol>
<li>Posizionare tubi contenenti bloccante sul citometro e far funzionare le celle utilizzando le stesse tensioni e cancelli per verificare ulteriormente se le tensioni e i cancelli sono selezionati in modo appropriato. NOTA: Rispetto alla sola colorazione Hoechst 33342, solo una piccolissimo percentuale di cellule, se presente, dovrebbe apparire nell'area recintata dell'SP (Figura 1B).</li>
			<li>Raccogli 20.000-100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi dei dati
NOTA: Le istruzioni per l'uso del software di analisi della citometria del flusso (vedi Tabella dei materiali)sono descritte in questa sezione e nelle figure supplementari 11-16.
<ol><li>Copiare i file in formato fcs in un computer, aprire il software di analisi della citometria a flusso e trascinare un file di esempio nel software (Figura complementare 11A,B).
</li>
	<li>Gate e ottenere la percentuale di celle SP.<ol>
<li>Fare doppio clic su questo filedi esempio , fare clic sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "PI-A". Creare quindi un gate poligonale e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, PI-A ( SupplementaryFigure 12A-E).</li>
		<li>Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, PI-A, sull'asse X e impostarlo su "FSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "FSC-W". Creare quindi un gate rettangolare e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme FSC-A, FSC-W (Figura complementare 13A-E).</li>
		<li>Fare doppio clic sul file del sottoinsieme FSC-A, FSC-W, sull'asse X e impostarlo su "SSC-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "SSC-W". Creare quindi un gate rettangolare e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme SSC-A, SSC-W (Figura complementare 14A-E).</li>
		<li>Fare doppio clic sul file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W, sull'asse X e impostarlo su "Hoechst Red-A"; fare clic sull'asse Y e impostarlo su "Hoechst Blue-A". Creare quindi un gate poligonale e fare clic sul pulsante OK per ottenere il sottoinsieme Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A ( Figurasupplementare 15A-E).</li>
		<li>Aprire l'editor di layout facendo clic sul pulsante Apri editor layout. Trascinare il file del sottoinsieme SSC-A, SSC-W nell'Editor layout, quindi fare clic sul pulsante Fare clic sul pulsante Fare clic per salvare la finestra del layout in file per salvare i risultati dell'immagine ( Figura supplementare16A-C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Salvare l'area di lavoro per conservare le informazioni di gating durante la chiusura del software.</li>
	<li>Eseguire analisi t-test con software di analisi statistica per confrontare la differenza tra due gruppi. Un valore di P < 0,05 è stato definito statisticamente significativo.</li>
</ol>

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
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<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+minor+groove-binding+ligands%3A+a+different+class+of+mammalian+DNA+topoisomerase+I+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi punti chiave da tenere a mente per il test SP. Il primo è la selezione di un blocco adeguato, come Verapamil o Reserpine, per ogni linea cellulare, perché la posizione "gate" delle celle SP è determinata in base alla posizione in cui un gran numero di cellule SP scompaiono dopo l'aggiunta del blocco. Per la linea di celle MDA-MB-231, Reserpine funziona bene. Tuttavia, per altre linee di celle, i blocchi diversi potrebbero funzionare meglio.
Il secondo è la concentrazione di Hoe...

