Name: Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Impara a isolare arteriole e capillari dall'ippocampo di topo per studiare la segnalazione vascolare ex vivo. Questa tecnica consente analisi di miografia pressoria e immunofluorescenza senza interferenze tessutali.

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Gli autori desiderano ringraziare Jules Morin per commenti approfonditi sul manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dai premi dell'organizzazione non-profit CADASIL Together We Have Hope, del Center for Women's Health and Research e della NHLBI R01HL136636 (FD).

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus e sono stati eseguiti secondo le linee guida del National Institutes of Health.
1. Soluzioni
<ol><li>Utilizzare la salina tampone MOPS per la dissezione e conservare i campioni a 4 gradi centigradi prima del loro utilizzo. Non gas la soluzione. Preparare la salina tamponata tamponata MOPS con la seguente composizione: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO2, 1 mM MgMgMG CaCl2, 5 mM di glucosio, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM di pirama, 10 album di siero bovino mg/mL, pH 7.3.</li>
	<li>Utilizzare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) come soluzione di bagno e pipetta. Gas sia aCSF che Ca2 -freeaCSF con 5% CO2, 20% O2e N2 equilibrio. Preparare la soluzione con la seguente composizione: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM di glucosio, 2 mM CaCl2, pH 7.3 (con aerazione con 5% CO2, 20% O2e N2 equilibrio).</li>
	<li>Ottenere la dilatazione massima in aCSF nominalmente Ca2o-free (0 mM [Ca2 )o, 5 mM EGTA).</li>
</ol>2. Preparazione della camera dell'organo
<ol><li>Inserire capillari di vetro borosilicato (diametro esterno 1,2 mm; diametro interno di 0,69 mm; lunghezza 10 cm) in un estraente di vetro. Tirare il capillare per fare una punta lunga e sottile ad un'estremità.</li>
	<li>Da un lato della camera, aggiungere una cannula che può collegarsi a una pompa peristaltica in miniatura per pressurizzare la nave. Sotto un microscopio a dissezione, rompere la punta della cannula in modo che sia abbastanza piccola da adattarsi al vaso di interesse, ma abbastanza grande da consentire alle soluzioni di fluire attraverso la punta. Assicurarsi che la punta sia di circa 10-15 m di diametro.</li>
	<li>Riempire la cannula con una siringa con un filtro da 0,22 m allegato con aCSF ossigenato. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria o detriti nella cannula.</li>
	<li>Aggiungere altre due cannule sul lato opposto della camera. Non rompere le loro punte.</li>
</ol>3. Dissezione e isolamento dell'ippocampo
<ol><li>Eutanasia e decapitare un topo. Per questo esperimento, usa un topo C57BL6/J di 8 settimane per confrontare le differenze tra maschi e femmine. Iniettare il mouse con pentobarbital e decapitare con forbici chirurgiche.</li>
	<li>Utilizzando piccole forbici dissezione, tagliare la pelle lungo la linea mediana nella parte superiore della testa. Spostare la pelle ai lati.</li>
	<li>Partendo dal lato caudale del cranio, tagliare il cranio lungo la linea mediana fino a raggiungere i bulbi olfattivi. Rimuovere parti del cranio fino a quando il cervello è esposto.</li>
	<li>Rimuovere lentamente il cervello, iniziando vicino al naso del mouse. Separare il cervello dai bulbi olfattivi, nervi cranici e midollo spinale tagliando le strutture con le piccole forbici dissezione.</li>
	<li>Posizionare il cervello in una piastra di dissezione con soluzione MOPS sufficiente per sommergerlo completamente. Utilizzando un microscopio di dissezione, posizionare il cervello al centro della piastra di dissezione con il lato ventrale rivolto verso il basso.</li>
	<li>Usando una lama di rasoio, tagliare il cervello a metà lungo la fessura longitudinale. Tenere la lama in modo che il bordo tagliente sia parallelo al fondo della piastra di dissezione. Premere la lama attraverso il cervello in un colpo solo. Spostare un emisfero sul lato della piastra.</li>
	<li>Eseguire la procedura seguente per ogni emisfero separatamente o in parallelo.<ol>
<li>Posizionare un emisfero al centro della piastra in modo che la linea mediana sia rivolta verso il basso. Quindi utilizzare la lama del rasoio per tagliare lungo la fessura trasversale per rimuovere il cervelletto e il tronco encefalico. Spingere la lama dritto attraverso il tessuto.</li>
		<li>Ruotare l'emisfero in modo che il lato mediale sia rivolto verso l'alto (Figura 1A). Utilizzare una spatola per tenere il cervello in posizione. Utilizzando una seconda spatola, inserire la punta sotto il corpo callosum e scoop sotto per rimuovere il talamo, il setto e l'ipotalamo, coprendo l'ippocampo (Figura 1B).</li>
		<li>Assicurarsi che l'ippocampo sia ora visibile come struttura curva vicino al lato posteriore del cervello. Utilizzando una spatola per tenere il cervello in posizione, utilizzare la seconda spatola per scoop l'ippocampo fuori dal cervello (Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire gli ippocampi su una nuova piastra di dissezione riempita circa a metà con soluzione MOPS. Scarta il resto del cervello.</li>
</ol>4. Isolamento dell'arteriosa ippocampale
<ol><li>Completa i seguenti passaggi per ogni ippocampo.<ol>
<li>Pin down uno degli ippocampi utilizzando piccoli perni ad ogni estremità della sezione. L'arteria ippocampale è rivolta verso l'alto.</li>
