Name: PeptiQuick, unincorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in Peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Scopri il metodo PeptiQuick per la purifica e ricostituzione di proteine di membrana senza detergenti utilizzando la tecnologia Peptidisc. Questo approccio consente l'analisi delle interazioni proteina-ligando mediante interferometria a strato biologico.

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Ringraziamo il Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada. JS detiene una borsa di studio CGS-M CIHR. LT è stato sostenuto dalla Biotechnology and Biological Sciences Research Council, finanziata dalla South West Biosciences Doctoral Training Partnership ,20m, finanziata dalla Biotechnology and Biological Sciences Research Partnership [forma di riferimento per la formazione BB/M009122/1]. FD è una cattedra di ricerca di livello II Canada.

1. Preparazione e solubilità del recettore della membrana FhuA
<ol><li>Esprimereil suo 6-tagged FhuA in Escherichia coli ceppo AW740. Coltivare le cellule per 18 h a 37 gradi centigradi nei supporti M9 (Tabella 1). Vedere Mills et al.16 per un protocollo di espressione dettagliato.</li>
	<li>Raccogliere le cellule per centrifugazione (5.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi) e sospenderle in 50 mL di tampone Tris-salt-glicerol (TSG) (Tabella 1). Dounce le cellule risospese e aggiungere fenilmetanosulfonylfluoride (PMSF) ad una concentrazione finale di 1 mM appena prima della lisi. AVVISO: il PMSF è tossico e corrosivo.</li>
	<li>Lyse le cellule utilizzando un microfluidizzatore (tre passaggi) a 15.000 psi o una stampa francese (tre passaggi) a 8.000 psi. Pellet le cellule non adimensionali e altro materiale insolubile per centrifugazione a bassa velocità (5.000 x g, 10 min, 4 gradi centigradi).</li>
	<li>Ultracentrifuga il supernatante (200.000 x g, 40 min, 4 gradi centigradi) per isolare la frazione di membrana grezza. Scartare il supernatante, riutilizzare il pellet a membrana in una quantità minima di tampone TSG, e far rimbalzare utilizzando un apparato douncer di vetro o metallo per garantire l'omogeneità.</li>
	<li>Eseguire un saggio di Bradford per controllare la concentrazione proteica della membrana grezza risospesa. Diluire la membrana grezza ad una concentrazione finale di 3 mg/mL utilizzando buffer TSG prima della solubilità.</li>
	<li>Aggiungere il detergente Triton X-100 ad una concentrazione finale dell'1% (v/v) per solubilizzare selettivamente la membrana interna batterica per 1 h a 4 gradi centigradi con un leggero dondolo. Pellet il materiale insolubile (frazione di membrana esterna) per ultracentrifugazione (200.000 x g, 40 min, 4 gradi centigradi).</li>
	<li>Scartare il supervolontario contenente la membrana solubile e risospendere il pellet in TSG per una concentrazione finale di 3 mg/mL. Aggiungere l'ossido di laurildimethylamine (LDAO) a una concentrazione dell'1% (v/v) alla frazione di membrana esterna risospesa e solubilizzare per 1 h a 4 gradi centigradi con dondolo delicato.</li>
	<li>Eseguire un passo di centrifugazione finale per pellet tutto il materiale insolubile (200,000 x g, 40 min, 4 . NOTA: Il supernatante risultante contiene le proteine della membrana esterna solubilificate, incluso il bersaglio con l'etichetta FhuA.</li>
</ol>2. Purificazione e ricostituzione di FhuA utilizzando il flusso di lavoro PeptiQuick
<ol><li>Pre-equilibrate una colonna Ni-NTA preconfezionata (volume di resina da 5 mL) con due volumi di colonna di cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC) buffer di lavaggio (Tabella 1).</li>
	<li>Diluire la membrana esterna solubile dall'1% di LDAO allo 0,04% di LDAO utilizzando TSG. Quindi, aggiungere imidazolo ad una concentrazione finale di 5 mM. PROCEDIMENTO: L'Imidazolo è tossico e corrosivo.</li>
	<li>Caricare le proteine della membrana esterna solubilificate sulla resina Ni-NTA e raccogliere il flusso attraverso. Ricaricare il flusso attraverso la resina per aumentare il legame di resina di FhuA e raccogliere il flusso secondario attraverso. NOTA: Mantenere un 20 - l'lundi di materiale soluttizzato come riferimento per l'analisi successiva di elettroforesi da solfato di sodio dodecyl (SDS-PAGE).</li>
	<li>Lavare la resina con 250 mL di tampone di lavaggio IMAC e raccogliere i primi 50 mL di eluato. Scolare il buffer di lavaggio all'altezza del volume del letto di resina e chiudere il tappo sulla colonna.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione concentrata di peptide Biopeptidisc 10 mg/mL (Tabella 1) alla colonna. Aggiungere 50 mL di diluire 1 mg/mL Nella soluzione di peptide Bio-Peptidisc in TSG e mescolare la resina con un'asta di vetro per risospendere le perline in TSG.</li>
	<li>Dopo l'intrappolamento del peptidisco, lasciare che la resina si stabilizzi e drenare la soluzione bio-peptidisca in eccesso di 1 mg/mL attraverso la resina.</li>
	<li>Lavare le particelle peptidisce attaccate Ni-NTA con 50 mL di TSG. Eluire le particelle di peptidisco con 15 mL di tampone di eluizione IMAC (Tabella 1) contenenti 600 mM di imidazolo in TSG. Raccogliere 1 mL di frazioni e aggiungere immediatamente 10 .L of 0.5 M EDTA per chelare gli ioni di nichel lisciviati. AVVISO: L'EDTA è un irritante.</li>
</ol>3. Valutazione della ricostituzione di PeptiQuick
<ol><li>Analisi SDS-PAGE<ol>
<li>Caricare 10 aliquote del materiale di partenza, flusso, lavaggio(e) e frazioni eluite dalla ricostituzione PeptiQuick su un gel e un 12% di gel di denaturazione SDS per 30 min ad una corrente costante di 60 mA.</li>
		<li>Macchiare il gel con Coomassie tintura blu, demacchiare il gel, e visualizzare su uno scanner.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC)<ol>
<li>Sulla base dell'analisi 12% SDS-PAGE della ricostituzione PeptiQuick, isolare e mettere in comune le frazioni rilevanti, e concentrarle utilizzando un concentratore centrifugo cut-off da 30 kDa. NOTA: Nel video di accompagnamento, le frazioni F3–F7 sono raggruppate e concentrate sotto 1 mL (il volume del loop di iniezione sullo strumento SEC).</li>
		<li>Iniettare 1 mL delle frazioni di eluizione IMAC raggruppate su una colonna di filtrazione gel S200 (300/10) a una velocità di flusso di 0,25 mL/min nel buffer TSG. Raccogliere 1 mL frazioni ed eseguirle su un 12% gel SDS per determinare quali frazioni SEC da raggruppare e concentrarsi. NOTA: Le frazioni PeptiQuick eluite possono essere raggruppate senza concentrazione, e un'aliquota può essere iniettata sulla SEC per verificare la qualità della ricostituzione. Si tratta di un controllo importante per le proteine della membrana potenzialmente sensibili all'aggregazione durante la concentrazione centrifuga.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Interferometria Biolayer