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottoinsiemi di cellule con capacità di autorinnoto e potenziale di differenziazione multipla, che svolgono un ruolo vitale nella crescita tumorale, metastasi erecidiva 1,2. Attualmente, i CSC sono stati identificati per esistere in una varietà di tumori maligni, tra cui tumori polmonari, cerebrali, pancreas, prostata, seno e fegato3,4,5,6,7,8,9. L'identificazione dei CSC in questi tumori si basa principalmente sulla presenza di proteine marcatori superficiali, come l'alta e/o bassa espressione di CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, ma un marcatore unico in grado di distinguere le CSC dai non CSC non è stato segnalato finora. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per identificare e purificare i CSC nei tessuti tumorali o nelle linee cellulari tumorali. Queste tecniche sono progettate in base alle proprietà specifiche dei CSC. Tra questi, i saggi e lo smistamento delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati.
Le cellule SP sono state originariamente scoperte da Goodell etal. Quando le cellule del midollo osseo del topo furono etichettate con il colorante fluorescente Hoechst 33342, un piccolo gruppo di cellule macchiate di hoechst 33342 appariva nel grafico a punti bidimensionale di un saggio di citometria a flusso. Hoechst 33342 è un colorante legante il DNA e ha almeno due modalità di legame che portano a diverse caratteristiche spettrali. Quando si visualizza l'emissione di fluorescenza a due lunghezze d'onda contemporaneamente, è possibile rivelare più popolazioni12. Nel loro saggio, l'Hoechst 33342 era eccitato a 350 nm e la fluorescenza è stata misurata utilizzando il filtro passa-banda (BP) da 450/20 nm e il filtro perimetrale long-pass (EFLP)11da 675 nm. Rispetto all'intera popolazione di cellule del midollo osseo, questo gruppo di cellule è stato arricchito con cellule staminali ematopoietiche chiamate cellule SP11. Le cellule SP sono in grado di espellere rapidamente hoechst 33342. L'efflux di questo colorante è correlato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC)13, che possono essere inibiti da alcuni agenti come Fumitremorgin C14,Verapamil e Reserpine15,16. Successivamente, diverse proporzioni di cellule SP sono state rilevate in una varietà di tessuti, organi, tessuti tumorali e linee cellulari tumorali17,18,19. Queste cellule SP hanno molte caratteristiche delle cellule staminali17,19.
Questo manoscritto descrive l'etichettatura e la colorazione hoechst 33342 delle cellule tumorali coltivate e l'analisi delle cellule SP per citometria del flusso. Inoltre, vengono mostrate l'ottimizzazione della concentrazione di Hoechst 33342 e la corretta selezione del bloccante per una specifica linea cellulare tumorale utilizzando questo approccio. Infine, vengono dimostrati gli effetti della promozione della staminalità o dei segnali di inibizione sulla proporzione di SP nelle cellule tumorali. Gli esempi sperimentali dimostrano che l'analisi della SP può essere utilizzata per esplorare gli effetti di vari segnali, come l'espressione genica, piccoli inibitori, attivatori, citochine e chemiochine, sulla staminali tumorale. Rispetto ad altri metodi per l'isolamento e la purificazione dei CSC, come lo smistamento di CD44+/CD24– popolazione, analisi dell'aldeide deidrogenasi (ALDH) e test di formazione della sfera tumorale, questo metodo è più facile da manipolazione ed è conveniente.

<table><tbody><tr><td>piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td>9,5 cm2 (circa)</td></tr><tr><td>Colivelin</td><td>MCE</td><td>HY-P1061A</td><td>Ser-Ala-Leu-Arg-Ser-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Biological Industries (BIOIND)</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD LSRFortessa</td></tr><tr><td>Software per citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva</td></tr><tr><td>Software per analisi per citometria a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FlowJo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>bisBenzimide H 33342 tricloridrato</td></tr><tr><td>Polistirene provetta a fondo tondo</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td>12 x 75 mm, 5 mL</td></tr><tr><td>Propidio ioduro (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>3,8-Diamino-5-[3-(dietilmetilammonio)propil]-6-fenilfenantridinio diioduro</td></tr><tr><td>Reserpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83580</td><td>(3&beta;, 16&beta;, 17&alfa;, 18&beta;, 20&alfa;)-11,17-Dimetossi-18-[(3,4,5-trimetossibenzoil)ossi]yohimban-16-carbossilico estere</td></tr><tr><td>metilico SKLB816</td><td>Fornito dal Dr. Shengyong Yang, Università</td><td></td><td></td>del Sichuan</tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rosso</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>5-[N-(3,4-Dimetossifeniletil)metilammino]
cloridrato di -2-(3,4-dimetossifenil)-2-isopropilvaleronitrile</td></tr></tbody></table>

analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una causa importante di crescita tumorale, metastasi e recidiva. L'isolamento e l'identificazione dei CSC sono di grande importanza per la ricerca sul tumore. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per l'identificazione e la purificazione dei CSC dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. La separazione e l'analisi delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati. I metodi si basano sulla capacità dei CSC di espellere rapidamente coloranti fluorescenti, come hoechst 33342. L'efflux del colorante è associato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC) e può essere inibito dagli inibitori del trasportatore ABC. Vengono descritti i metodi per la colorazione delle cellule tumorali coltivate con Hoechst 33342 e l'analisi della proporzione delle loro cellule SP mediante citometria a flusso. Questo test è conveniente, veloce ed economico. I dati generati in questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.

