Name: Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per linfezione da parassiti di Protozoi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri il metodo per isolare contemporaneamente astrociti e microglia primari da cortici di topi neonati. Questo protocollo consente studi comparativi sulle risposte gliali alle infezioni da parassiti protozoi nel sistema nervoso centrale.

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Ringraziamo il professor Renato A. Mortara dell'Università Federale di San Paolo (UNIFESP) per mAb 2C2 anti-Ssp-4. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Fundao de Amparo à Pesquisa do Estado de San Paolo (FAPESP, sovvenzione 2017/25942-0 a K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient'fico e Tecnol'gico (CNPq, 402100/2016-6 a K.R.B.), Instituto Nacional de Ciància e De Vacinas (INCTV/CNPq) e Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de N'vel Superior (CAPES, Codice Finanza 001). M.P.A. riceve una borsa di studio da CNPq, A.L.O.P. riceve borse di studio da CAPES, e I.S.F e L.M.F.B. riceve borse di studio da FAPESP.

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità alla legge nazionale brasiliana (11.794/2008) e approvate dai Comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Federale di San Paolo (UNIFESP).
1. Estrazione, manutenzione e dissociazione delle cellule gliali
NOTA: Il numero di topi utilizzati per l'estrazione delle cellule gliali dipende dalla quantità di cellule necessarie per eseguire gli esperimenti desiderati. In questo protocollo, un totale di 2,7 x 107 astrociti e 4 x 106 microglia sono stati ottenuti da sei topi neoiatiC57BL/6. Tutte le procedure sono state eseguite in condizioni sterili in un mobile di biosicurezza di classe II.
<ol><li>Giorno 1
	<ol>
<li>Preparare la soluzione di sale equilibrato di Hank puro (HBSS) e HBSS - 10% del siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) (vedere Tabella dei materiali).</li>
		<li>Preparare il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS - 0,08 mM Penicillin , 0,09 mM Streptomycin , 12,5 mM HEPES , 30 mM di bicarbonato di sodio, pH 7,2) e filtrarlo con un filtro da0,22 m (cfr. NOTA: Tutti i supporti di coltura devono essere conservati a 4 gradi centigradi, ma è necessario preriscaldarli a 37 gradi centigradi per 20 min prima di iniziare l'esperimento.</li>
		<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (forbici, spatole e pinzette) in un'autoclave e utilizzare il 70% di etanolo durante la procedura.</li>
		<li>Mettere i neonati (fino a 3 giorni) topi in una camera sigillata contenente cotone imbevuto di isoflurane per 5 min per l'anestesia profonda.</li>
		<li>Spruzzare il cucciolo di topo con il 70% di etanolo e decapitare l'animale con le forbici.</li>
		<li>Fare taglio sagittale (posteriore a anteriore) con le forbici lungo il cranio per aprirlo ed esporre il cervello. Separare il cranio dal cervello con una pinzetta. Rimuovere il cervello utilizzando una micro spatola per mantenere l'integrità del cervello.</li>
		<li>Collocare il cervello in un piatto Petri secco (6 cm di diametro). Rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto utilizzando una micro spatola. Spostare la corteccia in un'altra parabola Petri (6 cm di diametro) contenente HBSS - 10% FBS (2 mL /piatto Petri).</li>
		<li>Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi con forbici sterili e utilizzando un trasferimento p1000 micropipette ogni tessuto cerebrale con HBSS - 10% FBS a diversi tubi conici da 15 mL. Assicurarsi che il volume finale sia di 2 mL/tubo. In caso contrario, completare con HBSS - 10% FBS. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. In tal caso, i tubi conici con tessuto SNC devono essere posizionati sul ghiaccio fino a 1 h.</li>
		<li>Lavare il tessuto cerebrale tagliato con 3 mL di HBSS - 10% FBS (per tubo) e dopo la decantazione. Rimuovere con attenzione il super-natante. Ripetere questo passaggio 3 volte. NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di rimuovere i detriti e di recuperare il tessuto estratto.</li>
