Analisi della permeabilità della barriera sangue-encefalica attraverso l'attraversamento microbico attraverso le cellule endoteliali microvascolari
14 febbraio 2020
La barriera emato-encefalica umana previene selettivamente la penetrazione di molecole idrofile e patogeni nel cervello. Diverse patologie, tra cui meningite e delirio postoperatorio, sono associate a una maggiore permeabilità della barriera emato-encefalica. Qui, descriviamo un modello di coltura cellulare endoteliale per testare la permeabilità della barriera mediante attraversamento microbico.
Questo metodo consente di analizzare la barriera ematico-encefalica umana misurando la traversata batterica su diversi trattamenti. Può aiutare a scoprire la patogenesi della meningite batterica e delirio postoperatorio. È un metodo semplice e gli effetti del trattamento sono direttamente rappresentati dal numero di batteri.
Può essere modificato per consentire un'analisi ad alta produttività dei composti sulle cellule endoteliali. Inizia assemblando la piastra da 12 po 'in un armadietto di sicurezza biologico. Spacchettare la piastra e ogni inserto, quindi utilizzare le forcep sterilizzate per afferrare gli inserti alla loro base e metterli nei pozzi.
Rivestire la membrana porosa di ogni inserto con 90 microlitri di 10 microgrammi per microlitro collagene IV e miscela di fibronectina e incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti due volte pipettando un millilitro di PBS in ogni inserto e aspirarlo con una pompa per vuoto. Quindi equilibrare le membrane pipettando il mezzo DMEM F12 prebellico nelle camere superiore e inferiore e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Per seminare le cellule endoteliali microvascolari umane, aspirare il mezzo dal pallone di coltura cellulare e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS. Coprire completamente le cellule con cinque millilitri di EDTA di tripside e incubare il pallone per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Trasferire cinque millilitri delle cellule in un tubo da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di FCS contenenti mezzo per fermare la reazione enzimatica.
Centrifugare la sospensione per tre minuti a 210 volte g, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in cinque millilitri di mezzo. Aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a 10 microlitri dello 0,4% di macchia blu trypan, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela a una camera di conteggio. Mettere la camera di conteggio nel contatore della cella e avviare il programma appropriato assicurandosi che il contatore sia focalizzato.
Dopo il conteggio, seminare 200.000 cellule in ogni camera superiore sulla piastra da 12 pozzi e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 14 giorni cambiando il supporto nella camera superiore e inferiore ogni due o tre giorni. Dopo 14 giorni, assicurarsi che la confluenza cellulare sia al 100% imaging con un microscopio. Un giorno prima della misurazione della permeabilità, mettere una colonia di ceppo E.coli GM2163 in tre millilitri di mezzo LB.
Coltura delle cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore in uno shaker di incubazione. Per trattare le cellule con un composto di interesse, diluirlo alla sua concentrazione finale nel mezzo DMEM F12 e aggiungere questa miscela nelle camere superiore e inferiore nella piastra da 12 po ', quindi incubare la piastra in un incubatore di coltura cellulare. Dopo l'incubazione, scambiare il mezzo completo con un mezzo privo di antibiotici.
Determinare la concentrazione della coltura batterica durante la notte misurando la sua densità ottica a 600 nanometri, quindi diluirla in un OD600 di 0,5 in un tubo Falcon da 50 millilitri. In un armadio di sicurezza biologico, aggiungere 450 microlitri della soluzione batterica in ogni camera superiore della piastra da 12 po ', quindi incubare la piastra per sei ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere l'inserto con le forcep e campionare 50 microlitri del mezzo da ogni camera inferiore facendo attenzione a non versare il mezzo dalle camere superiori in quelle inferiori.
È importante separare rigorosamente i supporti della camera superiore e inferiore poiché una fuoriuscita dai batteri della camera superiore porterebbe a risultati falsi positivi. Far cadere ogni campione su una piastra di agar separata e striature la soluzione con uno spargitore di cellule. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore, quindi contare le colonie.
Per studiare l'effetto della glicazione sull'attraversamento microbico attraverso la barriera ematica- encefalica, le cellule sono state trattate con una soluzione glimosale da 0,5 e 0,15 millimolare per un'ora con cellule non trattate che fungono da controllo. La glicazione è stata quindi rilevata tramite immunoblotting con anticorpi anti-AGE. Le colonie batteriche ottenute furono contate e rappresentate come il numero assoluto di colonie o il numero relativo di colonie normalizzate al controllo.
Campioni trattati con glioxale mostravano un numero maggiore di colonie che indicavano che il trattamento ha un effetto sulla densità della barriera cellulare. Per studiare la glicazione proteica indotta dal glucosio, i THBMEC sono stati coltivati in glucosio normale e mezzo di glucosio elevato. Il numero assoluto di colonie e il numero relativo di colonie normalizzate al controllo indicavano che il glucosio non aveva alcun effetto significativo sull'integrità della barriera ematico-encefalica.
