Un nuovo toolkit per la valutazione delle funzioni geniche utilizzando la stabilizzazione condizionale Cas9

Questo metodo fornisce un editing rapido e a temperatura controllata del gene CRISPR-Cas9 sotto una piccola molecola, Shield-1. Offre anche meno effetti off-target, minore tossicità cellulare e anche un maggiore editing genetico controllato internamente quando lo si confronta con l'attivazione costitutiva di Cas9. Il vantaggio principale di questa particella è che può essere utilizzata per la caratterizzazione di geni essenziali, nonché di geni di sopravvivenza tumorale.

La destabilizzazione di DD-Cas9 è indipendente dalla sua espressione, e questo permette al gene di interesse di essere co-espresso sotto lo stesso promotore. Questo metodo può essere facilmente applicato a studi in vivo e in vitro. Shield-1 può anche penetrare attraverso la barriera emato-encefalica, il che rende facile anche studiare i geni coinvolti nello sviluppo del cervello.

Semina uniformemente cellule HEK293T sane a una densità da uno a due milioni di cellule per piastra di coltura tissutale di 10 centimetri utilizzando 10 millilitri di dmEM di glucosio con FBS filtrato al 10%. Incubare le cellule nell'incubatore di colture tissutali al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 20 ore. Il giorno successivo, confermare che le cellule hanno raggiunto il 70% di confluenza con la microscopia a campo luminoso e che sono uniformemente disperse attraverso la piastra.

Cambiare il supporto un'ora prima della trasfezione con un volume finale di 10 millilitri. Preparare due tubi con 500 microlitri di media caldi. Aggiungere 25 microlitri di reagente di trasfezione al tubo uno e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

All'altro tubo, aggiungere una miscela di plasmidi. Mescolare il tubo uno con il tubo due per formare una miscela di trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia alle cellule HEK293T e incubare la piastra nell'incubatore di colture tissutali.

Dopo 18 ore, cambiare con attenzione il supporto a 10 millilitri di DMEM fresco con il 10% fbs per rimuovere il reagente di trasfezione. Incubare le cellule per le prossime 48 ore. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante con una siringa da 10 millilitro e passarlo attraverso un filtro da 0,45 micrometri.

Aliquotare il surnatante del virus e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per determinare il titolo del virus, seminare 5 milioni di cellule HEK293T per pozzo in due piastre a sei pozzetti. Incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica durante la notte per raggiungere il 50-60% di confluenza.

Il giorno dopo, usa una delle piastre a sei pozzi per contare le cellule nei sei pozzi. Scongelare l'aliquota del virus che verrà utilizzata per eseguire la diluizione seriale e aggiungere otto microgrammi per millilitro di reagente polibrene, preparare DMEM con 10% FBS per la diluizione seriale del virus e aggiungere il reagente polibrene. Preparare due millilitri di diluizioni seriali dieci volte del lentivirus da 0,1 a 0,0001 in mezzi contenenti polibrene.

Rimuovere i media dalla piastra a sei pozzetti e aggiungere un millilitro di diluizioni virali ai pozzetti, lasciando un pozzo con il solo supporto come controllo negativo e uno bene con il virus al 100%. Incubare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, rimuovere il supporto con il virus dalle piastre a sei pozzi e cambiarlo in due millilitri di DMEM fresco con il 10% di FBS.

Incubare le cellule per 48-72 ore, osservando GFP con un microscopio fluorescente ogni giorno. Dopo 48-72 ore, staccare le cellule e risuscivarle nel massimo tampone. Utilizzare un citometro a flusso per determinare la percentuale di espressione di GFP e calcolare il titolo del virus utilizzando la formula fornita nel manoscritto di testo.

Placcare la linea cellulare di interesse in una piastra di 10 centimetri e incubare durante la notte per raggiungere la confluenza dal 50 al 60%, quindi infettare le cellule con 500-2.000 microlitri di particelle virali in un volume totale di 10 millilitri di terreno di coltura. Incubare il mezzo virale per 24 ore. Il giorno successivo, cambia il mezzo virale in mezzo di coltura e determina la percentuale di cellule GFP positive usando la citometria a flusso.

Selezionare le celle GFP positive utilizzando BD FACSAria II per l'ordinamento delle celle. Espandere le celle selezionate positivamente e congelare il brodo. Placcare separatamente le cellule selezionate positivamente e le cellule non trasdotte in piastre a 12 fori, 24 ore dopo l'infezione.

Attendere che le cellule si attacchino e cambino il supporto in un supporto di coltura cellulare contenente 200 shield-1 nanomolari. Sostituire il mezzo nelle piastre con cellule trasdotte e non trasdotte, lasciando due pozzetti per piastra con mezzi regolari come controllo negativo. Incubare ed estrarre proteine da ciascun pozzo a zero, due, sei, 12, 24, 48 e 72 ore dopo l'aggiunta di Shield-1 ai pozzi.

Quindi rimuovere il supporto con Shield-1 dal resto dei pozzi e cambiarlo con il normale supporto cellulare. Raccogli le proteine da quei pozzi a due, sei e 12 ore dopo aver cambiato il mezzo. L'induzione della proteina Cas9 è stata confermata dal fatto che i suoi livelli di espressione sono simili tra le cellule trasdotte e il veicolo, nonostante la presenza o l'assenza di Shield-1.

C'è sufficiente induzione dell'espressione di Cas9 nella linea cellulare A549 trasdotta due ore dopo il trattamento con Shield-1, che diventa trascurabile entro sei-12 ore dopo il ritiro di Shield-1. Le cellule A549 trasdotte trattate con Shield-1 sono diminuite di numero dopo 48 ore senza influenzare il campione di Rinella, che è stato convalidato mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo contro la proteina RPA3 impoverita. L'inversione dell'editing genetico o le mutazioni indel sono state confermate utilizzando saggi di nucleasi topografica.

Il costrutto vettoriale di lentivirus progettato era un sistema bicistronico con un altro gene di interesse sotto lo stesso promotore EF-1a. Una proteina fluorescente modificata, P2A, è stata aggiunta per rintracciare le cellule infette. L'espressione della proteina mVenus è stata osservata nelle cellule trasdotte del veicolo e dell'A549, indipendentemente dall'espressione di DD-Cas9 e dal trattamento con Shield-1.

La trasduzione efficiente della linea cellulare con il vettore DD-Cas9 è uno dei passaggi limitanti della velocità, per avere cellule HEK293T sane e utilizzare il loro basso numero di passaggio è cruciale. L'ottimizzazione del rapporto tra plasmide DD-Cas9, plasmide di imballaggio e plasmide di involucro è molto importante per una trasfezione ottimale. Ma oltre ad esso, anche la quantità di Shield-1 necessaria per stabilizzare le cellule bersaglio DD-Cas9 è qualcosa a cui devi stare attento.

È disponibile anche il DD-Cas9 con il plasmide Cre e può essere utilizzato per studiare le interazioni genetiche in studi in vivo basati sul sistema Cre-lox.