Name: 原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ 新生マウス大脳皮質から星状膠細胞とミクログリアを同時に分離・培養する手法。Trypanosoma cruziやToxoplasma gondiiなどの原虫感染におけるグリア細胞の免疫応答を比較研究するのに有用です。

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サンパウロ連邦大学(UNIFESP)のレナート・A・モルタ教授にmAb 2C2反Ssp-4をありがとうございました。この作品は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP、K.R.B.への助成金2017/25942-0)、コンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq、 402100/2016-6をK.R.B.に付与し、インスティトゥート・ナシオナル・デ・シエンシア・エ・テクノロジア・デ・ヴァシナス(INCTV/CNPq)、クールデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スペリオール(CAPES、金融コード001)を付与します。M.P.A.はCNPqからフェローシップを受け、A.L.O.P.はCAPESからフェローシップを受け、I.S.FとL.Z.M.F.B.はFAPESPからフェローシップを受けます。

マウスを含むすべての実験的手順は、ブラジルの国家法(11.794/2008)に従って行われ、サンパウロ連邦大学(UNIFESP)の機関動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. グリア細胞の抽出、維持、解離
注: グリア細胞抽出に使用されるマウスの数は、目的の実験を行うために必要な細胞の量によって異なります。このプロトコルでは、合計2.7 x 10 7アストロサイトと4 x 10 6ミクログリアが6匹の新生児C57BL/6マウスから得られた。6すべての手順は、クラスIIバイオセーフティキャビネットで無菌状態で行われた。
<ol><li>1日目
	<ol>
<li>純粋なハンクのバランス塩溶液(HBSS)とHBSS + 熱不活性化ウシ血清(FBS)の10%を準備します(材料表を参照)。</li>
		<li>補足されたダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)/F12(10%FBS + 0.08 mMペニシリン+ 0.09 mMストレプトマイシン+ 0.09 mmstreptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mMナトリウム炭酸ナトリウム、pH 7.2)を準備し、0.22μmフィルターでフィルタリングします(材料の表を参照)。 注:すべての培養培地は4°Cで保存する必要がありますが、実験を開始する前に37°Cで20分間プリウォームする必要があります。</li>
		<li>オートクレーブ内のすべての手術器具(はさみ、へら、ピンセット)を殺菌し、処置の間に70%エタノールを使用する。</li>
		<li>イゾフルランを浸した綿を含む密閉されたチャンバーに新生児(3日まで)マウスを5分間入れて深遠な麻酔をします。</li>
		<li>70%エタノールでマウスの子犬をスプレーし、はさみで動物を切断します。</li>
		<li>頭蓋骨に沿ってはさみで矢状カット(前部に後ろ)を作り、それを開いて脳を露出させます。ピンセットを使用して頭蓋を脳から分離します。脳の完全性を維持するためにマイクロヘラを使用して脳を削除します。.</li>
		<li>乾燥したペトリ皿(直径6cm)に脳を入れます。マイクロヘラを使用して嗅球と小脳を取り除きます。HBSS + 10% FBS (2 mL/ペトリ皿) を含む別のペトリ皿(直径6cm)に皮質を移動します。</li>
		<li>滅菌はさみで小片に脳組織をカットし、p1000マイクロピペットを使用して、HBSS + 10%FBSを持つ各脳組織を異なる15 mL円錐形チューブに移します。最終容積が2 mL/チューブであることを確認します。ない場合は、HBSS + 10% FBS を使用して完了します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。その場合、CNS組織を有する円錐管は、1時間までの氷の上に置かれなければならない。</li>
		<li>切断した脳組織を3 mLのHBSS + 10%FBS(チューブあたり)で洗浄し、デカンテーション後に洗います。上清を慎重に取り除いてください。この手順を 3 回繰り返します。 注:このステップは、破片を除去し、抽出された組織を回復することを目的としています。</li>
		<li>切断した脳組織を3 mLの純粋なHBSS(チューブあたり)で洗浄し、デカンテーション後、上清を慎重に除去します。この手順を 3 回繰り返します。 注:このステップは、細胞が次のステップでトリプシン化されるように、以前のスケミから残りの血清を除去することを目的としています。</li>
		<li>1チューブあたり3mLのトリプシンを加え、37°Cの水浴に30分間静かに振り、5分ごとにチューブを振り回します。 注:このステップは、収集した組織を消化することを目的としています。</li>
		<li>トリプシンを不活性化するには、HBSS + 10%FBSのチューブあたり3mLで組織を洗浄し、組織の脱栓後、上清を慎重に除去する。この手順を 3 回繰り返します。</li>
		<li>純粋なHBSSのチューブあたり3 mLで組織を洗浄し、慎重に上清を除去します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>純粋なHBSSの管あたり7 mLを加え、ピペットの連続した通路を通して組織を均質化する:最初に10 mL血清学的ピペットで、次いで5 mL、最後にp1000マイクロピペットで。</li>
		<li>均質化後、遠心管を4°Cで5分間450xgで行う。 g</li>
		<li>上清を捨て、4 mLのHBSS + 1管10%FBSでペレットを再懸濁します。</li>
		<li>細胞を前処理したT-75フラスコに移して、最適な細胞培養接着を行う(材料表を参照)。 注:フラスコごとの各動物から組織を処理します。</li>
		<li>フラスコを37°Cで、5%CO2で30分間付着2します。</li>