Le cellule endoteliali trattate possono essere ulteriormente analizzate mediante approcci proteomici, ad esempio la spettrometria di massa, per analizzare i cambiamenti nel proteoma. Questa tecnica aiuta a comprendere la barriera ematico-encefalica umana e il traverso batterico. Può essere utilizzato per scoprire aspetti dell'invecchiamento e malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per analizzare la barriera ematoencefalica umana (BBB) misurando il passaggio batterico in diverse condizioni sperimentali. L'obiettivo è migliorare la comprensione di patologie come la meningite batterica e il delirium postoperatorio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microbiologia
Sfondo
- La BEE regola selettivamente l'ingresso di molecole idrofile e patogeni nel cervello.
- Un'aumentata permeabilità della BEE è associata a diverse patologie.
- Comprendere la permeabilità della BEE può contribuire a scoprire la patogenesi di alcune malattie.
- I modelli di coltura cellulare endoteliale sono essenziali per lo studio delle proprietà della BEE.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello affidabile per testare la permeabilità della barriera ematoencefalica.
- Studiare gli effetti dei trattamenti sul passaggio microbico.
- Esplorare le implicazioni per le malattie associate a disfunzioni della barriera ematoencefalica.
Metodi Utilizzati
- Rivestimento degli inserti con collagene IV e fibronectina per la coltura cellulare.
- Seeding di cellule endoteliali microvascolari umane e mantenimento per 14 giorni.
- Misurazione del passaggio batterico mediante l'uso di E. coli e analisi dei risultati tramite conteggio delle colonie.
- Valutazione degli effetti della glicazione sul passaggio microbico mediante trattamento con glicossale.
Risultati principali
- Il trattamento con glicossale ha aumentato il numero di colonie batteriche, indicando una modifica della densità della barriera.
- Condizioni di alta glucosio non hanno influenzato in modo significativo l'integrità della BEE.
- Approcci proteomici possono analizzare ulteriormente le cellule endoteliali trattate.
- Il metodo consente un'analisi ad alto rendimento di composti che influenzano la BEE.
Conclusioni
- Il modello sviluppato è efficace per lo studio della permeabilità della barriera ematoencefalica.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della patogenesi delle malattie neurologiche.
- Ulteriori ricerche possono utilizzare questo metodo per esplorare l'invecchiamento e le condizioni neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una valutazione quantitativa della permeabilità della barriera ematoencefalica attraverso il transito microbico, fornendo un'analisi funzionale per la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale. Collegando l'integrità della barriera a fenotipi rilevanti per la malattia, come meningite e delirio, supporta la riduzione dei rischi meccanicistici delle ipotesi terapeutiche. Il formato del saggio permette lo screening di composti che modulano la funzione della barriera endoteliale, guidando l'identificazione dei composti promettenti e aumentando la previsione di efficacia nei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Esamina ipotesi terapeutiche riguardo alla permeabilità della barriera e ai meccanismi di attraversamento dei patogeni.
- Valore operativo: Fornisce un’uscita quantitativa basata sul conteggio delle colonie per la validazione funzionale del bersaglio.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando composti che modificano la densità della barriera con rilevanza per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera sistemi biologici validati per lo screening di composti e la valutazione della permeabilità.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi mediante la coltura definita di cellule endoteliali su collagene IV/fibronectina.
- Scalabilità: Consente l'analisi ad alto rendimento degli effetti dei composti sulle cellule endoteliali, come indicato nel protocollo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza traslazionale: Modella il passaggio microbico associato a patologie come la meningite, consentendo la valutazione di sistemi rilevanti per la malattia.
- De-risking meccanicistico: Permette l'analisi di fattori cellulari endogeni ed effetti della glicazione sull'integrità della barriera.
- Continuità preclinica: Supporta decisioni di avanzamento ponderate sul rischio collegando la permeabilità in vitro alla patogenesi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, in particolare per terapie mirate al sistema nervoso centrale in cui la capacità di attraversare le barriere è un parametro critico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione di barriera e la chiarificazione dei percorsi mediante modelli di glicazione e trattamento con glucosio.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e output quantitativi per valutare gli effetti dei composti sulla permeabilità endoteliale.
- Analisi: Fornisce variabili dipendenti misurabili (conteggio delle colonie) che consentono il confronto tra diverse condizioni di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando il transito batterico rilevante per le infezioni e l'infiammazione neurologica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare la modulazione della BEE in diverse librerie di composti e modelli di malattia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella funzione di barriera.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità attraverso una coltura cellulare definita e misurazioni del passaggio.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione identificando precocemente composti che modulano la barriera, riducendo i rischi biologici nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio basata su profili di permeabilità della barriera ematoencefalica associati ai meccanismi delle malattie.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nella tecnica asettica e nella manipolazione microbica all'interno di una cappa a sicurezza biologica.
- È dipendente da strumentazione per il conteggio cellulare, l'incubazione e la quantificazione delle colonie.
- Necessita di una standardizzazione congiunta tra i flussi di lavoro di biologia e microbiologia per prevenire artefatti di contaminazione incrociata.
- Richiede valutazioni di adattamento qualora si voglia estendere ad altri ceppi batterici o modelli patogeni.
- I limiti pratici includono la finestra di incubazione di sei ore e la necessità di una rigorosa separazione delle camere per evitare falsi positivi.