<ol><li>Configurazione sperimentale BLI<ol>
<li>Impostare la piastra 96 pozzo a mano. NOTA: Tutti i pozzetti sono riempiti ad un volume finale di 200 L.</li>
		<li>Nella colonna 1, file A-E, caricare 200 l di tampone cinets per consentire alle punte di eclitare e formare un segnale di base.</li>
		<li>Diluire il ligando (FhuA in biopeptidisc) a una concentrazione di 2,5 g/mL nel tampone cinetico (tabella 1). Caricare 200 l di questa diluizione nelle file A-D nella colonna 2.</li>
		<li>Aggiungere 200 l di tampone cinetiche solo a E2 (il sensore di riferimento).</li>
		<li>Aggiungete 200 l di tampone cinetici alla colonna 3, righe A-E per lavare l'eccesso di FhuA dalla punta.</li>
		<li>Nella colonna 4, condurre diluizioni seriali bidimensionali dell'analita (ColM) lungo la piastra da A4 a D4. Iniziare con 28 nM (8 Kd) in A4 a 3.5 nM (1Kd) in D4.</li>
		<li>Aggiungere 28 nM ColM a E4 per misurare per l'associazione non specifica (utilizzata la più alta concentrazione ColM).</li>
		<li>Aggiungete 200 l di buffer cinetici alla colonna 5, righe A. NOTA: Qui, il ColM si dissocia dalla punta e la dissociazione viene misurata.</li>
		<li>Posizionare la piastra di configurazione nello strumento BLI.</li>
		<li>Posizionare il vassoio delle punta del sensore nello strumento BLI.</li>
		<li>Aprire il software di acquisizione dati BLI e selezionare Nuovo esperimento Kinetics nella procedura guidata del software.</li>
		<li>Utilizzare la scheda di definizione della piastra per inserire il layout della piastra 96 bene nel software. NOTA: I pozze contenenti il ligando, FhuA vengono inseriti come "Carica". I pozzi contenenti solo buffer vengono immessi come "Buffer". I pozzi contenenti l'analita, ColM, vengono immessi come "Sample".</li>
		<li>Utilizzare la scheda Definizione assaggio per definire la durata e la velocità di rotazione della piastra per ogni fase dell'esperimento. NOTA: I passaggi sperimentali sono impostati come: 1) linea di base: 60 s; 2) carico: 250 s; 3) linea di base2: 300 s; 4) associazione: 450 s; e 5) dissociazione: 900 s. Lasciare la velocità di agitazione come default (1.000 rpm). I passaggi precedenti vengono assegnati singolarmente a ogni colonna della piastra di 96 pozzo selezionando il passo desiderato e fare clic con il pulsante destro del mouse su Aggiungi passo di saggio in ogni colonna.</li>
		<li>Assegnare il primo passaggio facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla prima colonna e selezionare Avvia nuovo modello. Assicurarsi che il passaggio di base sia assegnato correttamente utilizzando la finestra in basso a destra e modificare con il menu a discesa in base alle esigenze.</li>
		<li>Assegnare i passaggi successivi a ogni colonna facendo clic con il pulsante destro del mouse lungo la piastra e selezionando Aggiungi passo di esercizio. Assegnare questi alla colonna appropriata, come impostato nel passaggio 4.1.13.Assign these to the appropriate column, as set in step 4.1.13.</li>
		<li>Utilizzare la scheda di assegnazione del sensore per assicurarsi che lo strumento di ottetta prenda i pin BLI dalla posizione corretta nel vassoio del sensore. NOTA: nella scheda di assegnazione del sensore, solo A1-E1 deve essere evidenziato in blu. Assicurarsi che la punta del sensore sia presente in queste posizioni nel vassoio del sensore e che l'F1-H1 sia vuoto.</li>
		<li>Evidenziare F1-H1 sullo schermo, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Rimuovi per contrassegnarli come vuoti. Selezionare Sostituire i sensori nel vassoio dopo l'uso per mantenere i sensori utilizzati.</li>
		<li>Nella scheda Dell'esperimento di revisione, che fornisce una panoramica finale dell'esperimento prima dell'esecuzione, esaminare i passaggi sperimentali per verificare che l'intera configurazione sia corretta.</li>
		<li>Nella scheda Esegui esperimento, selezionare un percorso di file per salvare i file del metodo.</li>
		<li>Modificare la temperatura della piastra alla temperatura ambiente.</li>
		<li>Selezionare GO per eseguire l'esperimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati BLI<ol>
<li>Aprire il software di analisi dei dati BLI di Ottetto.</li>
		<li>Utilizzare la scheda di selezione dei dati per individuare l'esperimento e controllare il riepilogo sperimentale. Importare il file di progetto dal percorso di salvataggio definito durante il passaggio 4.1.19.</li>
		<li>Immettere le concentrazioni dell'analita (qui, ColM) selezionando le informazioni del sensore per ogni esperimento.</li>
		<li>Assegnare la punta in E1 come suggerimento di riferimento.</li>
		<li>Utilizzare la scheda di elaborazione per sottrarre il segnale di riferimento (E1) dai dati sperimentali. Controllare i dati non elaborati dal suggerimento di riferimento per l'associazione di analita non specifica. Se non viene osservato, procedere. NOTA: si tratta di un importante controllo negativo. Se si osserva un binding non specifico, questo verrà contabilizzato nel passaggio 4.2.7.If nonspecific binding is observed, this will be accounted for in step 4.2.7.</li>
		<li>Allineare l'asse y al secondo passo della linea di base. Non spuntare la connessione a interpassaggio. Selezionare Filtro Savitzky-Golay. Selezionare Elabora dati!.</li>
		<li>Nella scheda Analisi, selezionare i dati sperimentali nella tabella sotto il grafico per vedere le curve di associazione e dissociazione con il segnale dal sensore di riferimento sottratto.</li>
		<li>Selezionare il modello di rilegatura 1:1 e selezionare un adattamento parziale della curva. Selezionare Adatta curve!.</li>
		<li>Analizzare il grafico della vista residua per controllare il raccordo della curva.</li>
		<li>Scorrere la tabella per visualizzare il Kdcalcolato.</li>
		<li>Selezionare Salva rapporto... per salvare un documento di foglio di calcolo che descrive in dettaglio l'impostazione, i grafici dei dati non elaborati e analizzati e le costanti di dissociazione calcolate.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

FD è fondatore di Peptidisc Biotech per distribuire peptidi peptidi alla comunità accademica. Peptidisc Biotech collabora anche con aziende industriali di biotecnologie e farmacie per implementare il peptidisc nei loro flussi di lavoro di scoperta. La pubblicazione Open Access di questo articolo è stata sponsorizzata da FortéBio.