		<li>1 フラスコあたり 10 mL の DMEM/F12 を加え、37 °C と 5% CO2でインキュベートします。 注意:最終ボリュームはフラスコあたり14 mLです。</li>
	</ol></li>
	<li>3日目
	<ol>
<li>T-75フラスコから7mLの培養培地を取り出し、新鮮な補充されたDMEM/F12の7 mLを加えます。 注:フラスコには、多くの細胞の破片と曇りの外観が含まれます。</li>
	</ol></li>
	<li>5日目
	<ol>
<li>T-75フラスコからすべての培地を取り出し、新鮮な補充されたDMEM / F12の14 mLを追加します。 注:媒体は破片および非付着細胞を取除くためにフラスコから取り替えられる。</li>
		<li>各48時間後、上清の6mLを除去し、培養14日目まで新鮮な補充DMEM/F12培地の7 mLを加える。</li>
	</ol></li>
	<li>14日目
	<ol>
<li>上清の6 mLを除去し、新鮮な補充DMEM/F12培地の7 mLを加えた後、T-75フラスコをしっかりと閉じます。</li>
		<li>200 rpm と 37 °C の床軌道シェーカーに一晩置き、天文学からミクログリアを機械的に解離します。</li>
	</ol></li>
	<li>15日目
	<ol><li>シェーカーからフラスコを取り出し、細胞解離を最適化し、ミクログリアの最大数を収穫するために、独自の媒体で精力的に洗浄します。次いで、上清(ミクログリアを含む)を回収し、50mL円錐管に移す。</li>
		<li>次に、各フラスコに4mLのトリプシンを加え、アストロサイトを剥離するために37°Cで5分間インキュベートする。</li>
		<li>トリプシンを不活性化するために、補充されたDMEM / F12のフラスコあたり5 mLを加えます。独自の媒体でフラスコを洗浄し、50 mL円錐管に内容物を移します。</li>
		<li>遠心分離機 450 x gで解約したミクログリアとアストロサイトを含む全てのチューブを 4 °Cで 5 分間行う。</li>
		<li>上清を捨てます。マイクログリアペレットを1 mLに、アストロサイトを10mLのDMEM/F12を再懸濁します。</li>
		<li>ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターでセルカウントに進みます。適切な平底細胞培養プレートで所望の密度で補充されたDMEM/F12をセルにプレートする(最適な細胞付着のために前処理;材料表を参照)。細胞を37°Cでインキュベートし、24時間CO2で5%のCO2をインキュベートし、それらを取り付けることができます。 注:各細胞集団の1.5 x 106を予約し、フローサイトメトリーによって純度を確認してください。</li>
		<li>フローサイトメトリック解析を実行して、細胞集団の純度を検証します。 注: マイクログリア CD11b+/CD45+/GFAP-およびアストロサイト CD11b-/CD45-/GFAP+を検討します。Iba1およびTMEM119染色は、ミクログリア22を完全に特徴付けるために考慮されるかもしれない。</li>
		<li>フローサイトメトリーアッセイの制御として、FMO(蛍光マイナス1)23および各細胞集団(占星術およびミクログリア)に対する未染色サンプルを加える。</li>
		<li>各細胞集団について、染色されたサンプルと染色されていないサンプルごとに5 x 105個のセルを予約します。FMOの場合、2.5 x 105細胞を含むミクログリアの他の2つのチューブを予約し、さらに5 x 105アストロサイトの別のチューブを予約します。 注意: ミクログリア数は制限因子となり得るため、染色されていないコントロールやFMOコントロールに使用するセルは少なくなります。</li>
		<li>遠心分離機 450 x gで 4 °C で 5 分間すべてのマイクロチューブ。上清を捨てて、FACSバッファー(リン酸緩衝生理食塩分(PBS)+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)+2 mM EDTA、pH 7.2)の500 μL/マイクロチューブでペレットを再懸濁します。</li>
		<li>4°Cで450 x gのすべてのマイクロチューブを5分間遠心分離し、上澄み液を捨て、100 μL/マイクロチューブの抗CD16/CD32(クローン93)(1:50)をFACSバッファーで希釈してペレットを再中断します。室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>5分間4°Cで450 x gでFACSバッファーの500 μL/マイクロチューブを加えます。再懸濁アストロサイトおよびミクログリア染色チューブおよび50 μL/マイクロチューブの表面マーカーミックス付きのアストロサイトFMOチューブ:抗CD45(PE、クローン30-F11)および抗CD11b(eFluor 450、クローンM1/70)(FACSバッファで1:100で希釈)。</li>
		<li>染色されていないセルの場合は、同じ量の FACS バッファで再中断します。ミクログリアFMOの場合は、各マイクログリアチューブに抗CD45または抗CD11bをインキュベートし、4°Cで全てのサンプルを暗闇の中で20分間インキュベートします。</li>
		<li>マイクロチューブあたり500 μLのFACSバッファを追加します。450 x gで 4 °C で 5 分間遠心分離機 400 x G 上清を捨て、100 μL/マイクロチューブの固定バッファー (材料表を参照) で、暗い室温で 20 分間ペレットを再中断します。</li>
		<li>500 μL/マイクロチューブのパーメビライゼーションバッファー 1x (材料表を参照) を加え、暗闇の中で 5 分間 4 °C でインキュベートします。</li>
		<li>4°Cで450×gで全てのマイクロチューブgを5分間遠心分離します。細胞内抗体抗体の50 μL/マイクロチューブを有するアストロサイトおよびミクログリアFMOチューブを1x透過バッファーで1:100希釈で再懸濁します。染色されていない細胞およびアストロサイトFMOの場合、同じ量のFACSバッファーを持つ細胞を再中断します。4°Cで全てのサンプルを暗闇の中で30分間インキュベートします。</li>