		<li>Utilizzando pinze molto affilate, allungare delicatamente piccole sezioni dell'ippocampo. Questo allenta il tessuto che circonda le arteriole, rendendo più facile sezionarli.</li>
		<li>Ricerca attraverso il tessuto ippocampale dorsale per identificare l'arteria trasversale esterna (Figura 1C)16,27.</li>
		<li>Afferrare delicatamente l'arteria trasversale esterna e allontanarla lentamente dal tessuto per raccogliere gli arterioli e i capillari che perfondela noto nella regione CA3 dell'ippocampo.</li>
		<li>Una volta che non ci sono più vasi da rimuovere dal tessuto, scartare gli ippocampi. Tenere le navi sul ghiaccio nei piatti mentre non sono in uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Cannolazione arteriola capillare-parenchimale ippocampale-parenchimale
<ol><li>Trova un'arteriole con un ramo che termina con i capillari. Trasferirlo alla camera dell'organo. Assicurarsi che l'arteriole sia di circa 15-30 m quando è completamente dilatata (Figura 1D).</li>
	<li>Montare con attenzione il vaso sanguigno spingendo la punta della cannula attraverso la parete arteriosa sotto l'area bersaglio. Far scorrere con attenzione il vaso sulla cannula fino a quando non c'è abbastanza tessuto per posizionare la cravatta.</li>
	<li>Fare un nodo sciolto con suture di nylon 12-0 in modo che si adatti sopra il vaso sanguigno e cannula. Utilizzare un nodo di mezzo autostop per fissare le cravatte. Quindi tirare le estremità per stringere il nodo e fissare l'arteriola alla cannula. Rimuovere eventuali rami estranei del recipiente sotto la cravatta tirandoli delicatamente con pinze.</li>
	<li>Fare un altro legame e fissarlo sull'altra estremità dell'arteriolo per sigillarlo.</li>
	<li>Abbassare la cannula con il recipiente attaccato fino a quando non è piatta contro il coperchio sul fondo della camera. Fare attenzione a non abbassare troppo la cannula o si romperà.</li>
	<li>Utilizzando una cannula sul lato opposto della camera, abbassarla in modo che il punto di esso appunti la cravatta all'estremità dell'arteriole.</li>
	<li>Utilizzare la terza cannula per pin giù il ramo capillare alla vela. Posizionare la punta vicino all'estremità del ramo lasciando le estremità dei capillari esposti (non sotto la cannula).</li>
</ol>6. Mitologia a pressione
<ol><li>Spostare la camera dal mirino di dissezione al microscopio con il software di registrazione.</li>
	<li>Collegare il tubo di afflusso e di flusso alla camera per la perfusione. Avviare la perfusione con aCSF riscaldato (37 gradi centigradi) ad una portata di 4 mL/min.</li>
	<li>Attaccare la cannula pressurizzante a una pompa peristale abbinata a un trasduttore di pressione e portare la pressione interna a 20 mm Hg.</li>
	<li>Avviare il software di registrazione. Regolare il microscopio e le impostazioni di imaging per ottenere l'immagine più chiara possibile. Avviare la registrazione una volta che le impostazioni sono ottimizzate per il software di rilevamento.</li>
	<li>Aumentare la pressione del recipiente fino a 40 mm Hg durante la registrazione del diametro arterioso con un software di rilevamento dei bordi.</li>
	<li>Lasciare che 15-20 min per lavare la soluzione MOPS fuori dalla camera con aCSF, e lasciare che la preparazione HiCaPA per eclessia e sviluppi tono miogenico.</li>
	<li>Per verificare la fattibilità di un recipiente, applicare la soluzione NS309 di 1 M alla perfusione del bagno (vedere la figura 2A, B e la sezione Risultati rappresentativi). Il segmento arteriolare deve dilatarsi, dimostrando circa il 30-40% di tono miogenico come descritto in precedenza3,14,20.</li>
</ol>7. Stimolazione focale delle estremità capillari
<ol><li>Una volta stabilito il tono di base per l'arteriole e valutata la funzione endoteliale, verificare la risposta della stimolazione capillare.</li>
	<li>Utilizzando un tiratore di vetro, fare cannulas in modo che ci sia un punto fine ad una estremità. Rompere la punta di una cannula in modo che il farmaco testato possa fluire attraverso la punta senza problemi a 5 psi.</li>
	<li>Riempire la cannula con la soluzione farmacologica di interesse e aggiungerla a un micromanipolatore a 3 assi collegato al microscopio. Collegare il tubo dal sistema di espulsione della pressione alla cannula.</li>
	<li>Abbassare lentamente la cannula nel bagno vicino ai capillari, facendo attenzione a non colpire alcuna parte della nave o dell'hardware nella camera. Manovra la punta della cannula accanto alle estremità dei capillari senza toccarli. Tenere la punta della cannula appena fuori dal coperchio per evitare che la nave venga stimolata in caso di perdite di cannula.</li>
	<li>Quando si è pronti a stimolare i capillari, abbassare la cannula alla coverslip e proprio accanto ai capillari. Attivare il sistema di espulsione della pressione con il tempo di espulsione desiderato (qui 20 s). Una volta terminata la stimolazione, sollevare leggermente la cannula per evitare ulteriori stimolazioni.</li>
	<li>Ripetere la stimolazione in base alle esigenze. Cambiare la cannula del sistema di espulsione della pressione per testare diversi composti farmacologici.</li>
	<li>Per confermare che solo i capillari vengono stimolati, riempire la cannula con 1 soluzione NS309 m e ripetere i passaggi precedenti. NOTA: Le cellule endoteliali capillari non esprimono i canali Ke attivati da NS309, quindi l'arteriosa non deve rispondere alla stimolazione. Se l'arteriola si dilata, la cannula dovrà essere riposizionata o il diametro del foro dovrà essere più piccolo (vedere Figura 2A, B e la sezione Risultati rappresentativi).</li>
</ol>