		<li>Lavare il tessuto cerebrale tagliato con 3 mL di HBSS puro (per tubo) e dopo la decantazione, rimuovere con attenzione il supernatante. Ripetere questo passaggio 3 volte. NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di rimuovere il siero rimanente dai fumi precedenti, poiché le cellule verranno pipsinizzate nel passaggio successivo.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di cipina per tubo e mettere in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min, scuotendo delicatamente i tubi ogni 5 min. Evitare le bolle invertendo o mescolando bruscamente i tubi. NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di digerire il tessuto raccolto.</li>
		<li>Per disattivare la metapsina, lavare il tessuto con 3 mL per tubo di HBSS - 10% FBS e, dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con attenzione il supernatante. Ripetere questo passaggio 3 volte.</li>
		<li>Lavare il tessuto con 3 mL per tubo di HBSS puro e rimuovere con cura il supernatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.</li>
		<li>Aggiungere 7 mL per tubo di HBSS puro e omogeneizzare il tessuto attraverso passaggi successivi nelle pipette: prima con la pipetta sierologica da 10 mL, seguita da 5 mL e infine con la micropipetta p1000.</li>
		<li>Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare i tubi a 450 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Scartare il supernatante e risospendere il pellet con 4 mL di HBSS - 10% FBS per tubo.</li>
		<li>Trasferire le cellule a un pallone T-75 pretrattato per una coltura cellulare ottimale (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Elaborare il tessuto di ogni animale per fiaschetta.</li>
		<li>Collocare il pallone nell'incubatrice a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 30 min per l'aderenza.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 integrati per fiaschetta e incubare a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. NOTA: il volume finale è di 14 mL per fiaschetta.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 3
	<ol>
<li>Rimuovere 7 mL di supporto di coltura dal flacone T-75 e aggiungere 7 mL di Fresco integrato DMEM/F12. NOTA: I flaconi conterranno un sacco di detriti cellulari e un aspetto nuvoloso.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 5
	<ol>
<li>Rimuovere tutto il supporto dal flacone T-75 e aggiungere 14 mL di Fresco integrato DMEM/F12. NOTA: Il supporto viene sostituito dai flaconi per rimuovere i detriti e le cellule non aderenti.</li>
		<li>Dopo ogni 48 h, rimuovere 6 mL del supernatante e aggiungere 7 mL di fresco integrato DMEM/ F12 medio fino al giorno 14 di coltura.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 14
	<ol>
<li>Dopo aver rimosso 6 mL del supernatante e aver aggiunto 7 mL di fresco supporto DMEM/F12 integrato, chiudere i flaconi T-75 saldamente.</li>
		<li>Mettetele nello shaker orbitale a 200 giri/min e 37 gradi durante la notte per dissociare meccanicamente la microglia dagli astrociti.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 15
	<ol><li>Prendi i flaconi dallo shaker e lavegliali vigorosamente con il proprio mezzo per ottimizzare la dissociazione cellulare e raccogliere il numero massimo di microglia. Quindi, raccogliere il supernatante (contenente microglia) e trasferire in un tubo conico 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere quindi 4 mL di ciuffo in ogni pallone e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi per staccare gli astrociti.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL per fiaschetta di DMEM/F12 integrato per disattivare la trypsin. Lavare i flaconi con il proprio mezzo e trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 mL.</li>
		<li>Centrifuga tutti i tubi contenenti microglia dissociata e astrociti a 450 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet di microglia in 1 mL e gli astrociti in 10 mL di DMEM/F12 integrati.</li>
		<li>Procedere al conteggio cellulare in una camera Neubauer o in un contatore cellulare automatico. Piastrare le cellule con DMEM/F12 integrato alla densità desiderata in una piastra di coltura cellulare piatta appropriata (pretrattata per l'attacco ottimale delle cellule; vedere Tabella dei materiali). Incubano le cellule a 37 e il 5% di CO2 per 24 h per consentire loro di attaccarsi. NOTA: Riserva 1,5 x 106 di ogni popolazione cellulare per confermare la loro purezza dalla citometria di flusso.</li>