		<li>1xパーメアビライゼーションバッファーの500 μL/マイクロチューブを加えて、すべてのチューブを洗浄します。遠心分離機 450 x gですべてのマイクロチューブ、 4 °C で 5 分間.各マイクロチューブを200 μLのFACSバッファで再中断します。フローサイトメーターで1 x 105のイベント/サンプルを取得します。</li>
		<li>分析のために、細胞はCD11b x CD45に最初にゲートされ、次にGFAPヒストグラムにゲート付けされなければならない。 注: 未染色および FMO コントロールは、ゲートを決定するのに便利です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 感染率の評価
<ol><li>T.ゴンディによるグリア細胞の感染
	<ol>
<li>プレート 3 x 104ミクログリアまたはアストロサイト 37 °C で DMEM/F12 を補充し、前処理された 96 ウェルフラットプレートで 24 時間の 5% CO2 (材料表を参照) を使用します。</li>
		<li>Tからタキゾアイトで各細胞集団に感染する。黄色蛍光タンパク質(YFP)を発現する黄色の蛍光タンパク質(YFP)株は、200 μL(寄生虫:細胞)で希釈された1:1(寄生虫:細胞)を補ったRPMI(3%FBS + 0.16 mMペニシリン+ 0.18 mMストレプトマイシン+ 12.5mM HEPES + 30 mM重炭酸ナトリウム、 pH 7.2) (資料一覧を参照)。37°Cで、5%CO2で48時間インキュベートする。2</li>
		<li>その後、上清を捨て、4°Cで24時間PBSで希釈した1%パラホルムアルデヒド(PFA)の100μL/ウェルを加えて細胞を固定します。</li>
		<li>PH 7.2でPFAをPBSの100 μL/wellに置き換えます。</li>
		<li>PBS pH 7.2 (1:1,000) で暗い温度で 1 分間希釈した DAPI (5 mg/mL) の 50 μL/ウェルを慎重に除去し、上清および染色細胞の核を除去します。</li>
		<li>DAPI染色液をPBS(pH 7.2)の100 μL/wellに置き換え、蛍光顕微鏡で分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>T.クルージによるグリア細胞の感染
	<ol>
<li>プレート 3 x 104ミクログリアまたはアストロサイト 37 °C で DMEM/F12 を補充し、前処理された 96 ウェルフラットプレートで 24 時間の 5% CO2 (材料表を参照) を使用します。 注: 感染の各時点で、異なるプレートを使用してください。</li>
		<li>5:1(寄生虫:細胞)のMOIでT.クルジY株のトリポマスチゴトをグリア細胞に感染させ、27°Cで200μL/ウェル希釈し、37°Cでインキュベートし、2時間のCO2を5%でインキュベートします。 注:このステップは、寄生虫による細胞の侵入のために重要です。</li>
		<li>すべての上清を取り除き、すべての細胞外寄生虫を除去するために、補充されたRPMIの200 μL/wellを加えることによってウェルを洗浄します。上清を取り除き、新鮮な補充されたRPMIの200 μL/wellを加えます。 注: この手順では、接着細胞に侵入しなかったすべての寄生虫を削除します。</li>
		<li>感染した細胞を2時間、48時間および96時間インキュベートし、グリア細胞11におけるT.クルジ複製を評価する。</li>
		<li>各時点の後、上清を取り除き、室温で15分間メタノールの100 μL/ウェルで細胞を固定し、メタノールをPBS(pH 7.2)の100 μL/ウェルに交換します。</li>
		<li>固定後、免疫蛍光アッセイ用の細胞を以下のように調製する。<ol>
<li>自己蛍光を避けるために、PBS(pH 8.0)で15分間希釈した50mMNH4Clの100μL/ウェルで細胞を15分間処理し、PBSの100 μL/ウェルを加えてすぐに細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。</li>
			<li>次に、PBSで希釈した0.5%トリトンの100μL/ウェルを15分間添加して細胞を透過させ、PBSを100μL/ウェルに加えてすぐに細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。</li>
			<li>次に、100 μL/ウェルのブロッキング溶液(5%非脂肪乳+ 2%BSAをPBSで希釈したBSA)を室温で1時間培養します。PBSの100 μL/ウェルを加えて細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。</li>
			<li>アマスチゴトを染色するために、非商用モノクローナル抗体(mAb)2C2抗Ssp-4タンパク質(1:200)を室温で1時間ブロッキング溶液に希釈して30μL/wellでインキュベートします。</li>
			<li>PBSの100 μL/ウェルを加えて細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。PBSで1時間室温で希釈した2次抗マウス抗体(1:500)の30μL/wellでプレートをインキュベートします。 注:非商業的なmAb 2C2抗Ssp-4タンパク質は、サンパウロ連邦大学微生物学、免疫学、寄生虫学科のレナート・A・モルタ博士からの親切な贈り物でした。</li>
			<li>PBS pH 7.2 (1:1,000) で希釈した DAPI (5 mg/mL) の 50 μL/ウェルを暗い室温で 1 分間加えて、上清と染色核を慎重に除去します。</li>
			<li>DAPI染色液をPBS pH 7.2の100 μL/wellに置き換え、蛍光顕微鏡で分析します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この20年間で、別個の生物学的文脈における単離グリア細胞機能の研究の重要性が拡大しています。ニューロンを超えてCNSを理解することは、細胞生物学において、特に感染症や炎症性の状態88、9、249,24の下でまだ成長している分野です。グリア細胞は、ニューロンの物理的サポート(以前に知られていたように)だけでなく、ニューロンエネルギー供給、神経代謝、免疫監視、シナプス剪定、組織の形成および変調など、他の多くの生理学的状況においても重要であり、とりわけ33、25、26、27、28、29である。,25,26,27,28,</su...