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<li>Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Cannulation+of+Cerebral+Parenchymal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).</li>
<li>Bayliss, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+local+reactions+of+the+arterial+wall+to+changes+of+internal+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure.</a> The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).</li>
<li>Montagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+the+aging+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus.</a> Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+heparin+oligosaccharides+rapidly+target+the+hippocampus+in+sepsis%2C+potentially+impacting+cognitive+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La preparazione pressurizzata HiCaPA (ippocampo capillary-parenchymal arteriole) descritta nel presente manoscritto è un'estensione della nostra procedura consolidata per isolare, pressurizzare e studiare arteriole parenchymal29. Recentemente abbiamo riferito che Kir2.1 canali in cervello capillare cellule endoteliali senso aumenta in [K]o associato con l'attivazione neurale, e generare un segnale iperpolarizzante ascendente che dilata arterioles a monte20</...

La circolazione pial sulla superficie del cervello è stata oggetto di molti studi, in parte a causa della sua accessibilità sperimentale. Tuttavia, la topologia della vascolatura cerebrale crea regioni distinte. In contrasto con la solida rete di pial ricca di anastomosi con notevole capacità di reindirizzare il flusso sanguigno, le arteriole parenchimale intracerebrali (PA) presentano un approvvigionamento collaterale limitato, ognuno dei quali perfonde un volume discreto di tessuto nervoso1,2. Questo crea un effetto di collo di bottiglia sul flusso sanguigno che, combinato con caratteristiche fisiologiche uniche3,4,5,6,7,8, rende arteriole intracerebrali un sito cruciale per la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF)9,10. Nonostante le sfide tecniche inerenti all'isolamento e alla cannosazione delle PA, l'ultimo decennio ha visto un crescente interesse per gli studi ex-vivo utilizzando navi pressurizzate11,12,13,14,15,16,17. Uno dei motivi di questo maggiore interesse è il notevole sforzo di ricerca condotto sull'accoppiamento neurovascolare (NVC), il meccanismo che sostiene l'iperemia funzionale del cervello18.
A livello regionale, CBF può aumentare rapidamente a seguito di attivazione neurale locale19. I meccanismi cellulari e le proprietà di segnalazione che controllano la NVC sono incompleti. Tuttavia, abbiamo identificato un ruolo precedentemente imprevisto per i capillari cerebrali durante NVC nel percepire l'attività neurale e tradurla in un segnale elettrico iperpolarizzante per dilatare arteriolea a monte20,21,22. Potenziale di azione23,24 e l'apertura di grande conduttanza Ca2 ,attivato K(BK) canali sui piedi di posta astrociti25,26 aumentare la concentrazione di ioni di potassio interstiziale [K]o, che si traduce in attivazione di forte rettificatore interiore K(Kir) canali nell'endotelio vascolare dei capillari. Questo canale è attivato da Kesterno, ma anche dall'iperpolarizzazione stessa. Diffondendosi attraverso giunzioni gap, la corrente iperpolarizzante poi si rigenera in cellule endoteliali capillari adiacenti fino all'arteriolo, dove provoca il rilassamento del miocito e l'aumento della CBF20,21. Lo studio di questo meccanismo ci ha portato a sviluppare una preparazione capillare-parenchymal arteriola (CaPA) pressurizzata per misurare il diametro arteriolare durante la stimolazione capillare con agenti vasoattivi. La preparazione CaPA è composta da un segmento di arteriole intracerebrale cannulato con una ramificazione capillare intatta a valle. Le estremità capillari sono compresse sul fondo del vetro della camera da una micropipetta, che occia e stabilizza l'intera formazione vascolare20,21.
In precedenza abbiamo fatto innovazioni strumentali da imaging Preparati CaPA dalla corteccia del topo20,21 e arteriole dal ratto amigdala13 e ippocampo16,17. Poiché la vascolatura dell'ippocampa riceve maggiore attenzione a causa della sua suscettibilità alle condizioni patologiche, qui forniamo un metodo passo-passo per la preparazione del CaPA dall'ippocampo del topo (HiCaPA) che può essere utilizzato non solo negli studi funzionali NVC, ma anche nella biologia molecolare, nell'immunochimica e nell'elettrofisiologia.

<table><tbody><tr><td>0,22&micro; m Filtri per siringhe</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229751</td><td></td></tr><tr><td>12-0 Nylon (12cm) Nero</td><td>Strumenti per microchirurgia, Inc</td><td>S12-0 NYLON</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura automatico</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato D.E.: 1,2 mm, D.I.D.: 0,68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale di dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ11</td><td></td></tr><tr><td>ECOLINE VC-MS/CA 4-12 - pompa completa con azionamento e testa della pompa MS/CA 4-12</td><td>Ismatec</td><td>ISM 1090</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Scaldabagno in linea</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Integra&trade; Milite&commercio; Pinze per tessuti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>ML 133 cloridrato</td><td>Tocris</td><td>4549</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>NS309</td><td>Tocris</td><td>3895</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III - Sistemi di erogazione per microiniezione intracellulare,</td> servocontrollore di pressione <td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td></td>a 2 canali</tr><tr><td>con pompa peristaltica</td> Living <td>Systems Strumentazione</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td> <td>super finiForbici chirurgiche Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp-Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore verticale per micropipette</td><td>Narishige</td><td>PP-83</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo pressurizzato ippocampo capillary-parenchymal arteriole preparazione per lo studio funzionale