		<li>Eseguire un'analisi citometrica del flusso per verificare la purezza delle popolazioni di cellule. NOTA: Consideriamo microglia CD11b-/CD45-/GFAP- e astrociti CD11b-/CD45-/GFAP. Le colorazione Iba1 e TMEM119 potrebbero essere prese in considerazione al fine di caratterizzare appieno la microglia22.</li>
		<li>Aggiungere un FMO (Fluorescence Minus One)23 e un campione incontaminato per ogni popolazione cellulare (astrociti e microglia) come controlli dell'analisi della citometria di flusso.</li>
		<li>Per ogni popolazione cellulare, riserva 5 x 105 celle per ogni campione macchiato e non colorato. Per FMO, riservare altri due tubi di microglia contenenti 2,5 x 105 celle ciascuno e riservare anche un altro tubo di 5 x 105 astrociti. NOTA: Poiché i numeri di microglia possono essere un fattore limitante, è possibile utilizzare meno cellule per i controlli non statuati e FMO.</li>
		<li>Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet con 500 s/microtube di Tampone FACS (salina con buffer fosfato (PBS) - 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) - 2 mM EDTA, pH 7.2).</li>
		<li>Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante e sospendere il pellet con 100 l/microtube di anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) diluito nel buffer FACS. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 500 l/microtubo di TAC buffer in tutti i microtubi e centrifugare a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante. Risospendere gli astrociti e i tubi di colorazione delle microglie e anche il tubo FMO astrocito con 50 sl/microtubi di miscela di marcatori di superficie: anti-CD45 (PE, clone 30-F11) e anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (entrambi diluiti a 1: 100 nel buffer FACS).</li>
		<li>Per le celle non colorate, risospendere con lo stesso volume di buffer FACS. Per la microglia FMO, incubare ogni tubo di microglia con anti-CD45 o anti-CD11b. Incubare tutti i campioni a 4 gradi centigradi per 20 min al buio.</li>
		<li>Aggiungete 500 l di buffer FACS per microtubo. Centrifuga a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet con 100 l/microtubo di buffer di fissaggio (vedi Tabella dei materiali)per 20 min a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Aggiungete 500 l/microtubo di buffer permeabilizzazione 1x (vedi Tabella dei materiali)e incubate a 4 gradi centigradi per 5 min al buio.</li>
		<li>Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante. Risospendere gli astrociti e i tubi di colorazione delle microglie e anche i tubi FMO microglia con 50 tubi di anticorpo intracellulare anti-GFAP (APC, clone GA5) in un 1:100 di diluizione in 1x tampone permeabilizzazione. Per le cellule incontaminate e l'Astrocyte FMO, risospendere le cellule con lo stesso volume di buffer FACS. Incubare tutti i campioni a 4 gradi centigradi per 30 min al buio.</li>
		<li>Lavare tutti i tubi aggiungendo 500 l/microtubi di 1x tampone permeabilizzazione. Centrifugare tutti i microtubi a 450 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospendere ogni microtubo in 200 l di tampone FACS. Acquisire 1 x 105 eventi/campione sul citometro di flusso.</li>
		<li>Per l'analisi, le celle devono essere gated prima su CD11b x CD45 e poi istogramma GFAP. NOTA: i controlli Untined e FMO sono utili per determinare i gate.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Infezione e valutazione dei tassi di infezione
<ol><li>Infezione delle cellule gliali con T. gondii
	<ol>
<li>Piastra 3 x 104 microglia o astrociti con DMEM/F12 integrato a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 per 24 h in una piastra piatta pretrattata di 96 pozze (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Infettare ogni popolazione cellulare con tachizoiti da T. ceppo gondii RH che esprime proteine fluorescenti gialle (YFP) a una molteplicità di infezione (MOI) di 1:1 (parassita:cellulare) diluita in 200 gradi centigradi di RPMI (3% FBS - 0,16 mM Penicillina - 0,18 mM Streptomycin - 12,5 mM HEPES - bicarbonabidi bicarbonato di 30 m pH 7.2) (vedere Tabella dei materiali). Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 48 h.</li>