CNSは主にニューロンとグリア細胞11、2、32で3構成されています。ミクログリアおよびアストロサイトは、CNSにおいて最も豊富なグリア細胞である。ミクログリアは、マクロファージの居住者であり、CNS3,4における免疫担当および貪食性グリア細胞3であり、4一方、アストロサイトは恒常性を維持し、支持機能を発揮する役割を担う。
,グリア細胞は、ニューロン6,77の支持と保護を担う古典的な役割を6担っていると公知であるにもかかわらず、これらの細胞の新たな機能は、感染88、9、10、119,10に対するそれらの応答を含む最近の文献に記載されている。11したがって、これらのグリア細胞を分離してそれらの機能を個別に理解する方法を開発するプッシュがあります。
不死化細胞系や生体内モデルなど、一次培養ではなくグリア細胞を研究するための代替モデルがいくつかあります。しかし、不死化細胞は遺伝的漂流および形態学的変化を受ける可能性が高く、生体内研究では限られた操作条件を課す。逆に、一次培養は扱いやすく、生体細胞に似ており、実験因子12,13,13を制御することもできます。ここでは、同じプロトコルでマウスアストロサイトおよびミクログリア一次細胞を抽出、維持、解別する方法に関するガイドラインを説明する。また、これらの培養物における原虫感染の働き方についても紹介しています。
新生児マウスから抽出したCNS細胞(3日齢まで)を、アストロサイトおよびミクログリア細胞の優等成長を可能にする微分培地上で14日間培養した。ミクログリアは付着した星状細胞の上に残るため、細胞集団は軌道インキュベーターで機械的に解光された。次に、ミクログリアを含む上澄みをすべて採取し、トリプシンを添加してアストロサイトを取り外した。単離グリア細胞をフローサイトメトリーにより平年的に評価し、所望の実験に従ってめっきした。
我々はまた、原生動物寄生虫にこれらの孤立したミクログリアおよびアストロサイトに感染する方法の例を提供した。T. gondiiはトキソプラズマ症14を担う非常に神経性のプロトゾアンであり、T. cruzi は CNS15, 16,16における神経疾患の発症につながる可能性があるシャーガス病の原因です。さらに、T. gondii17,18またはT. cruzi19,20,,21による感染が免疫不全患者の推定死因であったことも報告されています。したがって、原生動物感染を制御する上でのCNSからのグリア細胞の免疫学的役割の解明は非常に重要である。