Mentre i detergenti rimangono il metodo più semplice per estrarre e purificare le proteine della membrana, questi surfactants possono avere molti effetti indesiderati sulla stabilità delle proteine, sulla funzione e sulle analisi a valle1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Queste difficoltà hanno motivato lo sviluppo di mimetiche a membrana, che si sforzano di ridurre al minimo la presenza di detergenti e replicare l'ambiente nativo della membrana il più possibile2,3,4 ,5,6. La maggior parte dei metodi di ricostituzione, tuttavia, richiede un'ottimizzazione significativa delle condizioni di ricostituzione e spesso richiedono ulteriori fasi di purificazione, che riducono il rendimento finale7,8. Il peptidisc si adatta spontaneamente alla proteina della membrana bersaglio e relativamente, richiede poca ottimizzazione e purificazione a valle9,10. In questo protocollo, PeptiQuick è presentato come un semplice mezzo per semplificare il protocollo di ricostituzione per l'analisi a valle dell'interazione proteina-proteina.
Anche se semplici, ci sono diversi avvertimenti sperimentali che possono portare a una ricostituzione senza successo. Tra questi, il più comune è dovuto all'aggregazione delle proteine. È quindi fondamentale eseguire la cromatografia di esclusione delle dimensioni per monitorare il processo di ricostituzione. Ad esempio, un picco di esclusione di dimensioni che si eluisce al volume vuoto è indicativo di aggregati proteici (Figura 3B)17,18. Gli aggregati proteici di membrana si formano in genere in base all'esposizione prolungata a condizioni detergenti non ottimali prima della ricostituzione. In particolare, è stato scoperto che le proteine della membrana nel detersivo tendono a formare aggregati quando concentrate dall'ultrafiltrazione su dispositivi centrifughi. In questo caso, le proteine sensibili della membrana possono essere concentrate utilizzando l'ultra-filtrazione del vuoto, un metodo di concentrazione più delicato e più omogeneo poiché l'assorbimento delle proteine al filtro è diminuito.
In generale, per evitare la concentrazione di proteine, le frazioni eluite di IMAC dovrebbero essere raggruppate e una colonna di esclusione di dimensioni iniettata in una colonna di esclusione delle dimensioni per verificarne la qualità di ricostituzione. Va notato che non incorporato eluito peptide libero subito dopo il picco principale peptidisc (Figura 3B). L'impalcatura libera non ostacola necessariamente gli esperimenti a valle. Tuttavia, se necessario, questo eccesso può essere rimosso dalla cromatografia di esclusione di dimensioni. In alternativa, aumentare il volume di lavaggio durante la ricostituzione e prima dell'eluizione dalla resina IMAC è sufficiente per rimuovere efficacemente la maggior parte del peptidio peptidisco libero. Pertanto, la cromatografia di esclusione delle dimensioni è raccomandata come mezzo rapido e semplice per controllare la qualità della ricostituzione.
L'esperimento BLI richiede un'attenta ottimizzazione delle concentrazioni di ligando e analita. L'associazione del ligando deve essere sufficiente per ottenere un segnale chiaro, ma il sovraccarico causerà la saturazione del segnale, che si traduce in artefatti di dati provenienti dal sovraffollamento e ostacoli sterici sulla superficie della punta. Pertanto, sia la concentrazione del ligando che la durata del tempo che la mancia trascorre nella soluzione di ligando devono essere ottimizzate per ogni campione di proteine (Figura supplementare 2). Anche la concentrazione di analita deve essere ottimizzata. Se la costante di dissociazione è nota, questo passaggio diventa più facile, poiché l'intervallo di concentrazione può essere approssimato. Un buon punto di partenza per questa analisi è l'utilizzo di concentrazioni proteiche comprese tra 0,1 e 20 volte il Kd19previsto.
Dopo l'acquisizione dei dati BLI, è necessario eseguire un'attenta analisi dei dati per evitare interpretazioni errate. Il calcolo della costante di dissociazione dipende dall'adattamento di una curva di rilegatura. A meno che la stoichiometria di legame non sia già nota, per il montaggio iniziale deve essere utilizzato un modello di interazione bimolecolare 1:1 classico. Va notato che una curva di rilegatura eterogenea è spesso il risultato di artefatti e comportamenti non ideali causati da un'elevata concentrazione di analiti, che può essere erroneamente interpretata come un modello di legame complesso. Pertanto, abbassare la concentrazione di analita fino a quando il profilo del sensorgramma non visualizza la stoichiometria di rilegatura 1:1 può aiutare a differenziare l'associazione eterogenea dalle interazioni più complesse. Tutti i dati di associazione eterogenei residui vengono quindi scontati come illustrato nella figura 420.
In questo rapporto, viene misurata una costante di dissociazione di 2,28 x 0,74 nM per l'interazione FhuA-ColM. Questo valore è coerente con la costante di dissociazione precedentemente determinata nel nostro gruppo con nanodisco o peptidisc utilizzando ITC o MST, rispettivamente (Figura 4E)16. Questa consistenza fornisce fiducia sulla ricostituzione del peptidisco e l'analisi BLI come mezzo per determinare la cinetica di interazione. È importante sottolineare che le proteine sono solitamente immobilizzate su biosensori di streptavidina sia attraverso il cross-linking chimico della biotina che l'aggiunta site-specific utilizzando l'E. coli biotinli BirA21. Evidentemente, biotinyalare lo scaffold peptidisce, invece della proteina della membrana bersaglio, ha molti vantaggi. La biotinylazione degli scaffold consente di risparmiare tempo e riduce al minimo la possibilità di interrompere importanti siti di legame proteico. Abbiamo anche scoperto che PeptiQuick è applicabile a un'ampia gamma di classi di target proteiche, tra cui i recettori accoppiati con proteina G (GRACR), i canali ionici e le proteine della membrana delle botti z. In generale, va notato che l'estratto iniziale di detergenti delle proteine della membrana in uno stato privo di aggregati è critico e che la ricostituzione immediata nel peptidisco diminuisce i problemi di aggregazione a valle. Data la semplicità, si prevede che PeptiQuick sarà esteso ad altri saggi di legame a base di streptavidin, come la risonanza del plasmone superficiale (SPR), i saggi ELISA e i pull-down di affinità utilizzando perline streptavidin.