		<li>Quindi, scartare il supernatante e fissare le cellule aggiungendo 100 l/podi di 1% di paraformaldeide (PFA) diluiti in PBS a 4 gradi centigradi per 24 h.</li>
		<li>Sostituire l'PFA con 100 gradi l/pozzetto di PBS a pH 7.2.</li>
		<li>Rimuovere con cura i nuclei delle cellule sovralimentate e macchiate con il pipettaggio di 50 gradi di DAPI (5 mg/mL) diluito in PBS pH 7.2 (1:1.000) per 1 min a temperatura ambiente al buio.</li>
		<li>Sostituire la soluzione di colorazione DAPI con 100 l/pozzelle di PBS (pH 7.2) e analizzarla mediante microscopia a fluorescenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Infezione delle cellule gliali con T. cruzi
	<ol>
<li>Piastra 3 x 104 microglia o astrociti con DMEM/F12 integrato a 37 gradi centigradi e 5% di CO2 per 24 h in una piastra piatta pretrattata di 96 pozze (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Per ogni punto di infezione, utilizzare una piastra diversa.</li>
		<li>Infettare le cellule gliali con ceppo di T. cruzi Y a un MOI di 5:1 (parassiti:cellula) diluito in 200 /l/po di RPMI integrato e incubare a 37 e 5% DI CO2 per 2 h. NOTA: Questo passaggio è importante per l'invasione cellulare da parte del parassita.</li>
		<li>Rimuovere tutti i supernatali e lavare i pozzetti aggiungendo 200 l/po di RPMI integrato per rimuovere tutti i parassiti extracellulari. Rimuovere il supernatante e aggiungere 200 s/po di RPMI fresco integrato. NOTA: Questo passaggio intende rimuovere tutti i parassiti che non hanno invaso le cellule aderenti.</li>
		<li>Incubare cellule infette per 2 h, 48 h e 96 h per valutare la replicaZione T. cruzi nelle cellule gliali11.</li>
		<li>Dopo ogni time point, rimuovere il supernatante e fissare le celle con 100 l/po di metanolo per 15 min a temperatura ambiente, quindi sostituire il metanolo con 100 l/po di PBS (pH 7.2).</li>
		<li>Dopo la fissazione, preparare le cellule per l'immunofluorescenza assay come segue.<ol>
<li>Per evitare l'autofluorescenza, trattare le cellule con 100 S/h di 50 mM NH4Cl diluito in PBS (pH 8.0) per 15 m. Lavare le cellule aggiungendo 100 l/pozze di PBS e rimuoverle immediatamente (ripetere questo passaggio 3 volte).</li>
			<li>Successivamente, permeabilizzare le celle aggiungendo 100 L/pozzetto di 0,5% Triton diluito in PBS per 15 min.</li>
			<li>Quindi, incubare la coltura cellulare con 100 l/po di soluzione di blocco (5% di latte non grasso , 2% BSA diluito in PBS [pH 7.2]) per 1 h a temperatura ambiente. Lavare le cellule aggiungendo 100 l/po di PBS e rimuoverlo immediatamente (ripetere questo passaggio 3 volte).</li>
			<li>Al fine di macchiare gli amastigoti, incubare con 30 l/po di anticorpo monoclonale non commerciale (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 (1:200) diluito in soluzione di blocco per 1 h a temperatura ambiente.</li>
			<li>Lavare le cellule aggiungendo 100 l/po di PBS e rimuoverlo immediatamente (ripetere questo passaggio 3 volte). Incubare la piastra con 30 l/po di anticorpo antito-tono secondario (1:500) diluito in PBS per 1 h a temperatura ambiente. NOTA: La proteina non commerciale mAb 2C2 anti-Ssp-4 era un dono gentile del Prof.</li>
			<li>Rimuovere con cura i nuclei del sovratalterra e delle macchie aggiungendo 50 l/po di DAPI (5 mg/mL) diluito in PBS pH 7.2 (1:1,000) per 1 min a temperatura ambiente al buio.</li>
			<li>Sostituire la soluzione di colorazione DAPI con 100 l/pozzelle di PBS pH 7.2 e analizzarla mediante microscopia a fluorescenza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'importanza di studiare le funzioni isolate delle cellule gliali in contesti biologici distinti si è espansa negli ultimi due decenni. Comprendere il CNS al di là dei neuroni è ancora un campo in crescita nella biologia cellulare, soprattutto in infezioni o condizioni infiammatorie8,9,24. Le cellule gliali sono cruciali non solo per i neuroni supporto fisico (come era precedentemente noto), ma anche in molte altre situazioni fi...

Il CNS è composto principalmente da neuroni e cellule gliali1,2,3. Microglia e astrociti sono le cellule glia più abbondanti nel SNC. La microglia, il macrofago residente, è l'immunocompetente e la cella glia fagocitica nel CNS3,4, mentre gli astrociti sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi ed esercitano funzioni di supporto5.
