Name: Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dellimaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri un metodo non invasivo per monitorare in tempo reale la metastasi del cancro al seno nei polmoni utilizzando saggi della vena della coda e imaging in vivo con luciferasi e proteine fluorescenti.

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Ringraziamo Emily Norton per aver assistito con le infezioni virali e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche Ryan Kanai per l'aiuto nell'acquisizione di immagini dei polmoni e Kate E. Tubbesing per l'analisi delle immagini delle metastasi verdi nei polmoni. Ringraziamo il personale della struttura di ricerca sugli animali per il loro sostegno e per l'assistenza nella preparazione di questo video. Questo lavoro è stato supportato da un Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Fasi critiche del metodo È fondamentale ottimizzare il numero di cellule iniettate (passaggio 3) per una determinata linea cellulare e la deformazione del topo in quanto ciò può influenzare notevolmente il numero di metastasi che si formano e la lunghezza dell'esperimento. Se vengono iniettate troppe cellule o le metastasi crescono troppo a lungo, le metastasi possono essere difficili da contare rendendo gli effetti della manipolazione genetica difficili da valutare. Tuttavia, se vengono iniettate tro...

Il cancro rimane la seconda causa di morte in tutto il mondo1 e la metastasi è responsabile della maggior parte di questi decessi2,3. Tuttavia, una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che governano la colonizzazione metastatica e la successiva crescita ha ostacolato lo sviluppo di trattamenti efficaci per la malattia metastatica. L'identificazione di nuovi obiettivi terapeutici richiede un saggio per testare come l'espressione o la funzione perturbata di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Sebbene i modelli di mouse autoctonomi abbiano i loro vantaggi, richiedono molto tempo e sono costosi da generare, il che li rende più adatti per la convalida degli obiettivi piuttosto che per l'individuazione della destinazione. I sistemi modello di trapianto in cui il gene candidato è perturbato nelle cellule tumorali in vitro e quindi gli effetti sul potenziale metastatico sono valutati in vivo, sono meno costosi e una maggiore produttività rispetto ai modelli autoctoni. Inoltre, sono ampiamente disponibili vettori virali per la consegna stabile di RNAi, CRISPR/CAS9 e transgene, il che rende relativamente facile perturbare praticamente qualsiasi gene o gene di interesse in linee cellulari tumorali. Questo approccio può essere utilizzato anche per esaminare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione metastatica e nella crescita delle linee cellulari del cancro umano trapiantando le cellule in topi immunocompromessi o umorizzati.
I due tipi di saggi utilizzati per testare la formazione di metastasi da cellule tumorali trapiantate in vivo sono saggi di metastasi spontanei e saggi di metastasi sperimentali. Nei saggi di metastasi spontanea4,5, le cellule tumorali vengono iniettate nei topi, permesso di formare un tumore primario, e quindi la formazione spontanea di metastasi e la crescita successiva sono formulati. La forza di questo modello è che le cellule devono completare tutte le fasi del processo metastatico al fine di formare tumori metastatici. Tuttavia, molte linee cellulari tumorali non metastatizzano in modo efficiente nei modelli di metastasi spontanee, e qualsiasi manipolazione delle cellule che colpisce la crescita primaria del tumore può confondere i risultati del saggio di metastasi. I saggi sperimentali di metastasi, in cui le cellule tumorali vengono iniettate direttamente nella circolazione, vengono utilizzati per evitare queste insidie. I più saggi di metastasi sperimentale comuni includono l'iniezione dellavenadella coda6,7,8 (e qui riportata), l'iniezione intracardiaca9e l'iniezione di vena del portale10.
Lo scopo del protocollo qui presentato è quello di fornire un test di metastasi sperimentale in vivo che consente a un ricercatore di monitorare la formazione e la crescita delle metastasi in tempo reale, nonché di quantificare il numero e le dimensioni della metastasi del punto finale nei polmoni dello stesso topo. Per raggiungere questo obiettivo, i tradizionali saggi sperimentali della vena della coda6,7,8 sono combinati con l'imaging animale vivo, utilizzando un dispositivo di imaging in vivo9,11,12,13,14. Le cellule tumorali che esprimono stabilmente sia la luciferasi che una proteina fluorescente vengono iniettate nei topi attraverso la vena laterale della coda e quindi il dispositivo di imaging in vivo viene utilizzato per misurare i cambiamenti nel carico metastatico nei polmoni nel tempo (Figura 1). Tuttavia, il dispositivo di imaging animale vivo in vivo non può distinguere o misurare le dimensioni delle singole metastasi. Così, alla fine dell'esperimento, uno stereomicroscopio fluorescente viene utilizzato per contare il numero e misurare la dimensione delle metastasi fluorescenti nei polmoni senza la necessità di sezionamento e istologia o immunohistochimica (Figura 1). Questo protocollo può essere utilizzato per testare come alterare l'espressione o la funzione di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Possono essere testati anche potenziali composti terapeutici come piccole molecole o anticorpi di blocco delle funzioni.
Per dimostrare questo approccio, abbiamo prima eseguito un esperimento proof of concept in cui il fattore di replicazione essenziale, la proteina di replicazione A3 (RPA3) viene abbattuta nelle cellule metastatiche del cancro al seno del topo. Mostriamo che i topi iniettati con cellule knockdown RPA3 hanno significativamente meno carico metastatico ad ogni punto di tempo rispetto ai topi iniettati con cellule di controllo. L'analisi dei polmoni contenenti metastasi mostra che questo ridotto carico metastatico è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente ridotta e di una crescita compromessa delle metastasi che si formano. Per dimostrare ulteriormente questa tecnica, abbiamo testato se la composizione simultanea di proteine associate AYes (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TA) non compromette la colonizzazione metastatica o la crescita successiva. YAP e TAÀ sono due co-attivatori trascrizionali correlati che sono gli effetti a valle critici del Sentiero Ippopotamo. Abbiamo15,16 e altri hanno implicato YAP e TAz in metastasi (recensito in17,18,19), suggerendo che queste proteine sono buoni obiettivi terapeutici. Coerentemente, abbiamo scoperto che i topi iniettati con cellule knockdown YAP/TAz avevano significativamente ridotto l'onere metastatico. L'analisi dei polmoni ha mostrato che le cellule knockdown YAP/TAz formavano molte meno metastasi e che le metastasi che si formavano erano più piccole. Questi esperimenti dimostrano come i saggi sperimentali di metastasi consentano a un ricercatore di testare in modo rapido ed economico il ruolo di un gene candidato nella formazione e nella crescita delle metastasi. Essi mostrano inoltre come l'uso combinato di imaging animale vivo e quantificazione fluorescente di metastasi in polmoni interi permette al ricercatore di comprendere meglio i passi durante la colonizzazione metastatica.