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

Dalle sottili alterazioni comportamentali alla demenza in fase avanzata, il danno vascolare si sviluppa in genere a seguito di ischemia cerebrale. L'ictus e l'arresto cardiaco sono malattie sessualmente dimorfiche, ed entrambi inducono l'ischemia cerebrale. Tuttavia, i progressi nella comprensione del danno vascolare vascolare, e quindi nello sviluppo di trattamenti specifici per il sesso, sono stati in parte limitati dalle sfide nello studio della microcircolazione cerebrale dai modelli murini negli studi funzionali. Qui, presentiamo un approccio per esaminare la segnalazione capillary-to-arteriola in una preparazione capillary-ppillaryle capillary-parenchymic (HiCaPA) ex vivo ippocampale -parenchymal (HiCaPA) dal cervello di topo. Descriviamo come isolare, cannulare e pressurizzare la microcircolazione per misurare il diametro arteriolare in risposta alla stimolazione capillare. Mostriamo quali controlli funzionali appropriati possono essere utilizzati per convalidare l'integrità di preparazione HiCaPA e visualizzare risultati tipici, tra cui il test del potassio come agente di accoppiamento neurovascolare e l'effetto dell'inibitore recentemente caratterizzato della famiglia di canali di potassio rettificante interno Kir2, ML133. Inoltre, confrontiamo le risposte nei preparati vinti da topi maschi e femmine. Mentre questi dati riflettono le indagini funzionali, il nostro approccio può essere utilizzato anche negli studi di biologia molecolare, immunochimica ed elettrofisiologia.

Icanali diconducono conduzione endoteliale di piccole endoterie (SK) e di conduzione intermedia (IK) Ca2,sensibili a K, esercitano un'influenza dilatoria sul diametro delle PA. L'applicazione del bagno di 1 -M NS309, un agonista sintetico IK e SK canale, causato dilatazione quasi massima (Figura 2A,B). Tuttavia, le cellule endoteliali capillari mancano di canali IK e SK e non hanno iperpolarizzato in risposta a NS309<sup...