Le proteine della membrana sono spesso escluse dai programmi di ricerca sulla scoperta di farmaci o anticorpi a causa della propensione delle proteine della membrana ad aggregarsi al di fuori dell'ambiente bistrato lipidico, soprattutto in presenza di detergenti1. Pertanto, negli ultimi anni, sono stati sviluppati diversi mimetici a membrana (definite scaffold) per facilitare l'isolamento e l'interrogatorio delle proteine della membrana in un ambiente completamente privo di detergenti (ad esempio, nanodischi, SMALP, anfipoli, ecc.) 2,3,4,5,6. Tuttavia, la ricostituzione delle proteine della membrana in questi mimetici spesso richiede un'ampia ottimizzazione, che richiede tempo e generalmente accompagnata da perdita di recupero proteico7,8. Per superare queste limitazioni, il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato una formulazione "one-size-fits-all" nota come peptidisc9. Il peptidisco si forma quando più copie di un designer 4.5 kDa peptide bihelical anfipatico si legano alla superficie idrofobica di una proteina membrana bersaglio. La ricostituzione stabile nel peptidisco avviene dopo la rimozione del detergente, intrappolando sia i lipidi endogeni che le proteine della membrana soluttiva in particelle solubili in acqua. Queste particelle stabilizzate sono ora suscettibili di numerose applicazioni a valle.
Il metodo peptidisc offre diversi vantaggi; per esempio, la ricostituzione è semplice, poiché il legame dell'impalcatura del peptidisco sul bersaglio è guidato dal modello proteico stesso9,10. La stoichiometria del peptide è anche autodeterminata e l'aggiunta di lipidi esogeni non è necessaria. La formazione di peptidi di peptidi provochi per semplice diluizione detergente, un importante vantaggio rispetto alla dialisi o all'adsorptioni su perline di polistirolo, che spesso si traducono in una bassa resa proteica a causa dell'associazione di superficie non specifica e dell'aggregazione11,12 ,13. L'assemblaggio finale del peptidisco è altamente termostabile e invariabilmente solubile in diversi cuscinetti o in presenza di cation divalenti (ad es., Ni2 .). Anche la purezza e l'omogeneità strutturale dell'impalcatura sono elevate (ad esempio, endotossina-free), e il peptide può essere personalizzato con gruppi funzionali posizionati in posizioni diverse.
Vi presentiamo qui un flusso di lavoro di laboratorio chiamato PeptiQuick, noto anche come on-perline ricostituzione9. Questo protocollo combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione del peptidisco in un unico passaggio e sullo stesso supporto cromatografico. Come indica il nome, PeptiQuick è rapido rispetto ad altri metodi di ricostituzione, e riduce anche seriamente il tempo di esposizione al detersivo. Gli effetti negativi del detersivo, come lo sviluppo e l'aggregazione delle proteine, si verificano spesso in modo dipendente dal tempo; pertanto, ridurre al minimo l'esposizione al detersivo è fondamentale per mantenere la conformazione proteica nativa14,15. Questo è fondamentale per l'accuratezza dei metodi che riportano sulle interazioni proteiche e sulle affinità leganti.
Durante lo sviluppo di questo protocollo, presentiamo la nuova versione biotinylata dello scaffold peptidisce, chiamato Bio-Peptidisc. I gruppi funzionali della biotina consentono l'attaccamento della proteina della membrana bersaglio su superfici rivestite di streptavidina. Poiché l'etichettatura della biotina è limitata allo scaffold, i siti di legame sulla proteina della membrana bersaglio rimangono inalterati. Utilizzando il biopeptidisc, la cinetica legante del recettore della membrana batterica FhuA e la colicina peptide antimicrobica M (ColM) sono determinati16. Questa affinità viene misurata tramite l'interferometria del biostrato (BLI), che analizza le interazioni in tempo reale in base ai modelli di interferenza della luce bianca riflessi da una punta del sensore.
Utilizzando questo protocollo, viene eliminata la necessità di detersivo durante l'analisi BLI, che è uno sviluppo importante, poiché i detergenti possono interrompere le interazioni. Le affinità di legame possono essere misurate rapidamente con questo metodo e i risultati sono paragonabili a quelli riportati in precedenza utilizzando nanodischi e calorimetria di titola isotermica (ITC)16. I passaggi critici del flusso di lavoro PeptiQuick sono mostrati e discussi, come la preparazione delle proteine, la diluizione del detersivo, l'aggiunta di peptidi e la ricostituzione, insieme a suggerimenti per risolvere i problemi di ligando e analita nel saggio BLI. Utilizzando il flusso di lavoro PeptiQuick, si scopre che le proteine della membrana possono essere catturate in peptidiscs e le loro interazioni misurate in un giorno.

<table><tbody><tr><td>Concentratore centrifugo cut-off da 30 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7715-Ampicillina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioShop</td><td>69-52-3</td><td>Sale di sodio</td></tr><tr><td>Bio-Peptidisc Peptidisc Peptidisc</td><td>Biotech</td><td>Albumina sierica</td> <td>https://peptidisc.com-bovina</td></tr> <tr><td>(BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td>Polvere liofilizzata</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Chimico</td><td>10035-04-8</td><td>Certificato ACS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>6381-92-6</td><td>Grado biotecnologico</td></tr><tr><td>Ettan LC (AKTA)</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td>18-1145-58-Glucosio</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioShop</td><td>50-99-7</td><td>Anidro, grado reagente</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>56-81-5</td><td>Certificato ACS</td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>BioShop</td><td>288-32-4</td><td>Ossido</td></tr> di <tr><td>laurildimetilammina di grado biotecnologico (LDAO)</td> <td>Sigma</td><td>101822204</td><td>~30% in H2O</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Chemical</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microfluidizzatore certificato ACS Microfluidics</td><td>M-110L</td><td>Adatto con camera di diruzione F20Y 75& micro;</td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-320-50-Piastra</td><td></td></tr> <tr><td>BLI a 96 pozzetti non vincolante</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655076</td><td>Micropiastra, PS, 96 pozzetti, F-Bottom (pozzetto camino), Nero, Fluotrac, Med. Ottetto rilegante</td></tr><tr><td>Red96</td><td>Fort&eacute; Strumento Bio</td><td>OCTET RED96E-GxP</td><td>Octet RED96e, software Octet CFR, computer desktop, monitor LC, kit di accessori, kit IQ/OQ, kit PQ e garanzia di un anno</td></tr><tr><td>Fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Colorante per</td> saggi proteici Sigma <td>P-7626</td><td></td></tr> <tr><td>- Concentrato di reagenti Bio-Rad</td><td></td><td></td><td>5000006 Utilizzato nel test Bradford per determinare la concentrazione proteica - Concentrazione 5x</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Biosensori di streptavidina (SA)</td> di grado biotecnologico <td>ForteBio</td><td>18-5019</td><td>Un vassoio di 96 biosensori rivestiti con streptavidina per applicazioni di quantificazione, screening o cinetica.</td></tr><tr><td>Superdex S200 (300/10)</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td>175175-01-Tiamina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Merck</td><td>69271-Tris-HCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BioShop</td><td>77-86-1</td><td>Reagente Grado</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>900998-1</td><td>Biotecnologia Grado</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>56-40-6</td><td>Reagente Grado Ultra</td></tr><tr><td>centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td>365668</td><td>-</td></tr></tbody></table>