Nonostante le cellule gliali siano classicamente note per essere responsabili del supporto e della protezione dei neuroni6,7, funzioni emergenti di queste cellule sono state descritte nella letteratura recente, comprese le loro risposte alle infezioni8,9,10,11. Quindi, c'è una spinta a sviluppare metodi per isolare queste cellule gliali per comprendere le loro funzioni individualmente.
Ci sono alcuni modelli alternativi per studiare le cellule gliali piuttosto che le colture primarie, come le linee cellulari immortalate e i modelli in vivo. Tuttavia, le cellule immortalate hanno maggiori probabilità di subire la deriva genetica e i cambiamenti morfologici, mentre gli studi in vivo impongono condizioni di manipolazione limitate. Al contrario, le colture primarie sono facili da gestire, assomigliano meglio alle cellule in vivo e ci permettono anche di controllare i fattori sperimentali12,13. Qui, descriviamo le linee guida su come estrarre, mantenere e dissociare gli astrociti murini e le cellule primarie della microglia nello stesso protocollo. Inoltre, forniamo anche esempi su come lavorare con l'infezione da protozoi in queste culture.
Le cellule del SNC estratte da topi neonatale (fino a 3 giorni) sono state coltivate per 14 giorni su supporti differenziali che consentono la crescita preferenziale di astrociti e cellule di microglia. Poiché le microglie riposano sopra gli astrociti attaccati, le popolazioni cellulari sono state dissociate meccanicamente in un'incubatrice orbitale. Successivamente, abbiamo raccolto tutti i supernatant contenenti microglia e aggiunto la prova per staccare gli astrociti. Le cellule gliali isolate sono state valutate fenotipicamente dalla citometria di flusso e placcate secondo l'esperimento desiderato.
Abbiamo anche fornito esempi su come infettare queste microglia isolate e astrociti con parassiti protozoi. T. gondii è un protozoo altamente neurotropico responsabile della toxoplasmosi14, mentre T. cruzi è responsabile della malattia di Chagas che può portare allo sviluppo di disturbi neurologici nel CNS15,16. Inoltre, è stato anche riferito che l'infezione da T. gondii17,18 o T. cruzi19,20,21 erano la presunta causa di morte nei pazienti immunocompromessi. Pertanto, il chiarimento del ruolo immunologico delle cellule gliali dal SNC nel controllo delle infezioni da protozoo è di grande importanza.

<table><tbody><tr><td>70% Etanolo</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea</td><td>Gatto: 2231</td><td>Sterilizzare</td></tr><tr><td>75 cm2 Pallone</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>Materiale plastico</td></tr><tr><td>96 pozzetti piastra per colture cellulari</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio (NH4Cl)</td><td>Din&acirc; mica Qu&iacute; mica Contempor&acirc; nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td><td>Rimuovere l'anticorpo</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td> in autofluorescenza <td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td> Filtro per bottiglia <td>antidoby in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>0,22 &mu; mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: Filtro per terreno di</td><td>coltura</td>430513</tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: A7906</td><td>FACS Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>Cat: 5810R</td><td>Centrifuga per centrifugazione</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>Cabina di biosicurezza per centrifugazione</td></tr><tr><td>di classe II</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>Cabina di biosicurezza per procedure sterili</td></tr><tr><td>CO2 Incubatore</td><td>ThermoScientific</td><td>Modello: 3110</td><td>Manutenzione delle cellule primarie</td></tr><tr><td>Provette coniche 15 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 430766</td><td>Materiale plastico</td></tr><tr><td>Provette coniche 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>Materiale plastico</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td> Fotocamera per microscopio digitale <td>antidoby in immunofluorescenza</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>Cattura immagini al microscopio</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: E9884</td><td>FACS Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>F12 Miscela di nutrienti</td><td>Gibco</td><td>Cat: 21700-026</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>Citometro a flusso indisponibile</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>LGC Biotechnology</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>Integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Flow Jo (software)</td><td>Flow Jo</td><td>Versione: Flow Jo_9.9.4</td><td>Analisi dei dati</td></tr><tr><td>Fluorescenza intenselight</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>Sorgente di fluorescenza</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Capra - anti-topo IgG (FITC)</td><td>Kirkeegood& Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>Antidoby in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>HBSS - Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>Integratore di terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>Fissazione cellulare per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Modello: Microscopio ECLIPSE TS100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Crist&aacute; lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>Anestetico