<table><tbody><tr><td>70%エタノール</td><td>Din&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;nea</td><td>Cat: 2231</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Flask</td><td>Corning</td><td>Cat: 430720U</td><td>プラスチック材料</td></tr><tr><td>96 ウェル 細胞培養プレート</td><td>Greiner Cellstar</td><td>Cat: 655090</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>Din&acirc;マイカQu&iacute;マイカコンテンポラリー&acirc;nea</td><td>Cat: C10337.01.AH</td><td>自家蛍光</td></tr><tr><td>アンチGFAP抗体</td>を除去 <td>Abcam</td><td>Cat.: ab49874</td><td>免疫蛍光アンチドービー</td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター 0.22 &mu;mm CA</td><td>Corning</td><td>Cat: 430513</td><td>Culture medium filter</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: A7906</td><td>FACS Buffer preparation</td></tr><tr><td>CD11b (FITC)</td><td>BD Pharmigen</td><td>Cat.: 553310</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>CD45 (PE)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 12-0451-83</td><td>フローサイトメトリー抗体</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>カタログ: 5810R</td><td>遠心分離</td></tr>機 <tr><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>遠心分離</td><td></td></tr><tr><td>クラスII バイオセーフティキャビネット</td><td>Pachane</td><td>Cat: 200</td><td>無菌処置用バイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>ThermoScientific</td><td>モデル: 3110</td><td>初代細胞のメンテナンス</td></tr><tr><td>円錐管 15mL</td><td>コーニング</td><td>猫430766</td><td>プラスチック素材</td></tr><tr><td>コニカルチューブ 50 mL</td><td>Corning</td><td>Cat: 352070</td><td>プラスチック材料</td></tr><tr><td>Countess 自動セルカウンター</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: C10281</td><td>セルカウンター</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: D1306</td><td>免疫蛍光アンチドービー</td></tr><tr><td>デジタル顕微鏡カメラ</td><td>ニコン</td><td>Cat: DS-RI1</td><td>顕微鏡で画像をキャプチャ</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルメディウム (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat: 12800-058</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>猫: E9884</td><td>FACS バッファー調製</td></tr><tr><td>F12 栄養混合物</td><td>Gibco</td><td>猫: 21700-026</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>利用できない</td><td>フローサイトメーター</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>LGC バイオテクノロジー</td><td>Cat: 10-bio500-1</td><td>Cell culture medium supplement</td></tr><tr><td>Flow Jo (software)</td><td>Flow Jo</td><td>Version: Flow Jo_9.9.4</td><td>Data analysis</td></tr><tr><td>Fluorescence intenselight</td><td>Nikon</td><td>Cat: C-HGFI</td><td>蛍光源</td></tr><tr><td>GFAP (APC)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat.: 50-9892-82</td><td>Flow cytometry antibody</td></tr><tr><td>ヤギ - 抗マウスIgG (FITC)</td><td>Kirkeegood&Perry Lab (KPL)</td><td>Cat.: 172-1806</td><td>Immunofluorescence antidoby</td></tr><tr><td>HBSS - Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>Cat: 14175079</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat: H4034</td><td>Cell culture culture culture supplement</td></tr><tr><td>IC Fixation Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8222-49</td><td>Cell fixation for Flow Citometry</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>モデル:ECLIPSE TS100</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>クリスト&aacute;lia</td><td>Cat: 21.2665</td><td>吸入麻酔薬</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Synth</td><td>猫: 免疫</td><td>蛍光のための 01A1085.01.BJ 固定</td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td>ABC ステンレス</td><td>利用不可</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL</td><td>Axygen</td><td>猫: MCT-150-C</td><td>プラスチック材料</td></tr><tr><td>モノクローナル抗体 (mAb) 2C2 抗 Ssp-4</td><td>非商用</td><td>非商用</td><td>免疫蛍光アンチドーバイ</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット (p200)</td><td>Corning</td><td>Cat: 751630124</td><td>ピペット試薬</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>Version 4.0</td><td>画像の取得と分析</td></tr><tr><td>無脂肪乳</td><td>Nestl&eacute;</td><td>猫:9442405</td><td>免疫蛍光のためのブロッキング溶液</td></tr><tr><td>オービタルシェーカーインキュベーター</td><td>ThermoScientific</td><td>モデル:481 猫:11</td><td>星状細胞からミクログリアを解離させる</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>猫:P6148</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>PBS</td>のための固定 <td>非商用</td><td>非商業</td><td>中性緩衝剤</td></tr><tr><td>ペニシリンG</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Cat: P-7794</td><td>Cell culture medium supplement</td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>Cat: 00-8333-56</td><td>Cell Permeabilization for Flow Citometry</td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile)</td><td>Prolab</td><td>Cat: 0303-8</td><td>Plastic Material</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Kasvi</td><td>K39-1014B</td><td>Calibrate pH solution</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>Cat: 31800-014</td><td>細胞培養液</td></tr><tr>ハ<td>サミ</td><td>ABCステンレス</td><td>猫:LO9-W4</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>血清ピペット 10mL</td><td>コーニング</td><td>猫:4101</td><td>プラスチック材料</td></tr><tr><td>血清ピペット 5mL</td><td>コーニング</td><td>猫:4051</td><td>プラスチック材料</td></tr><tr><td>シングルチャンネルピペット(p1000)</td><td>ギルソンピペットマン</td><td>猫:F123602</td><td>ピペット試薬</td></tr><tr><td>シングルチャンネルピペット(p200)</td><td>ギルソン・ピペットマン</td><td>猫:F123601</td><td>ピペット試薬</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>猫:S6297</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>猫:S9137</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>猫:T9284</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>のための透過化トリプシンギ</td><td>ブコ</td><td>猫:27250-018</td><td>消化酵素</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>ABCステンレス</td><td>猫:L28-P4-172</td><td>手術材料</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Novatecnica</td><td>モデル:09020095</td><td>37°で組織を消化します。トリプシンを含むC</td></tr></tbody></table>

