Name: Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dellRNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Scopri un metodo di screening rapido per identificare i soppressori del silenziamento dell'RNA nei patogeni vegetali usando Nicotiana benthamiana. Questa tecnica migliora l'efficienza e l'accuratezza degli screening.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del "Programma Shuguang" della Shanghai Education Development Foundation e della Shanghai Municipal Education Commission, del National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (n. 31571696 e 31660510), il Thousand Talents Program for Young Talents of China e la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18D-2260500).

NOTA: Tutte le fasi della procedura devono essere condotte a temperatura ambiente (RT).
AVVISO: Depositare tutti i supporti contenenti microbi patogeni, nonché le piante e i tessuti vegetali utilizzati nel saggio, nei contenitori di rifiuti appropriati e nell'autoclave prima di scartare.
1. Preparazione di costrutti di plasmide contenenti effetti putativi
<ol><li>Selezionare gli effettori setomessi secreti che sono altamente espressi durante l'infezione, come determinato dal sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq), e ulteriormente dalla tecnica PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR).</li>
	<li>Determinare il sito di scissione peptide del segnale di ogni effettore utilizzando uno strumento software come SignalP18.</li>
	<li>Progettare primer ed eseguire la PCR per amplificare il gene codificando l'effetto di interesse utilizzando la polimerasi del DNA ad alta fedeltà. Eseguire l'elettroforesi gel agarose per controllare il prodotto PCR, quindi clonare l'amplificatore in gateway entry vector pQBV3 utilizzando il kit di clonazione senza legatura (Table of Materials), e successivamente nella destinazione espressione vettore pEG100 utilizzando la reazione di ricombinazione LR19.</li>
	<li>Trasformare 3x5 l di miscela di reazione LR in 100 gradi di cellule competenti di E. coli (ad es., TOP10, DH5), diffondere le cellule batteriche trasformate sul mezzo agar Luria-Bertani (LB) integrato con 50 g/mL di kanamycin, e incubare a 37 gradi centigradi per 16-20 h. NOTA: I trasformazioni positivi possono essere identificati dalla colonia PCR20 e ulteriormente analizzati da miniprep e sequenziamento plasmide.</li>
	<li>Introduci 50-100 ng di plasmidi ricombinanti che trasportano la proteina esecuente in 100 gradi l di cellule A. tumefaciens chimicamente competenti (ad esempio, GV3101 o C58C1), mescola delicatamente, e poi congela l'azoto liquido per 1 min. Scongelare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Aggiungete 500 ldi di brodo LB e incubate a 30 gradi centigradi per 4/6 h con agitazione delicata, quindi trasferite e sparse tutte le cellule agrobatteriche sul mezzo LB agar integrate con 50 g/mL di kanamycin e 50 g/mL rifampicina a 30 s per 2 giorni. NOTA: i cloni positivi possono essere verificati dalla colonia PCR.</li>
	<li>Usa una singola colonia trasformata per esperimenti di infiltrazione agro-agrose, se non diversamente indicato. NOTA: Nella presente ricerca, nessuno dei geni efmortivi testati conteneva introni previsti; ciascuno dei geni è stato direttamente amplificato dal DNA genomico di un isolodio fitofathora. Un vettore di espressione della pianta Gateway senza tag è consigliato, ma non necessario.</li>
</ol>2. Preparazione delle piante N. benthamiana 16c
<ol><li>Preparare miscele di terreno in vaso costituite da (per volume) muschio di torba, 30% perlite, e 20% vermiculite, e autoclave a 120 gradi centigradi per 20 min.</li>
	<li>Immergere le miscele di terreno autoclaved con soluzione di fertilizzante vegetale (1 g/L) e sotto-imballarle in vasi più piccoli (80 mm x 80 mm x 75 mm) conservati in un vassoio più grande (540 mm x 285 mm x 60 mm).</li>
	<li>Semina uno o due semi di N. benthamiana 16c sulla superficie del suolo di ogni vaso. Coprire il vassoio con una cupola di plastica e lasciare germinare i semi.</li>
	<li>Mettete il vassoio sotto camere di crescita illuminate e a temperatura controllata con una temperatura di 23,25 gradi centigradi, un'umidità relativa del 50-60% e un fotoperiodo di lunga giornata (14 h luce/10 h di buio, con illuminazione a 130,150s-e-2s-1).</li>
	<li>Togliere la cupola di plastica dopo che i semi germinano (3-4 giorni) e lasciare che le piantine crescano nelle stesse condizioni utilizzate per la fase di germinazione.</li>