inalato</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Synth</td><td>Cat: 01A1085.01.BJ</td><td>Fissazione per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Micro spatola</td><td>ABC inossidabile</td><td>Non disponibile</td><td>Materiale chirurgico</td></tr><tr><td>Microprovetta 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>Cat: MCT-150-C</td><td>Materiale plastico</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale (mAb) 2C2 anti-Ssp-4</td><td>Non commerciale</td><td>Non commerciale</td><td>Pipetta multicanale antidoby in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>(p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>Reagenti per pipette</td></tr><tr><td>Elementi NIS Software</td><td>Nikon</td><td>Versione 4.0</td><td>Acquisizione e analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Latte scremato</td><td>Nestl&eacute;</td><td>Cat: 9442405</td><td>Soluzione bloccante per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Incubatore con agitatore orbitale</td><td>Modello termoscientifico</td><td>: 481 Cat: 11</td><td>Microglia dissociata dagli astrociti</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P6148</td><td>Fissazione per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Penicillina neutra tampone non commerciale</td> non <td>commerciale</td><td></td></tr><tr><td>G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: P-7794</td><td>Integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>Permeabilizzazione cellulare per citometria a flusso</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm x 15 mm (monouso, sterile)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>Misuratore di pH per materie plastiche</td></tr><tr><td></td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>Calibrare la soluzione di pH</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>ABC inox</td><td>Cat: LO9-W4</td><td>Materiale chirurgico</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica 10 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4101</td><td>Materiale plastico</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica 5 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 4051</td><td>Materiale plastico</td></tr><tr><td>Pipetta a canale singolo (p1000)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123602</td><td>Reagenti per pipette</td></tr><tr><td>Singolo Pipetta a canale (p200)</td><td>Gilson Pipetman</td><td>Cat: F123601</td><td>Reagenti per pipette</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S6297</td><td>Integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Sale di streptomicina solfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: S9137</td><td>Integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: T9284</td><td>Permeabilizzazione per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>Cat: 27250-018</td><td>Pinzetta enzima digestivo</td></tr><tr><td></td><td>ABC inox</td><td>Cat: L28-P4-172</td><td>Materiale chirurgico</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Novatecnica</td><td>Modello: 09020095</td><td>Digerire il tessuto a 37 gradi; C con tripsina</td></tr></tbody></table>

isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di protozoi

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Gli astrociti e la microglia sono le cellule gliali più abbondanti. Sono responsabili del supporto fisiologico e del mantenimento dell'omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC). Le crescenti prove del loro coinvolgimento nel controllo delle malattie infettive giustificano l'interesse emergente per il miglioramento delle metodologie per isolare gli astrociti primari e le microglia al fine di valutare le loro risposte alle infezioni che colpiscono il SNC. Considerando l'impatto dell'infezione da Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e Toxoplasma gondii (T. gondii) nel SNC, qui forniamo un metodo per estrarre, mantenere, dissociare e infettare gli astrociti murini e le cellule di microglia con parassiti del protozoico. Le cellule estratte dalle cortice neonatali sono mantenute in vitro per 14 giorni con sostituzione periodica dei supporti differenziali. Gli astrociti e le microglie si ottengono dallo stesso protocollo di estrazione per dissociazione meccanica. Dopo la fenotipizzazione per citometria di flusso, le cellule vengono infettate da parassiti di protozoi. Il tasso di infezione è determinato dalla microscopia a fluorescenza in diversi punti temporali, consentendo così la valutazione della capacità differenziale delle cellule gliali di controllare l'invasione e la replicazione dei protozoi. Queste tecniche rappresentano metodi semplici, economici ed efficienti per studiare le risposte di astrociti e microglia alle infezioni, aprendo il campo per ulteriori analisi della neuroimmunologia.

Il giorno14, la coltura delle cellule gliali (Figura 1A) ha subito una dissociazione meccanica. Le popolazioni di cellule isolate sono state analizzate dalla citometria di flusso secondo i marcatori CD11b, CD45 e GFAP. Potremmo osservare una purezza dell'89,5% per la popolazione di astrociti e del 96,6% per lapopolazionedi microglia ( Figura 1B). Dopo l'isolamento, le cellule sono state placcate in una piastra piatta ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di istruire come estrarre, mantenere e dissociare le cellule di astrocite e microglia dal sistema nervoso centrale, seguite da infezione da parassiti protozoi.

Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

Questo protocollo descrive un metodo che si concentra sull'estrazione in parallelo delle due popolazioni di cellule gliali più abbondanti, astrociti e microglia, da topi postnatali. Il nostro metodo differisce dagli altri protocolli precedentemente descritti per l'isolamento di astrociti e microglia perché ci concentriamo sull'ottenimento e l'isolamento di entrambi i tipi di cellule nella stessa estrazione alle stesse condizioni, ottimizzando così l'uso di animali da esperimento e migliorando lo studio dei ruoli relativi per queste cellule in contesti immunologici. Questo protocollo può essere utile per indagare meglio i ruoli di microglia e astrociti in molti contesti e malattie nel sistema nervoso centrale come Alzheimer, Parkinson e infezioni da parassiti o virus protozoi.Ottenere e isolare entrambi i tipi di cellule dalla stessa estrazione è auspicabile per valutare il ruolo comparativo di ogni sottoinsieme cellulare contesti immunologici come infezione o infiammazione. Le persone dovrebbero stare attenti soprattutto durante la rimozione del cervello e i lavaggi nervosi dei tessuti, ma credo che con questo protocollo e il video girato, le persone non faranno fatica. Questo protocollo può essere lungo a seconda del numero di animali per estrarre i cortici, quindi preparati a trascorrere circa quattro ore o più.Il primo giorno, prepara HBSS e HBSS puri più FBS inattivati dal calore al 10%. Preparare dmem F12 integrato e filtrarlo con un filtro da 0,22 micron. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e utilizzare il 70% di etanolo durante la procedura.Mettere i topi appena nati in una camera sigillata contenente cotone imbevuto di isoflurane per cinque minuti per un'anestesia profonda. Spruzzare il cucciolo di topo con il 70% di etanolo e decapitare l'animale con le forbici. Fai un taglio sagittale con forbici lungo il cranio per aprirlo ed esporre il cervello.Rimuovere il cervello usando una micro spatola per mantenere l'integrità cerebrale. Posizionare il cervello in una piastra di Petri asciutta di sei centimetri di diametro. Utilizzando una micro spatola, rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto.Spostare la corteccia su un'altra piastra di Petri contenente due millilitri di HBSS più 10%FBS. Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi con forbici sterili e utilizzando una micropipetta P1000, trasferire ogni tessuto cerebrale con HBSS più 10%FBS in diversi tubi conici da 15 millilitri. Se necessario, utilizzare HBSS più 10%FBS per riempire il volume finale a due millilitri.Lavare il tessuto cerebrale tagliato con tre millilitri di HBSS più 10%FBS per ogni tubo. Dopo la decantazione, rimuovere con cura il supernatante. Ripetere il lavaggio con HBSS più 10%FBS tre volte in più.Quindi lavare con tre millilitri di HBSS puro tre volte. Dopo la decantazione, rimuovere con cura il supernatante. Quindi, aggiungere tre millilitri di tripina e posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti scuotendo delicatamente i tubi ogni cinque minuti.Questo digerisce il tessuto raccolto. Evitare bolle. Per inattivare la tripsiderina, lavare il tessuto con tre millilitri di HBSS più 10%FBS e dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con cura il supernatante.Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi lavare il tessuto con tre millilitri di HBSS puro e ripetere due volte aggiuntive. Dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con cura il supernatante.Aggiungere sette millilitri di HBSS puro e omogeneizzare il tessuto attraverso passaggi successivi in pipette, prima con una pipetta sierologica da 10 millilitri, seguita da una pipetta da cinque millilitri e infine con una micropipetta P1000. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare i tubi a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con quattro millilitri di HBSS più 10%FBS per ogni tubo.Trasferire le cellule in un pallone T75 pretrattato commercialmente per un'adesione ottimale della coltura cellulare. Posizionare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per l'aderenza. Quindi aggiungere 10 millilitri di DMEM F12 integrato al pallone e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due notti.Il terzo giorno, rimuovere sette millilitri di mezzo di coltura dal pallone T75 e aggiungere sette millilitri di DMEM F12 fresco integrato. Riportare il pallone nell'incubatrice. Il quinto giorno, per rimuovere detriti e cellule non arent, scambiare tutto il mezzo dal pallone T75 con 14 millilitri di DMEM F12 fresco integrato.Quindi, ogni 48 ore, rimuovere sei millilitri del supernatante e aggiungere