peptiquick, un'incorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Le proteine della membrana, inclusi trasportatori, canali e recettori, costituiscono quasi un quarto del proteoma cellulare e oltre la metà degli attuali bersagli farmacologici. Tuttavia, un ostacolo importante alla loro caratterizzazione e sfruttamento in ambienti accademici o industriali è che la maggior parte delle strategie di screening biochimico, biofisico e farmacologico richiedono che queste proteine siano in uno stato solubile in acqua. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato il peptidisc, un mimetico a membrana che offre un approccio "uniforme" al problema della solubilità delle proteine della membrana. Vi presentiamo qui un protocollo semplificato che combina la purificazione delle proteine e la ricostituzione del peptidisco in un'unica fase cromatografica. Questo flusso di lavoro, chiamato PeptiQuick, consente di bypassare la dialisi e l'incubazione con perline di polistirolo, riducendo notevolmente l'esposizione al detersivo, la denaturazione delle proteine e la perdita del campione. Quando PeptiQuick viene eseguito con scaffold biotinylati, la preparazione può essere collegata direttamente alle superfici rivestite di streptavidina. Non c'è bisogno di biotinyare o modificare il bersaglio della proteina della membrana. PeptiQuick è mostrato qui con il recettore della membrana FhuA e la colica liganda antimicrobica M, utilizzando l'interferometria biostrato per determinare la cinetica precisa della loro interazione. Si conclude che PeptiQuick è un modo conveniente per preparare e analizzare le interazioni proteina-ligando della membrana entro un giorno in un ambiente privo di detersivo.

Il recettore della membrana FhuA è espresso in un ceppo E. coli di laboratorio. La frazione di membrana esterna viene raccolta dalla centrifugazione e le proteine sono solubilificate utilizzando un'estrazione del detergente in due fasi. Le proteine della membrana soluluttate vengono caricate su perline di agarose Ni-NTA confezionate in una colonna di plastica, seguite dal flusso di lavoro PeptiQuick presentato nel protocollo. Dopo un controllo di qualità che utilizza la cromatografia a esclusione di dimensioni, le particelle di Biopeptidisc sono immobilizzate su perni rivestiti di streptavidina. L'analisi BLI è condotta per misurare la cinetica delle interazioni tra FhuA e ColM. La panoramica schematica di questo esperimento è presentata nella Figura 1.
Un gel SDS viene eseguito per determinare la qualità della ricostituzione dopo l'eluizione delle particelle FhuA Bio-Peptidisc dalla colonna IMAC (Figura 2). Le frazioni corrispondenti all'inizio, al flusso, agli washe e alle frazioni di eluizione vengono caricate sul gel SDS per valutare il successo del metodo PeptiQuick. L'esaurimento di FhuA nella frazione flowthrough è correlato con un arricchimento nelle frazioni di eluizione, il che indica che la purificazione della proteina è stata efficace. Piccole bande proteiche contaminanti sono osservate nelle frazioni eluite. L'analisi del gel SDS viene utilizzata per determinare quali frazioni devono essere raggruppate prima dell'analisi SEC. Un gel nativo delle particelle FhuA Bio-Peptidisc eluite viene anche eseguito per confermare la solubilità FhuA (Figura supplementare 1). La migrazione della proteina ricostituita nel gel nativo indica la solubilità delle proteine in un ambiente privo di detersivo.
L'analisi SEC viene eseguita per valutare la solubilità delle particelle peptidisco. Il cromatogramma presentato nella Figura 3A mostra un singolo picco simmetrico che si avvicina a circa 14 mL (6 mL oltre il volume vuoto di 8,0 mL sulla filtrazione gel S200 10/300 colonna). La posizione di questo picco, oltre il volume vuoto, conferma la solubilità delle particelle FhuA Bio-Peptidisc. Per riferimento, la figura 3B illustra una preparazione teorica di peptidisco non ottimale. In questo caso, il cromatogramma mostra un picco proteico maggiore eluire al volume vuoto, indicando la presenza di aggregati proteici. Il picco più piccolo elusionare appena oltre il picco peptidisc principale corrisponde a peptidi peptidi eccesso.
L'interazione di FhuA con l'analita ColM viene determinata dopo l'attaccamento dei peptidiscs ai sensori rivestiti streptavidin. Le punte del sensore vengono prima equilibrate nel buffer cinetico, quindi trasferite in tampone contenente i Bio-PeptidiscF FhuA. La concentrazione dei Bio-Peptidi FhuA e il periodo di tempo per il quale vengono incubati con la punta sono ottimizzati prima di questo esperimento (Figura supplementare 1). Seguendo le fasi di caricamento e lavaggio, la fase di associazione misura le interazioni tra le punte caricate e quattro diverse concentrazioni di colica M. Il successivo movimento delle punte nel buffer si traduce in dissociazione, che viene misurata dallo spostamento della lunghezza d'onda della luce bianca che si riflette sulla punta.
Nella figura 4A viene visualizzato l'output del sensorgramma dei dati non elaborati di questo esperimento. Tutte le tracce appaiono uniformi nei passaggi di carico e di base, ad eccezione della traccia di riferimento in giallo. Il suggerimento di riferimento non ha ligando caricato, ma è esposto all'analita per ansay per l'associazione non specifica, che è un importante controllo negativo. Per un'analisi più dettagliata dei risultati, il segnale dal suggerimento di riferimento viene sottratto dalle tracce per le punte sperimentali per tenere conto dell'associazione non specifica. I dati sono allineati all'inizio del passaggio di associazione per consentire un confronto visivo diretto, come illustrato nella Figura 4B. Questo confronto mostra un aumento dello spostamento della lunghezza d'onda per l'aumento delle concentrazioni di colica M. La curva è adatta ai dati e presenta un modello di rilegatura 1:1 classico.