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

アストロサイトとミクログリアは、最も豊富なグリア細胞です。彼らは中枢神経系(CNS)における生理学的支援およびホメオスタシスの維持を担当する。感染症の制御に関与した証拠の増加は、CNSに影響を与える感染症に対する彼らの反応を評価するために、原発性アストロサイトおよびミクログリアを分離する方法論の改善に対する新たな関心を正当化する。CNSにおけるトリパノソーマ・クルジ(T.クルジ)およびトキソプラズマ・ゴンディ(T.ゴンディ)感染の影響を考慮して、ここではマウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を原虫寄生虫で抽出、維持、解別、感染させる方法を提供する。新生児皮質から抽出された細胞は、周期的な差動培地交換で14日間インビトロで維持される。アストロサイトとミクログリアは、機械的解離により同じ抽出プロトコルから得られる。フローサイトメトリーによるフェノタイピングの後、細胞は原虫寄生虫に感染する。感染率は異なる時点での蛍光顕微鏡によって決定され、したがって、原虫の浸潤および複製を制御するグリア細胞の差動能力の評価を可能にする。これらの技術は、感染症に対するアストロサイトおよびミクログリアの応答を研究するための簡単で安価で効率的な方法を表し、さらなる神経免疫学分析のための分野を開く。

14日目に、グリア細胞培養(図1A)が機械的解離を行った。CD11b、CD45およびGFAPマーカーに従って、細胞集団をフローサイトメトリーで分析した。アストロサイトの人口は89.5%、ミクログリア集団では96.6%の純度を観察できた(図1B)。単離後、細胞は96ウェルの平板にメッキされ、24時間後にそれぞれの感染プロトコルに従ってT.クルージまたはT.ゴンディによって感染する準備ができていた。ここでは、これらのグリア細胞における感染率評価の一例として、T.クルジの経時感染を提供した。
アストロサイトとミクログリア(3 x 104細胞/ウェル)は、2〜96時間のMOI = 5:1(寄生虫:細胞)でT.クルージに感染した(図2)。</stron...