sette millilitri di DMEM F12 fresco integrato medio fino al giorno 14 di coltura. Il giorno 14, dopo aver rimosso sei millilitri di supernatante e aver aggiunto sette millilitri di mezzo DMEM F12 integrato fresco, chiudere saldamente i contenitori T75 con un involucro di plastica. Posizionarli nello shaker orbitale del pavimento a 200 RPM e 37 gradi Celsius durante la notte per dissociare meccanicamente le microglia dagli astrociti.Il giorno 15, prendere i matracci dallo shaker e lavarli vigorosamente con il proprio mezzo al fine di ottimizzare la dissociazione cellulare e raccogliere il numero massimo di microglia. Quindi raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere quattro millilitri di tripside ad ogni pallone e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare gli astrociti.Quindi aggiungere cinque millilitri di DMEM F12 integrato per inattivare la tripina. Lavare i contenitori con il proprio mezzo e trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare tutti i tubi contenenti microglia dissociata o astrociti a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il supernatante. Resuspend il pellet di microglia in un millilitro di DMEM F12 integrato e gli astrociti in 10 millilitri di DMEM F12 integrato. Procedere al conteggio delle celle in una camera Neubauer o in un contatore automatico di celle.Placcare le celle con DMEM F12 integrato alla densità desiderata in una piastra di coltura cellulare piatta pretrattata. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore per consentire loro di attaccarsi. Il 14 ° giorno, la coltura cellulare gliale è stata sottoposta a dissociazione meccanica.È stato osservato con una purezza dell'89,5% per la popolazione di astrociti e del 96,6% per la popolazione di microglia. Astrociti e microglia di topi C57BL6 sono stati infettati da T.cruzi Y.Dopo due ore, 48 ore e 96 ore, le camere sono state fissate con metanolo e macchiate con marcatore di nucleasi cellulare DAPI e anti-GFAP. L'uso di parassiti geneticamente modificati che esprimono reporter fluorescenti o parassiti etichettati con specifici anticorpi fluorescenti ha migliorato la microscopia ad immunofluorescenza poiché si distinguono meglio dal nucleo cellulare.Qui vengono presentati due esempi. Ceppo T.gondii RH che esprime in modo costitutivo ceppo YFP e T.cruzi Y macchiato con anticorpo monoclonale non commerciale 2C2 anti-SSP4 proteina. È importante lavare attentamente le cellule per non perdere aggregati cellulari.Dopo l'infezione da cellule gliali, possono essere valutati altri parametri come ELISA per la produzione di citochine presente nel supernatante, western blotting per l'espressione proteica e PCR quantitativo in tempo reale per la valutazione della trascrizione dell'RNA. Molte domande relative alla funzione delle cellule gliali, ad esempio il loro metabolismo, la risposta immunitaria e la stessa biologia cellulare possono essere affrontate e avvantaggiate da questa tecnica. Tutti i parassiti dei protozoi sono in grado di infettare le cellule umane e di coltura delle cellule del topo, quindi è importante fare attenzione quando si maneggia questo parassita.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per...

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Gli astrociti sono stati riconosciuti per essere versatili cellule che partecipano a processi biologici fondamentali che sono essenziali per il normale sviluppo del cervello e la funzione, e la riparazione del sistema nervoso centrale. Qui vi presentiamo una procedura rapida per ottenere colture pure astrociti topo per studiare la biologia di questa classe importante di cellule del sistema nervoso centrale.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Un metodo per l'isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali...

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) hanno potenti proprietà immunomodulatorie utili per il trattamento delle malattie associate all'infiammazione. Dimostriamo come isolare e coltivare le AdMSC murine e la glia mista primaria, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni antinfiammatori e i fattori di crescita, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia primaria mista infettata da prioni.

Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Scopri il metodo per isolare contemporaneamente astrociti e microglia primari da cortici di topi neonati. Questo protocollo consente studi comparativi sulle risposte gliali alle infezioni da parassiti protozoi nel sistema nervoso centrale.

Isolamento concomitante di astrociti primari e microglia per l'infezione da parassiti di Protozoi

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