Il grafico di visualizzazione residua (Figura 4B, in basso), che descrive le differenze tra i dati di raccordo e sperimentale, mostra che il raccordo per la più alta concentrazione di ColM (28 nM) è scarso rispetto alle tre concentrazioni inferiori. Il profilo della curva stessa manca dell'altopiano della curva di rilegatura, che è caratteristico della saturazione del sito di rilegatura in un tipico esperimento di rilegatura. La mancanza di altopiano suggerisce un legame eterogeneo, che è probabilmente un artefatto dell'alta concentrazione di ColM. Questa più alta concentrazione di ColM è quindi scontata dall'analisi, e le altre tre concentrazioni vengono utilizzate per determinare la costante di dissociazione (Figura 4C,D). Un test t-testdi uno studente a due code, a un livello di confidenza del 95%, ha rilevato che la costante di dissociazione osservata da questo esperimento non è significativamente diversa dai valori ottenuti utilizzando tecniche diverse (Figura 4E)16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro PeptiQuick mediante biopeptidiscs e analisi BLI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig2a.jpg"> Figura 2: Analisi del gel SDS (12%) di inizio, flusso, lavaggio e frazioni di eluizione raccolte attraverso il flusso di lavoro PeptiQuick. Circa 10 l di campione è stato caricato in ogni corsia e la corsa per 30 min ad una corrente costante di 60 mA. Il gel è stato macchiato di blu Coomassie, destained, e visualizzato su uno scanner di gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig2alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig3a.jpg"> Figura 3: Profili SEC sperimentali e teorici che rappresentano rispettivamente ricostituzioni ottimali e non ottimali. (A) Il profilo sperimentale SEC di PeptiQuick ha ricostituito FhuA (82 kDa) in Bio-Peptidiscs. Le frazioni di eluizione dell'IMAC F3-F7 sono state raggruppate e concentrate utilizzando un concentratore centrifuga di taglio da 30 kDa a 1 mL. Questo campione concentrato è stato iniettato a 0,25 mL/min su una colonna di filtrazione gel S200 (10/300) nel buffer TSG. (B) Profilo teorico SEC di una ricostituzione PeptiQuick non ottimale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig3alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60661/60661fig4d.jpg"> Figura 4: Indagine sulle interazioni ColM con FhuA ricostituita in Bio-Peptidiscs. (A) Sensorgramma sensore di dati grezzi con traccia del sensore di riferimento in giallo. (B, C) In alto: passaggi di associazione e dissociazione con raccordo parziale della curva di rilegatura 1:1. In basso: viste residue che rappresentano la differenza tra dati sperimentali e raccordo computazionale. (C) Ristampa di (B) con l'esclusione della più alta concentrazione di ColM. (D) Tassi di associazione e dissociazione osservati (rispettivamente kon e koff, ) e le costanti di dissociazione (Kd). (E) Confronto delle costanti di dissociazione FhuA-ColM ottenute da peptidisc e BLI (in questo esperimento), termoforesi peptidisc e microscala (Saville, dati inediti) e calorimetria di titore nanodisco e isotermiche16. Le barre di errore rappresentano un SD di incertezza, mentre n.s. non indica alcuna differenza significativa al livello di confidenza del 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661fig4alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>M9 Supporti (per litro)</td>
		</tr>
<tr>
<td>200 mL di sale M9</td>
		</tr>
<tr>
<td>800 mL dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 mL 40% Glucosio</td>
		</tr>
<tr>
<td>80 L L 1 M CaCl2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,5 mL 1 M MgSO4
</td>
		</tr>
<tr>
<td>300 l 15 mg/mL di tiamina</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TSG Buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% Glicerolo</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer di lavaggio IMAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% glicerolo</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.04% LDAO</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM Imidazolo</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione Bio-Peptidisc</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sciogliere il Bio-Peptidisc pronto all'uso (&gt;95% purezza) in sterile dH2O. La concentrazione e il volume della soluzione peptide dipende dal passo nel processo di ricostituzione.</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NOTA: Questo stock di peptidi bio-Peptidisc è stabile a 4 gradi centigradi per oltre un mese.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer di eluzione IMAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% Glicerolo</td>
		</tr>
<tr>
<td>600 mM Imidazolo</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer Cinetica</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM NaCl</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,002% Tween-20</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,1% BSA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette per la preparazione di media e soluzioni.
Supplementari Figura 1: 4%–16% analisi gel nativo chiaro delle frazioni di eluizione raccolte dal flusso di lavoro PeptiQuick. Circa 10 l di campione è stato caricato in ogni corsia e ha funzionato per 40 min ad una corrente costante di 30 mA. Il gel è stato macchiato di coomassie blu, destained, e visualizzato su uno scanner. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa figura.</a>
Figura supplementare 2: Ottimizzazione della concentrazione di ligando utilizzando un singolo perno. (A) Le sei diverse concentrazioni di FhuA in biopeptidisctestato per il legame ad un singolo perno rivestito streptavidin. Questo è stato impostato in una piastra 96 pozzo con buffer nei pozzi tra le concentrazioni di ligando (vedi File supplementare 1 per il protocollo di installazione). (B) Sensorgramma dei dati grezzi per l'esperimento di ottimizzazione del ligando. Il perno dà la risposta più grande e raggiunge inoltre la saturazione al numero di concentrazione 4 (o 2,5 g/mL). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/60661suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa figura.</a>
File supplementare 1. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60661/supplementalfile1.docx" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).</a>

Presentiamo un metodo che combina la purificazione delle proteine della membrana e la ricostituzione in peptidi in un'unica fase cromatografica. Gli scaffold biotinylati vengono utilizzati per l'attaccamento diretto della superficie e la misurazione delle interazioni proteina-ligando tramite interferometria biostrato.