このプロトコルの全体的な目標は、マウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を中枢神経系から抽出、維持、解離し、続いて原虫寄生虫に感染する方法を指示することである。

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

このプロトコルは、出生後マウスから最も豊富な2つのグリア細胞集団、アストロサイトおよびミクログリアを並行して抽出することに焦点を当てた方法を記述する。我々の方法は、同じ条件で同じ抽出中の両方の細胞型を取得および単離することに焦点を当てているため、アストロサイトおよびミクログリア分離のための他の記述されたプロトコルとは異なり、実験動物の使用を最適化し、免疫学的文脈におけるこれらの細胞の相対的役割の研究を改善する。このプロトコルは、例えば原虫寄生虫やウイルスなど、アルツハイマー、パーキンソン、感染症などの中枢神経系における多くの文脈および疾患におけるミクログリアおよびアストロサイトの役割をよりよく調査するのに有用である。同じ抽出から両方の細胞型を取得および単離することは、感染または炎症などの免疫学的文脈の各細胞サブセットの比較役割を評価することが望ましい。人々は特に脳の除去と神経組織の洗い流しの間に注意する必要がありますが、私はこのプロトコルとビデオショットで、人々が苦労しないと信じています。このプロトコルは、皮質を抽出する動物の数に応じて長くすることができるので、約4時間以上を費やす準備をしてください。初日には、純粋なHBSSとHBSSに加えて10%熱不活性化FBSを準備します。補足されたDMEM F12を準備し、0.22ミクロンのフィルターでそれをフィルターします。オートクレーブ内のすべての手術器具を殺菌し、処置の間に70%エタノールを使用する。イオブルランを浸した綿を含む密閉されたチャンバーに新生児マウスを5分間入れて深遠な麻酔をする。70%エタノールでマウスの子犬をスプレーし、はさみで動物を切断します。頭蓋骨に沿ってハサミで矢状カットを行い、それを開き、脳を露出させます。脳の完全性を維持するためにマイクロヘラを使用して脳を削除します。.乾燥した直径6センチメートルのペトリ皿に脳を置きます。マイクロスパチュラを使用して、嗅球と小脳を取り除きます。HBSSの2ミリリットルプラス10%FBSを含む別のペトリ皿に皮質を移動します。滅菌はさみで小片に脳組織をカットし、P1000マイクロピペットを使用して、HBSSプラス10%FBSで各脳組織を異なる15ミリリットル円錐形チューブに移します。必要に応じて、HBSS +10%FBSを使用して、最終ボリュームを2ミリリットルに満たします。切断された脳組織を、HBSSの3ミリリットルと各チューブに対して10%FBSで洗浄します。デカンテーション後、上清を慎重に取り除きます。HBSSと10%FBSでさらに3回洗浄を繰り返します。その後、3ミリリットルの純粋なHBSSで3回洗います。デカンテーション後、上清を慎重に取り除きます。次に、3ミリリットルのトリプシンを加え、5分ごとにチューブを静かに振って30分間摂氏37度の水浴にチューブを入れます。これは、収集された組織を消化します.泡を避けてください。トリプシンを不活性化するには、HBSSプラス10%FBSの3ミリリットルで組織を洗浄し、組織のデカンテーション後に、上清を慎重に除去する。この洗浄を3回繰り返します。その後、純粋なHBSSの3ミリリットルで組織を洗浄し、さらに2回繰り返します。組織を脱栓した後、上清を慎重に除去する。純粋なHBSSの7ミリリットルを追加し、ピペットの連続した通路を通して組織を均質化し、最初に10ミリリットルの血清ピペット、5ミリリットルのピペット、最後にP1000マイクロピペットで組織を均質化します。均質化後、チューブを摂氏4度で5分間450倍gで遠心分離する。上清を捨て、各チューブに4ミリリットルのHBSSと10%FBSでペレットを再懸濁します。細胞を市販の前処理されたT75フラスコに移し、最適な細胞培養接着を行う。フラスコを37°Cのインキュベーターに37°Cで5%の二酸化炭素で30分間置き、付着します。その後、フラスコに10ミリリットルのDMEM F12を加え、摂氏37度、2泊で5%の二酸化炭素をインキュベートします。3日目に、T75フラスコから7ミリリットルの培養培地を取り出し、新鮮な補充DMEM F12を7ミリリットル加えます。フラスコをインキュベーターに戻します。5日目に、破片および非接着性細胞を除去するために、T75フラスコからすべての培地を14ミリリットルの新鮮な補充DMEM F12と交換する。その後、48時間ごとに、上清の6ミリリットルを除去し、培養の14日目まで新鮮な補充DMEM F12培地の7ミリリットルを追加します。14日目、6ミリリットルの上清を除去し、新鮮な補充されたDMEM F12培地を7ミリリットル加えた後、プラスチック包装でT75フラスコをしっかりと閉じます。200 RPMと摂氏37度の床軌道シェーカーに一晩置き、アストロサイトからミクログリアを機械的に解離します。15日目には、シェーカーからフラスコを取り出し、細胞解離を最適化し、ミクログリアの最大数を収穫するために、独自の媒体でフラスコを精力的に洗浄します。その後、上清を収集し、50ミリリットルの円錐管に移します。次に、各フラスコにトリプシンを4ミリリットル加え、アストロサイトを取り外すために摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、トリプシンを不活性化するためにサプリメントDMEM F12の5ミリリットルを追加します。フラスコを独自の媒体で洗い、内容物を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。遠心分離機 450回gで解約ミクログリアまたはアストロサイトを含む全てのチューブを摂氏4度で5分間行う。上清を捨てます。1 ミリリットルのサプリメント DMEM F12 のマイクログリアペレットと、10 ミリリットルの DMEM F12 のアストロサイトを再中断します。ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターでセルカウントに進みます。前処理された平底細胞培養プレートで所望の密度で、補充されたDMEM F12で細胞をプレートします。細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%を24時間インキュベートして、24時間加熱します。14日目、グリア細胞培養は機械的解離を受けた。これは、アストロサイト集団の純度89.5%、ミクログリア集団の96.6%の純度で観察された。C57BL6マウスからアストロサイトおよびミクログリアをT.cruzi Y.に感染させた後、2時間、48時間、および96時間後、チャンバーをメタノールで固定し、細胞ヌクレアーゼマーカーDAPIおよび抗GFAPで染色した。特定の蛍光抗体で標識された蛍光レポーターまたは寄生虫を発現する遺伝子組換え寄生虫の使用は、細胞核との区別が良いため、免疫蛍光顕微鏡を改善した。ここでは、2 つの例を示します。非商業的モノクローナル抗体2C2抗SSP4タンパク質で染色されたYFPおよびT.cruzi Y株を構成的に発現するT.gondii RH株。細胞凝集体を失わないように、細胞を注意深く洗うことが重要です。グリア細胞感染後、上清に存在するサイトカイン産生に関するELISA、タンパク質発現用のウェスタンブロッティング、RNA転写評価のためのリアルタイム定量PCRなどの他のパラメータを評価することができる。グリア細胞の機能に関連する多くの質問、例えば、その代謝、免疫応答、細胞生物学自体は、この技術によって対処され、恩恵を受けることができます。すべての原虫寄生虫は、ヒト細胞だけでなく、培養マウス細胞に感染することができるので、この寄生虫を扱うときに注意することが重要です。