Secondo questo metodo sono state eseguite quattro analisi sperimentali dell'SP. Nel primo, abbiamo rilevato la proporzione di cellule SP in MDA-MB-231, che è una linea cellulare per il cancro al seno umano tripla negativa, in condizioni normali. Dopo il conteggio delle cellule, hoechst 33342 è stato aggiunto in un tubo contenente 1 x10 6 celle ad una concentrazione finale di 3 μg/mL. Reserpina e Hoechst 33342 sono stati aggiunti ad un altro tubo a concentrazioni finali rispettivamente di 40 μM e 3 μg/mL. PI è ...

Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

L'analisi delle cellule della popolazione laterale è uno dei metodi comunemente usati per isolare e identificare le cellule staminali tumorali dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. Questo test è conveniente, veloce ed economico. Questo metodo può contribuire a una migliore comprensione dell'effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.Molti fattori possono influenzare la percentuale di cellule SP in questa analisi, quindi è fondamentale esplorare le condizioni corrette prima dell'esperimento formale. Semina le cellule tumorali in una piastra di sei po', e incubale in un incubatore Celsius di 37 gradi fornito con anidride carbonica al 5%. Quando la densità cellulare raggiunge circa il 90% aspira il mezzo di coltura e lava le cellule due volte con tre millilitri di PBS.Quindi, aggiungere 500 microlitri dello 0,25% di tripsiderina-EDTA a ciascun pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per uno o tre minuti. Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle, aggiungere tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS a ciascun pozzo e pipettare le celle su e giù da tre a cinque volte per disperdere i grumi cellulari. Esaminare la sospensione cellulare al microscopio.Se sono presenti grumi cellulari, passare la sospensione attraverso un filtro da 70 micrometri. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugarle a 200 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di PBS integrati con 2%FBS, pipettando le celle su e giù da tre a cinque volte per mescolare.Contare le cellule al microscopio usando un emocitometro e diluirle in PBS integrato con 2%FPS ad una concentrazione finale di una per 10 alle sei cellule per millilitro. Preparare due provette a cinque millilitri, polistirolo, fondo tondo e aggiungere un millilitro della sospensione cellulare a ciascun tubo. Etichettare una provetta come provetta e l'altra come tubo di controllo del bloccante.Preparare una soluzione di bloccante diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungilo al tubo di controllo del bloccante e mescola bene, quindi incuba il tubo a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Agitare il tubo ogni 10 minuti.Preparare una soluzione di Hoechst 33342 diluerla alla concentrazione appropriata. Aggiungerlo separatamente alla provetta e al tubo di controllo del bloccante e mescolare bene, quindi incubare i tubi a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Agitare i tubi ogni 10 minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule per cinque minuti a 200 volte g e quattro gradi Celsius, quindi aspirare attentamente il supernatante. Rimorsi le celle in ogni tubo con un millilitro di PBS ghiacciato integrato con 2%FBS, quindi pipettare le celle su e giù per mescolare. Aggiungere un microlitro di ioduro di propidio di un milligrammo per millilitro, o PI, a ciascun tubo e mescolare.Fare clic sulla scheda Parametri nel software del citometro di flusso. In primo luogo, scegliete i parametri rispettivamente di FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. In secondo luogo, scegliere la scala logaritmica per il parametro PI.Infine, scegliete le scale di area e larghezza rispettivamente per i parametri FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red e PI. Eseguire prima le celle dalla provetta, quindi eseguire le celle dal tubo di controllo del bloccante utilizzando le stesse tensioni e cancelli. Raccogli da 20 a 100.000 eventi da ogni campione per analizzare la percentuale di celle SP.Questo metodo è stato utilizzato per rilevare la proporzione di cellule SP nella linea cellulare del cancro al seno umano MDA-MB-231. La trama a punti di FSC-A contro PI-A mostrava una popolazione di cellule morte, detriti cellulari e la principale popolazione di cellule negative PI, che fu sottoposta ad ulteriori analisi. Una singola popolazione cellulare gateed dal grafico a punti di FSC-A contro FSC-W e il grafico a punti di SSC-A rispetto a SSC-W è stato utilizzato per analizzare la proporzione di cellule SP, che era di circa lo 0,9% nelle celle non trattate e circa lo 0,09% nelle celle trattate con reserpina.Diverse concentrazioni di colorazione di Hoechst 33342 sono state testate su celle MDA-MB-435, ed è stato determinato che due microgrammi per millilitro erano ottimali per l'analisi SP. Basse concentrazioni hanno reso difficile distinguere le cellule SP dalle altre popolazioni, mentre alte concentrazioni hanno causato la scomparsa delle cellule SP. Verapamil e reserpina sono stati testati per determinare il blocco corretto per le celle MDA-MB-435.Circa lo 0,4% delle cellule ha espulso il colorante dopo il trattamento con verapamil, ma il rapporto è sceso a circa lo 0,1% dopo il trattamento con reserpina, dimostrando che la reserpina è un bloccante più appropriato per questa linea cellulare. Questo protocollo è stato utilizzato anche per determinare la proporzione di cellule SP nelle cellule adenocarcinoma polmonari umane A549 trattate con attivatore STAT3 colivelin e nelle cellule tumorali del seno umano T47D trattate con inibitore FRA1 SKLB816. Questo saggio fornisce indizi sull'effetto regolatore delle vie di segnalazione sulle caratteristiche delle cellule staminali tumorali e facilita la scoperta di nuovi meccanismi, che possono in ultima analisi guidare la terapia mirata dei tumori.