Il presente manoscritto descrive come isolare le arteriole e i capillari ippocampali dal cervello del topo e come pressurizzarli per la miografia a pressione, l'immunofluorescenza, la biochimica e gli studi molecolari.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Il nostro metodo consente lo studio dei vasi sanguigni situati in strutture che altrimenti sarebbero difficili da immaginare in Vivo, come l'ippocampo. Poiché i vasi sanguigni vengono rimossi dal tessuto cerebrale, la segnalazione tra i capillari e l'arteriola può essere studiata senza effetti fuori bersaglio sul tessuto circostante. Per isolare l'ippocampo, utilizzare piccole forbici di dissezione per tagliare la pelle lungo la linea mediana nella parte superiore della testa del mouse e spostare la pelle ai lati.Partendo dal lato caudale del cranio, tagliare il cranio lungo la linea mediana fino a raggiungere i bulbi olfattivi e rimuovere porzioni del cranio fino a quando il cerebro non viene esposto. Iniziando vicino al naso del topo, rimuovere lentamente il cervello, usando le forbici per tagliare i bulbi olfattivi, i nervi cranici e il midollo spinale. Immergere il cervello, il lato ventrale verso il basso nella salina tamponata MOPS, al centro di una piastra di dissezione, e posizionare la piastra sotto un microscopio a dissezione.Tenendo il bordo affilato parallelo al fondo del piatto, utilizzare la lama del rasoio per tagliare il cervello a metà lungo la fessura longitudinale in un colpo solo. Posizionare un emisfero al centro della piastra con la linea mediana rivolta verso il basso e spingere la lama del rasoio direttamente attraverso il tessuto lungo la fessura trasversale per rimuovere il cervelletto e il tronco encefalico. Ruotare l'emisfero in modo che il lato mediale sia rivolto verso l'alto e utilizzare una spatola per tenere il cervello in posizione.Inserire la punta di una seconda spatola sotto il corpo calloso, raccogliendo sotto il tessuto per rimuovere il talamo, il setto e l'ipotalamo dall'ippocampo. L'ippocampo dovrebbe ora essere visibile come una struttura curva vicino al lato posteriore del cerebro. Usando una spatola per tenere il cerebro in posizione, usa la seconda spatola per raccogliere l'ippocampo dal cerebro.Quindi trasferire gli ippocampi in una nuova piastra di dissezione, riempita circa a metà strada con una fresca soluzione di MOP. Per l'isolamento dell'arteriolo ippocampale, posizionare piccoli perni ad ogni estremità di un ippocampo per fissare il lato dell'arteria ippocampale campione verso l'alto. Utilizzando forcelle molto affilate, allungare delicatamente piccole sezioni degli ippocampi per allentare il tessuto che circonda le arteriole.E cerca attraverso i tessuti ippocampali dorsali per identificare le arterie trasversali esterne. Quando l'arteria è stata localizzata, afferrare l'arteria trasversale esterna dall'ippocampo e allontanarla lentamente dal tessuto per raccogliere le arteriole e i capillari. L'arteria di ogni ippocampo viene rimossa separatamente.Quando non ci sono più vasi da rimuovere, posizionare i campioni sul ghiaccio e scartare il tessuto ippocampale rimanente. Per la cannulazione delle arteriole, individuare e arteriolare con un ramo che termina con i capillari e posizionare l'arteriola in una camera d'organo. Spingere con attenzione la punta della cannula attraverso la parete dell'arteriola sotto l'area bersaglio per montare il vaso sanguigno.Quindi, far scorrere attentamente il vaso sulla cannula fino a quando non c'è abbastanza tessuto su cui posizionare la cravatta. Utilizzare 12-0 suture di nylon per creare un nodo sciolto che si adatta al vaso sanguigno e alla cannula e utilizzare un nodo mezzo intoppo per fissare le cravatte, tirare le estremità per stringere il nodo per fissare l'arteriola alla cannula. Fissare un'altra cravatta sull'altra estremità dell'arteriola per sigillarla.Sul lato opposto della camera, abbassare una seconda cannula fino a quando il punto della cannula fissa la cravatta all'estremità dell'arteriola. Quindi utilizzare una terza cannula per fissare il ramo capillare al coverslip, posizionando la punta vicino all'estremità del ramo, lasciando esposte le estremità dei capillari. Poiché