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の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法...

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

ミクログリア生物学の成功の調査の一つの鍵は、CNS組織からの単離の間にex vivoでミクログリア免疫機能の維持である。蛍光イメージング、免疫細胞、および炎症誘発性刺激リポ多糖（LPS）とパム3 CSK 4（PAM）を用いたELISA次のミクログリアの活性化によって評価されるように、高純度と免疫機能細胞培養で回転振盪結果を経由してミクログリアを分離する。...

マウス新生児から保護免疫表現と機能皮質ミクログリアの分離

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin...

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

脂肪由来間葉系間質細胞(AdMSC)は、炎症に関連する疾患の治療に有用な強力な免疫調節特性を持っています。マウスのAdMSCと一次混合グリアの単離と培養、AdMSCの刺激による抗炎症遺伝子と成長因子のアップレギュレーション、AdMSCの遊走の評価、およびAdMSCと一次混合プリオン感染グリアとの共培養方法を示します。...

脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

このプロトコルはRNAの分析および細胞培養のようなそれに続く適用を促進する大人のマウス脊髄からの浄化されたastrocytesそしてミクログリアの隔離を概説する。これには、単離された細胞の品質と収量の両方を向上させるように設計された詳細な細胞解離方法と手順が含まれています。...

成体マウス脊髄からの純粋なアストロサイトおよびミクログリアの単離(Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord for the In Vitro Assays and Transcriptomic Studies)

学ぶ 新生マウス大脳皮質から星状膠細胞とミクログリアを同時に分離・培養する手法。Trypanosoma cruziやToxoplasma gondiiなどの原虫感染におけるグリア細胞の免疫応答を比較研究するのに有用です。

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

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