PeptiQuick, un'incorporazione in un solo passaggio di proteine membrana in Peptidiscbio biotinylated per analisi di legame proteico semplificato

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Il metodo classico in cui le proteine di membrana vengono estratte per il loro studio è mediante semplice solubilizzazione in detergente. Mentre questo fornisce un metodo semplice e universale, i detergenti hanno dimostrato di alterare la struttura, la funzione e l'attività nativa di queste proteine sensibili. Qui presentiamo il Peptidisc come una soluzione per stabilizzare le proteine della membrana in soluzione priva di detergenti.Il sistema Peptidisc si adatta spontaneamente alle dimensioni, alla forma e alla tipologia delle proteine della miriade di membrane. Questo è in contrasto con altri mimetici a membrana che spesso richiedono un'ottimizzazione noiosa. FhuA, una proteina della membrana esterna E.coli, sarà utilizzata come proteina bersaglio modello da ricostituire in questo protocollo.Le vescicole della membrana esterna saranno isolate seguite dall'aggiunta di detersivo per solubilizzare le proteine della membrana. Il peptide Peptidisc viene aggiunto alla solubilizzazione e il detergente viene diluito via, formando spontaneamente particelle peptidisce. Queste particelle solubili stabilizzate sono ora disponibili per numerose applicazioni a valle.Questo protocollo esaminerà l'interferometria a strato bio come applicazione della tecnologia Peptidisc. Questo protocollo si concentrerà sul metodo di ricostituzione peptiquick, una tecnica utile che facilita la purificazione simultanea e la ricostituzione delle proteine di membrana. Il metodo PeptiQuick di ricostituzione delle perline viene eseguito in una colonna di gravità Nickel-NTA IMAC standard pre-equilibrata nel detergente.La membrana solubilizzata viene caricata sulla resina e le proteine non bersaglio vengono lavate via. Dopo che questo peptide viene aggiunto alla colonna e il detergente viene diluito rapidamente. Il lato idrofobico del peptide peptidisco si associa alle regioni idrofobiche esposte.Il lato idrofilo del peptide mantiene la proteina solubile in soluzione. Il peptide in eccesso viene lavato via. L'imidazolo viene aggiunto per elute la furia ricostituita.L'impalcatura Peptidisc può essere funzionalizzata per etichettare indirettamente le proteine della memoria e quindi aprire le porte a un insieme più ampio di analisi a valle. Qui sfruttiamo il peptide biotinilato per l'attacco a sensori rivestiti di streptavidina per l'analisi BLI. L'interferometria a strato bio-strato è una potente tecnica senza etichette per indagare le interazioni biomolecolari in soluzione.Oltre a dimostrare semplicemente le interazioni, questa tecnica fornisce una lettura cinetica in tempo reale e consente il calcolo di una costante di dissociazione vincolante. Attraverso questo protocollo, eliminiamo la necessità di detersivo durante l'analisi BLI, in quanto ciò può alterare l'attività. L'interferometria del biostrato analizza il passaggio di interferenza della luce bianca riflessa dal sensore, o punta, e delle macro molecole legate durante un'interazione.Per misurare le interazioni, la punta di senso viene passata tra le soluzioni e il segnale registrato ad ogni passaggio. Ogni suggerimento dà quindi la propria traccia su un sensogramma. Innanzitutto, viene stabilita solo una linea di base del buffer.In secondo luogo, il ligando è legato. In questo caso, FhuA e peptidisc biotinylated legano una punta encoata di streptavidina. Successivamente, la punta viene lavata nel buffer per rimuovere qualsiasi FhuA non associato.Ora la punta viene spostata in una soluzione con una concentrazione nota di alita, qui ColM. Se si verifica un'interazione, questo darà una curva di legame. Infine, la punta viene spostata nel buffer e la dissociazione misurata.I tassi osservati per l'associazione e la dissociazione ad ogni concentrazione di colonna possono essere utilizzati per calcolare la costante di dissociazione. L'esaistidina taggata FhuA è espressa nel ceppo E-coli AW740 per 18 ore nei mezzi amminici. I batteri vengono raccolti per centrifugazione a 5.000 G a 10 minuti a quattro gradi Celsius.Il pellet di cellule risultante viene ri-sospeso nel tampone TSG e quindi dounced per rompere i grumi cellulari e garantire una lisi approfondita. Il TMSF viene aggiunto alle cellule ri-sospese ad una concentrazione finale di un millimolare poco prima della llisi. La llisi cellulare si ottiene con tre passaggi attraverso un microfluidizzatore a 15.000 PSI o una stampa francese a 8.000 PSI.Le cellule liti vengono raccolte e viene eseguita una centrifugazione a bassa velocità a 5.000 G per 10 minuti a quattro gradi. Un supernatante dallo spin a bassa velocità viene caricato in un rotore a ultracentrifugo TI70 e centrifugato a 200.000 G per 40 minuti a quattro gradi per pellettizzare la membrana grezza E.coli. A seguito dell'ultracentrifugazione, il supernatante viene scartato e il pellet di membrana grezzo viene ri-sospeso in una quantità minima di tampone TSG.Una membrana grezza viene sventata per garantirne l'omogeneità. Viene eseguito un saggio di Bradford per controllare la concentrazione proteica della membrana grezza ri-sospesa. Il tampone TSG viene utilizzato per diluire la membrana grezza a circa tre milligrammi per millilitro prima della solubilizzazione.Tritone X-100 viene aggiunto alla membrana grezza ri-sospesa ad una concentrazione finale dell'1% per solubilizzare selettivamente la membrana interna batterica. La solubilizzazione viene eseguita per un'ora a quattro gradi, con un dolce dondolo. La membrana esterna non solubilizzata è isolata per ultracentrifugazione a 200.000 G per 40 minuti, a quattro gradi.Il supernatante risultante contenente la membrana interna solubilizzata viene scartato. Mentre il pellet, contenente la membrana esterna, viene ri-sospeso come prima in TSG. L'LDAO viene aggiunto ad una concentrazione finale dell'1% alla membrana esterna sospesa e solubilizzato per un'ora a quattro gradi.Infine, viene eseguita un'ultracentrifugazione, come in precedenza, al materiale insolubile a pellet. Il supernatante risultante contiene membrana esterna solubilizzata, incluso il nostro bersaglio, il suo FhuA taggato, ora pronto per la purificazione IMAC simultanea e la ricostituzione Peptidisc. Una colonna gravitazionale Nickel-NTA IMAC è pre-equilibrata con due volumi di colonna di tampone di lavaggio IMAC.L'imidazolo viene aggiunto ad una concentrazione finale di cinque millimolare alla membrana esterna solubilizzata, diluita allo 0,04%LDAO. La membrana esterna solubilizzata viene caricata sulla resina Nickel-NTA e il flusso viene raccolto. Questo flusso viene ricaricato sulla resina per aumentare il legame resina di FhuA.Dopo il caricamento, la resina viene lavata con 250 millilitri di tampone di lavaggio IMAC e i primi 50 millilitri raccolti. Dopo il lavaggio, il tampone di lavaggio viene drenato appena sopra l'altezza del letto di resina e il serbatoio della colonna chiuso. Un millilitro di concentrato, 10 milligrammi per millilitro, peptide Peptidisc viene aggiunto alla colonna.Dopo l'aggiunta di peptide concentrato, vengono aggiunti 50 millilitri di diluito, un milligrammo per millilitro, peptide Peptidisc in TSG. La resina viene mescolata per sospendere di nuovo le perline in