il microcircolo cerebrale è squisitamente fragile, assicurati di ridurre al minimo lo stiramento e la movimentazione dei vasi durante la procedura di cannulazione per garantire la sopravvivenza delle arteriole.Per l'analisi della miografia a pressione, trasferire la camera su uno stadio di microscopio luminoso con software di registrazione e collegare i tubi di afflusso e deflusso alla camera per la profusione. Iniziare la profusione con 37 gradi Celsius Liquido cerebrospinale artificiale a una portata di quattro millilitri al minuto e attaccare la cannula pressante alla pompa peristaltica abbinata a un trasduttore di pressione. Portare la pressione interna a 20 millimetri di Mercurio e avviare il software di registrazione.Regola il microscopio e le impostazioni dell'immagine per ottenere l'immagine più chiara possibile. E utilizzare il software Edge Detection per verificare che l'arteriola sia di circa 15-30 micrometri di diametro quando è completamente dilatata. Una volta ottimizzate le impostazioni, iniziare la registrazione e aumentare la pressione intravascolare nel recipiente fino a 40 millimetri di Mercurio, registrando il diametro dell'arteriola con il software Edge Detection.Quindi abbondante la camera per 15-20 minuti per lavare la soluzione MOP. Per testare la vitalità del recipiente, applicare una soluzione micromolare NS309 alla profusione del bagno, il segmento arteriolare deve dilatarsi, dimostrando un tono miogenico dal 30 al 40%. Una volta stabilito il tono di base per l'arteriola, utilizzare un estrattore di vetro per fare cannule con un punto fine ad un'estremità e utilizzare le forcep per rompere la punta di ogni cannula, in modo che il farmaco di interesse possa fluire senza intoppi attraverso la punta a cinque libbre di pressione per pollice quadrato.Riempi la cannula con il farmaco di interesse. E caricare la cannula su un micromanipolatore a tre assi attaccato al microscopio. Collegare il tubo dal sistema di espulsione della pressione alla cannula e abbassare lentamente la cannula nel bagno vicino ai capillari, facendo attenzione a non colpire nessuna parte del recipiente o della camera.Per stimolare i capillari, abbassare la cannula al coverslip appena accanto ai capillari e attivare il sistema di espulsione della pressione con il tempo di espulsione desiderato. Alla fine della stimolazione, sollevare leggermente la cannula per evitare ulteriori stimolazioni. Per confermare che venivano stimolati solo i capillari, riempire la nuova cannula con un micromolare di soluzione NS309 e stimolare i capillari come dimostrato.Quindi ottenere la vasodilatazione massima bagnando la preparazione con la soluzione senza calcio. L'applicazione a bagno di un micromolare NS309 provoca una dilatazione quasi massima dell'arteriola a causa dei canali del potassio sensibili al calcio nell'endotelio. Le cellule endoteliali capillari, tuttavia, mancano di canali di conduttanza intermedi e piccoli e non iperpolarizzano in risposta all'agonista, di conseguenza, stimolando le estremità capillari con NS309, non causano dilatazione arteriolare a monte, questo indica che NS309 non ha raggiunto l'arteriola, e può essere utilizzato come controllo per accedere alla restrizione smoziale del composto applicato sui capillari per espulsione di pressione.Utilizzando la preparazione dell'arteriola parenchimica capillare ippocampale come dimostrato, l'applicazione di un fluido cerebrospinale artificiale integrato con 10 millimolare potassio alle estremità capillari, si traduce in una dilatazione arteriolare a monte che non differisce tra preparati di topi maschi e femmine. Inoltre, l'aggiunta dell'inibitore kir2 ML 133, abolisce virtualmente la dilatazione arteriolare indotta capillarmente, in risposta al potassio millimolare 10 nei preparati di topi maschi e femmine. Quando si monta il vesssel sanguigno, limitare le interazioni dirette con il vaso sanguigno per ridurre al minimo il danno e aumentare la vitalità del vaso.Una volta che il vaso sanguigno è stato isolato, diversi composti farmacologici possono essere testati o il vaso sanguigno può essere ulteriormente elaborato per studi di biologia olecolare, immunochimica o elettrofisiologia.