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE Gel</td><td></td><td></td><td>per western blot</td></tr><tr><td>2,5% tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Tripsina per coltura tissutale</td></tr><tr><td>96 piastre di saggio bianche a fondo piatto Corning</td><td></td><td>3922</td><td>Per misurare il segnale della luciferasi e della renilla nelle cellule in coltura</td></tr><tr><td>Salviette imbevute di</td><td></td><td></td> alcol <td>Per sterilizzare il sito di iniezione prima dell'iniezione della vena caudale</td></tr><tr><td>Topi BALB/C ( femmina, 6 settimane)</td><td>Taconic</td><td>BALB-F</td><td>Per la colonizzazione metastatica della vena caudale e i saggi di carico</td></tr><tr><td>BSA regolare</td><td>VWR Ameresco</td><td>97061-416</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td>di lisi cellulare</td> Segnalazione cellulare <td>Per la raccolta di campioni di protien</td></tr><tr><td>Filtri per siringhe Celltreat, PES 30mm, 0,45 e mu; m</td><td>Celltreat</td><td>40-229749-CS</td><td>Per filtrare il surnatante virale</td></tr><tr><td>CO2 e la camera</td><td></td><td></td> di eutanasia <td>Per l'eutanasia dei topi</td></tr><tr><td>Kit di saggio reporter a doppia luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Per misurare il segnale della luciferasi e della renilla in cellule in coltura</td></tr><tr><td>Dulbecco& 39; soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>per PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Utilizzato per diluire la tripsina per la coltura tissutale</td></tr><tr><td>FBS 100% origine statunitense</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Componente del terreno di coltura completo</td></tr><tr><td>Fujifilm LAS-3000 gel imager</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>per western blot</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Rabibit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>2118</td><td>per Western blot</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG (H+L) Anticorpo secondario, HRP coniugato</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>Cellule renali embrionali umane, HEK-293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>Linea cellulare utilizzata per l'impacchettamento del virus</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/High clucosio</td><td>GE Healthcare life sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Componente del mezzo di crescita completo</td></tr><tr><td>Igromicina B, grado ultra puro</td><td>VWR Ameresco</td><td>97064-810</td><td>Per la selezione di antibiotici di cellule infette</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Micropiastra multimodale/EA</td> Dispositivi <td></td><td>molecolari</td><td>Per misurare il segnale della luciferasi e della renilla in cellule in coltura</td></tr><tr><td>Imagej</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per l'analisi delle immagini delle metastasi polmonari: soglia impostata su 25 e 100</td></tr><tr><td>Membrana Immuno-Blot PVDF</td><td>Biorad</td><td>1620177</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td></td><td></td><td>Per anestesia del topo</td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Sistema di imaging in vivo (dispositivo di imaging in vivo di animali vivi)</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136340</td><td>Per l'imaging in vivo del carico metastatico</td></tr><tr><td>Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP e filtri per campo chiaro)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microscopio e fotocamera per la visualizzazione, il conteggio e la misurazione delle metastasi nei polmoni; ingrandimento 10X, esposizione 3,5 sec, guadagno 1,4</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Componente del terreno di crescita completo</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Per la trasfezione</td></tr> <tr><td>reporter YAP/TAZ-TEADLiving Image 3.2 (programma software di immagine)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software per</td></tr><tr><td>IVIS Cellule di cancro al seno di topo, 4T1</td><td>Karmanos Cancer Institute</td><td>Aslakson, CJ et al.,1992</td><td>Linea cellulare di cance mammaria metastatica di topo</td></tr><tr><td>Multi-Gauge versione 3.0</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Software per la quantificazione dell'intensità della banda di western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM (tampone di trasfezione)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Per il confezionamento di virus e trasfezione</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente del terreno di crescita completo</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Per quantificare la concentrazione proteica</td></tr> Mini <tr><td>compresse di inibitore della fosfatasi Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32957</td><td>Aggiunto al tampone di lisi cellulare</td></tr><tr><td>Mini compresse</td> <td>di inibitore della proteasi PierceThermo Scientific</td><td>A32953</td><td>Aggiunto al tampone di lisi cellulare</td></tr><tr><td>Polybrene (bromuro di esadimetrina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Per l'infezione</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Per la selezione antibiotica delle cellule infette</td></tr><tr><td>Rintreno</td><td></td><td></td> per roditori <td>Per trattenere i topi durante l'iniezione della vena caudale</td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td></td><td></td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>TAZ (V3886) Anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4883</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>TBST tampone</td><td></td><td></td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>TC20 contatore cellulare automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Vettori Vedere la</td><td></td><td></td><td>Tabella 1 per l'elenco completo dei vettori</td></tr><tr><td>VWR Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>VWR</td><td>89404-464</td><td>Per la visualizzazione della fluorescenza in Cellule marcate ZSGreen</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di trasferimento occidentale <td>Per western blot</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin K+ Sale</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>Substrato iniettato nei topi per immagini IVIS bioluminescenti in vivo</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione del DNA X-tremeGENE 9 (soluzione lipidica per la trasfezione)</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Per il confezionamento di virus</td></tr><tr><td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>14074</td><td>Per la macchia occidentale</td></tr></tbody></table>

uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

La metastasi è la principale causa di decessi correlati al cancro e ci sono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con malattia metastatica. L'identificazione e il collaudo di nuovi obiettivi terapeutici che faciliteranno lo sviluppo di migliori trattamenti per la malattia metastatica richiede modelli preclinici in vivo. Dimostrata qui è un modello di topo singenico per la soranalisi della colonizzazione metastatica del cancro al seno e la crescita successiva. Le cellule tumorali metastatiche sono tradusse stabilmente con vettori virali che codificano le luciferasi delle lucciole e le proteine verdi. I geni candidati vengono poi manipolati stabilmente nelle cellule tumorali che esprimono luciferasi / sGreen e quindi le cellule vengono iniettate nei topi attraverso la vena della coda laterale per testare la colonizzazione e la crescita metastatica. Un dispositivo di imaging in vivo viene quindi utilizzato per misurare la bioluminescenza o la fluorescenza delle cellule tumorali negli animali viventi per quantificare i cambiamenti nel carico metastatico nel tempo. L'espressione della proteina fluorescente consente di quantificare il numero e le dimensioni delle metastasi nei polmoni alla fine dell'esperimento senza la necessità di sezionare o colorare istologico. Questo approccio offre un modo relativamente rapido e semplice per testare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione e nella crescita metastatica e fornisce molte più informazioni rispetto ai tradizionali saggi di metastasi della vena della coda. Utilizzando questo approccio, mostriamo che il knockdown simultaneo di yes associated protein (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TAz) nelle cellule di cancro al seno porta a una riduzione del carico metastatico nei polmoni e che questo carico ridotto è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente compromessa e di una ridotta crescita delle metastasi.

Per dimostrare l'approccio di cui sopra, abbiamo eseguito un esperimento proof of concept in cui un fattore di replica critico, RPA3 è stato abbattuto in una linea di cellule carcinoma di mammario topoto metastatico (4T122). Mentre il protocollo descrive l'etichettatura delle cellule con proteine luciferasi e fluorescenti prima della manipolazione genetica, abbiamo usato un approccio modificato perché i vettori RNAi forniscono anche il verde(Figura 2A...

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Il nostro protocollo può essere utilizzato per testare rapidamente e facilmente il ruolo di qualsiasi gene candidato nella colonizzazione metastatica e nella crescita. Il protocollo consente anche il monitoraggio in tempo reale della metastasi, della formazione e della crescita, nonché la quantificazione del numero e delle dimensioni della metastasi negli stessi animali senza la necessità di resezione o colorazione istologica. Placca quattro celle T1 a 150.000 cellule per pozzo in una piastra da 12 po 'in un supporto di crescita completo.Incubare a 37 gradi Celsius 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno dopo, aspira i mezzi di crescita dalle cellule. Aggiungere 500 microlitri di supernatante virale luciferasi e 500 microlitri di proteina fluorescente supernatante virale per infettare simultaneamente le cellule con i supernatanti virali della luciferasi e della proteina fluorescente.Quindi, aggiungere un microlitro di otto milligrammi per bromuro di esadimetrina millilitro e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Tripinare le quattro cellule T1 con 500 microlitri di tripina. Dopo due o cinque minuti, trasferire tutte le cellule su un piat

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