TSG, sotto il CMC di LDAO, formando così particelle peptidisce. Dopo l'intrappolamento peptidisc, la resina è autorizzata a depositarsi e la soluzione peptidica da un millilitro viene drenato attraverso la resina.La resina viene lavata con 50 millilitri TSG per rimuovere il peptide Peptidisc in eccesso. Infine, le particelle peptidisce vengono diluite con 50 millilitri di imidazolo millimolare in TSG. Vengono raccolte frazioni millilitri e vengono aggiunti 10 microlitri di EDTA molare 0,5, uno ioni di nichel lisciviato leggero chiave.Le frazioni di inizio, flusso, lavaggio ed eluso vengono caricate su un gel SDS del 12% ed elettrofosse per 30 minuti a 60 milliarti. Il gel è colorato e visualizzato su uno scanner di gel. Il gel risultante mostra l'esaurimento di FhuA nel flusso attraverso e l'arricchimento nell'eluizione.Piccole bande contaminanti si osservano anche nelle frazioni eluse. Le frazioni da tre a sette sono selezionate per la cromatografia ad esclusione di dimensioni per confermare la solubilità di FhuA Peptidisc e esaurire i contaminanti. Un concentratore centrifugo tagliato da 30 Kilodome viene utilizzato per concentrare le frazioni da tre a sette.Un millilitro delle frazioni di elusione IMAC raggruppate viene iniettato sulla colonna S200 con una portata di 0,25 millilitri al minuto nel buffer TSG. Vengono raccolte frazioni di millilitro e viene eseguito un gel SDS del 12% delle frazioni. Le frazioni pertinenti sono raggruppate e possono ora essere utilizzate nelle applicazioni downstream.BLI è stato condotto in un ForteBio Octet RED96. Questo strumento sposta i perni BLI su una piastra da 96 pozzetti che viene impostata per la prima volta a mano. Tutti i pozzi sono riempiti con un volume finale di 200 microlitri.La prima colonna è caricata con buffer cinetico per consentire alle punte di equilibrare e formare un segnale di base. La colonna due viene caricata con una concentrazione predeterminate del ligando e del buffer cinetico. In questo caso, FhuA è il ligando e viene aggiunto alla concentrazione di 2,5 microgrammi per millilitro.Il suggerimento nella riga E verrà utilizzato come riferimento ed è caricato solo con buffer. La colonna tre è caricata con tampone cinetico per lavare l'FhuA in eccesso dalla punta. Due volte le diluizioni seriali dell'alita, in questo caso ColM, vengono caricate dall'alto verso il basso nella colonna quattro.La più alta di queste concentrazioni viene utilizzata per la riga di riferimento, per misurare il legame non specifico dell'alita alla punta. La colonna cinque viene caricata con buffer. Qui, il ColM si dissocia, e la dissociazione misurata.Una volta preparata la piastra, il vassoio della punta del sensore e la piastra preparata vengono caricati nello strumento BLI. Viene aperto il software di acquisizione dati BLI e viene avviato un nuovo esperimento cinetico. La scheda Definizione piastra viene utilizzata per inserire il layout della piastra da 96 pozzi nel software.Qui il ligando FhuA viene inserito come carico mentre l'alyte ColM viene inserito come campione. La scheda Definizione saggio viene utilizzata per definire il periodo di tempo e la velocità di rotazione della piastra per ogni fase dell'esperimento. Qui includiamo un passaggio di base di 60 secondi, seguito da un passaggio di caricamento di 250 secondi, un secondo passaggio di base di 300 secondi, un passaggio di associazione di aliti di 450 secondi e infine un passaggio di dissociazione di 900 secondi.Questi passaggi vengono assegnati singolarmente a ciascuna colonna della piastra da 96 po', selezionando il passo desiderato e facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'Add Assay su ogni colonna. La scheda di assegnazione del sensore viene utilizzata per garantire che lo strumento Octet prelevi i perni BLI dalla posizione corretta nel vassoio del sensore. La scheda Rivedi esperimento fornisce una panoramica finale dell'esperimento, prima dell'esecuzione.BLI sarà ora effettuata dall'Octet RED. Questo produrrà un sensogramma di dati grezzi per l'analisi. L'analisi viene eseguita aprendo prima il software di analisi dei dati anagrafici Octet.La scheda Selezione dati viene utilizzata per individuare l'esperimento e controllare il riepilogo sperimentale. Le concentrazioni dell'alita ColM sono immesse qui. Successivamente, la scheda Elaborazione viene utilizzata per sottrarre il segnale di riferimento dai dati sperimentali.La linea di base è definita per allineare l'asse Y come se fosse stata applicata la velocità di des lega. Infine, viene selezionata l'opzione Elabora dati. I dati vengono isolati per questo esperimento ed è selezionata l'opzione Adatta curve.Viene scelto un raccordo parziale di associazione e curva di dissociazione. Il Kd viene calcolato da questo raccordo. Il cromatogramma di esclusione delle dimensioni viene utilizzato per convalidare la ricostituzione dell'ambulante.Il cromatogramma mostra un singolo picco simmetrico, suggerendo una preparazione proteica monodispersa. Il picco eluisce diversi millilitri dopo il volume del vuoto, indicando particelle peptidisce solubili non aggregate. Gli aggregati proteici eluiranno al volume vuoto, mentre i detergenti in eccesso e il peptide eluiranno dopo il picco principale.L'aumento del lavaggio dei Peptidisc formati mentre è ancora attaccato alle perline Nickel-NTA dovrebbe esaurire quest'ultimo picco. Gli aggregati proteici sono spesso il risultato dell'esposizione delle proteine di memoria alla soluzione priva di detergenti prima della ricostituzione. Quest'ultimo cromatogramma di esclusione è una diagnostica utile per la risoluzione dei problemi relativi alla ricostituzione.Dopo l'elaborazione dei dati sperimentali, una curva è adatta al sensogramma. L'accuratezza di questo raccordo è essenziale per il calcolo della costante di dissociazione. Il plottaggio della vista residua descrive la differenza tra i dati sperimentali e il raccordo computazionale.Ciò dimostra che per le quattro diverse concentrazioni di colonna tre delle curve si adattano bene. Tuttavia, per la concentrazione più alta la curva non produce una buona vestibilità. Ciò suggerisce che a questa maggiore concentrazione, c'è un legame eterogeneo della colonna al perno.Questo segnale di massima concentrazione non è quindi incluso nell'analisi cinetica come da note applicative ForteBio. Le restanti tre curve vengono utilizzate per l'analisi cinetica. Una costante di dissociazione tra FhuA e ColM, determinata utilizzando il metodo BLI e Peptidisc, è coerente con le costanti determinate con altri metodi.La calorimetria isotermica e i nanodisci, la termoforesi su microscala e il Peptidisco hanno prodotto costanti di dissociazione non significativamente diverse dal nostro valore determinato. Questa coerenza convalida il metodo Peptidisc BLI per misurare la cinetica di interazione. Va bene, quindi, dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia acquisito una comprensione pratica della forza e dell'avvertenza dei metodi PeptiQuick.Abbiamo trovato questo metodo particolarmente utile per quantificare l'interazione FhuA ColM in completa assenza di detergenti. E sospettiamo che lo stesso flusso di lavoro possa essere applicato per caratterizzare qualsiasi altra interazione recettore-ligando. Buona fortuna per i tuoi esperimenti.

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