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Un protocollo per culture fetta organotipica entorhino-ippocampale, che permette di riprodurre molti aspetti della lesione cerebrale ischemico, è presentato. Studiando cambiamenti del neurovasculature in aggiunta ai cambiamenti nei neuroni, questo protocollo è uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l'infortunio.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Questo articolo descrive un metodo con cui l'architettura vascolare nel cervello può essere quantificata utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo ed ex vivo.

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Questo manoscritto descrive un protocollo semplice e riproducibile per l'isolamento delle arteriole intracerebrali (un gruppo di vasi sanguigni che comprende arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari) dai topi, da utilizzare in miografia a pressione, immunofluorescenza, biochimica e studi molecolari.

Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Mentre l'imaging multifotone è efficace solo a profondità limitate dalla superficie del tessuto, è possibile ottenere immagini con risoluzione di 3 μm a qualsiasi profondità tramite pCLE. Qui, presentiamo un protocollo per condurre l'imaging pCLE per misurare la dinamica microvascolare nell'ippocampo di topi ictali e wild-type.

Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Presentiamo un metodo che può fornire ulteriori approfondimenti i primi eventi sottostante neurodegenerazione e basato sulla tecnica del cervello stabilito ex vivo , unendo i vantaggi degli esperimenti in vivo e in vitro . Inoltre, rappresenta un'opportunità unica per un confronto diretto del gruppo trattata e non trattata sullo stesso piano anatomico.

Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo

Questo manoscritto descrive un semplice protocollo per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi myography elettrofisiologici, imaging e pressione del calcio.

Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo

L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca2+] e di membrana.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall'ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.

Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

Impara a isolare arteriole e capillari dall'ippocampo di topo per studiare la segnalazione vascolare ex vivo. Questa tecnica consente analisi di miografia pressoria e immunofluorescenza senza interferenze tessutali.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

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