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Ricerca sul cancro

Il seguente protocollo descrive un metodo per isolare la popolazione laterale di cellule tumorali della leucemia linfoblastica acuta (T-ALL), costituita da cellule staminali, da un pesce zebra adulto. La popolazione laterale manca di marcatori cellulari prominenti e quindi utilizziamo il saggio di efflusso colorante Hoechst 33342 per isolarli.

Saggio della popolazione laterale: un metodo per isolare la popolazione laterale di cellule tumorali dal pesce zebra

In questo video, descriviamo l'isolamento di una sottopopolazione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma squamoso della testa e del collo utilizzando un selezionatore di cellule attivato dalla fluorescenza o FACS. La popolazione laterale isolata di cellule può essere utilizzata per ulteriori analisi a valle.

Saggio di discriminazione della popolazione sul lato del cancro: un metodo per isolare le cellule staminali tumorali utilizzando il saggio di efflusso del colorante Hoechst

Analisi approfondite dei proteomi delle cellule tumorali facilitano l'identificazione di nuovi bersagli farmacologici e biomarcatori diagnostici. Descriviamo un flusso di lavoro sperimentale per l'analisi quantitativa di (fosfo-)proteomi in sottopopolazioni di cellule tumorali derivate da tumori liquidi e solidi. Ciò si ottiene combinando le strategie di arricchimento cellulare con la spettrometria di massa quantitativa basata su Super-SILAC.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

Comprendere il ruolo delle cellule staminali tumorali nella recidiva del tumore e nella resistenza alle terapie è diventato un argomento di grande interesse nell'ultimo decennio. Questo articolo descrive l'isolamento e la caratterizzazione della sottopopolazione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma squamoso della testa e del collo (HNSCC).

Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche

I metodi che consentono la caratterizzazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule staminali da campioni biologici sono critici per l'avanzamento dei trattamenti mirati alle cellule staminali nei cancri e oltre. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule staminali del cancro usando il fenotipo della popolazione laterale innescato dal colorante.

Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici

Qui, descriviamo una tecnica per isolare le cellule popolazione lato da un modello zebrafish di cellule T myc indotta da leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). Questo saggio popolazione lato è altamente sensibile ed è descritta per zebrafish T-ALL, ma può essere applicabile ad altri tipi di cellule zebrafish maligne e non maligne.

Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per studiare la dinamica della popolazione eterologica in risposta alle perturbazioni. Questo manoscritto descrive una piattaforma basata sull'immagine che produce set di dati quantitativi per la caratterizzazione simultanea di molteplici fenotipi cellulari di popolazioni eterellulari in modo robusto.

Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

La caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) è un argomento popolare nella ricerca traslazionale. Questo protocollo descrive un test di immunofluorescenza semi-automatica (IF) per la caratterizzazione PD-L1 e l'enumerazione dei CTC in campioni di pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC).

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

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Qui, dimostriamo che i laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm possono eccitare efficacemente Hoechst 33342 e fungere da valida alternativa al laser a 355 nm per il rilevamento di cellule di popolazione laterale (SP), ampliando così la gamma di laser disponibili nelle applicazioni di citometria a flusso.

Rilevamento efficace delle cellule della popolazione laterale di Hoechst mediante citometria a flusso

Scopri un metodo rapido ed economico per analizzare la popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide. Questa tecnica consente di isolare e identificare le cellule staminali tumorali per studiare le proprietà di stemness.

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