	<li>Aggiungere una quantità appropriata di acqua, mantenendo il terreno umido ma non ammollo, ogni 2/3 giorni; aggiungere fertilizzante ogni 10 giorni per promuovere un'ulteriore crescita. Mantenere le piante N. benthamiana 16c in condizioni normali fino a quando non sono pronti per l'uso; in questa fase la pianta dovrebbe avere almeno cinque foglie vere completamente sviluppate e nessun ascellare visibile o boccioli di fiori, e le foglie dovrebbero avere un aspetto verde sano).</li>
	<li>Usa foglie di N. benthamiana 16c di 3-4 settimane per i saggi locali sul silenziamento dell'RNA e le giovani piante N. benthamiana 16c (10-14 giorni) per i saggi sistemici di silenziamento dell'RNA. NOTA: le condizioni di crescita delle piante e le strutture variano da laboratorio a seconda dei laboratori; scegliere foglie sane, ben sviluppate e completamente espanse per l'infiltrazione.</li>
</ol>3. Preparazione della coltura dell'agrobacterium per l'infiltrazione
<ol><li>Raccogliere una colonia positiva dalla piastra LB e inoculare le cellule in tubo di vetro contenente 5 mL di lB medio integrato con 50 g/mL di kanamycin e 50 rifampicina g/mL. Far crescere le cellule a 30 gradi centigradi agitando a 200 giri/min per 24-48 h.</li>
	<li>Trasferire 100 l di coltura in 5 mL di LB medio integrato con gli stessi antibiotici, 10 mM 2-(N-morpholino) acido etanofonico (MES; pH 5,6) e 20-M acetosyringone (AS). Coltiva i batteri a 30 gradi centigradi con lo scuotimento a 200 giri/min per 16-20 h.</li>
	<li>Centrifuga cellule a 4.000 x g per 10 min. Versare il supernatante e rispendere il pellet in 2 mL di 10 mM MgCl2 tampone.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.3 per garantire la rimozione completa degli antibiotici.</li>
	<li>Determinare la densità della coltura dell'Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nm (OD600). Regolare su un buffer OD600 di 1,5,2,0 con 10 mM MgCl2.</li>
	<li>Aggiungere 10 mM MES (pH 5.6) e 150 M AS alle colture di sospensione finali e incubare le cellule a RT per almeno 3 h senza agitare. NOTA: Non lasciare le impostazioni di sospensione finali durante la notte.</li>
</ol>4. Co-infiltrazione N. foglie di benthamiana
<ol><li>Mescolare volumi uguali di una coltura agrobatterica contenente 35S-GFP con una coltura agrobatterica contenente 35S- cetriolo mosaico soppressore 2b (CMV2b), effetto reputatore, o vettore vuoto (EV).</li>
	<li>Attentamente e lentamente infiltrarsi le sospensioni miste di agrobacterium sui lati anassiali delle foglie di N. benthamiana 16c utilizzando una siringa senza aghi da 1 mL.</li>
	<li>Rimuovere la sospensione batterica rimanente dalle foglie con tergicristalli e cerchiare i margini delle patch infiltrate con una penna maker.</li>
	<li>Lasciare le piante infiltrate nella camera di crescita nelle stesse condizioni di crescita. NOTA: Per motivi di sicurezza e salute, occhiali protettivi e una maschera devono essere indossati durante l'infiltrazione. Per evitare la contaminazione incrociata, i guanti devono essere cambiati o sterilizzati con etanolo tra infiltrazioni. Normalmente è necessario almeno 1 mL di sospensioni di agrobacterium per foglia per l'infiltrazione. Per il silenziamento sistemico, saranno necessarie almeno due foglie per l'infiltrazione.</li>
</ol>5. Analisi delle immagini GFP
<ol><li>Rileva visivamente la fluorescenza GFP nelle foglie appena coltivate di piante intere 2 settimane dopo l'infiltrazione (per il silenziamento sistemico dell'RNA) o patch infiltrate di foglie 3-4 dpi utilizzando una lampada ultravioletta a onde lunghe (UV) senza raccolta foglie.</li>
	<li>Fotografa piante raccolte e/o foglie staccate con una fotocamera digitale dotata di filtri UV e gialli. NOTA: Per i saggi della soppressione del silenziamento locale, indaga sulle macchie infiltrate di foglie di N. benthamiana 16c, mentre per l'attività di soppressione del silenziamento sistemico, studia le foglie appena coltivate. L'attività di soppressione del silenziamento dell'RNA può variare tra i singoli effetti. Pertanto, osservare le patch o le foglie per alcuni giorni a partire da 3 dpi. Utilizzare CMV2b ed EV rispettivamente come controlli positivi e negativi.</li>
</ol>6. Analisi del bocche del nord dei livelli di mRNA GFP nelle foglie infiltrate
<ol><li>Isolamento dell'RNA totale dal tessuto fogliare utilizzando il reagente di isolamento dell'RNA (Tabella dei materiali)<ol>
<li>Raccogliere i tessuti fogliada da patch N. benthamiana 16c infiltrati a 4,7 dpi, polverizzare in azoto liquido in una polvere fine e trasferire la polvere in uno sterile tubo da 2 mL.</li>
		<li>Aggiungere il reagente di isolamento dell'RNA (1 mL/100 mg di tessuto) immediatamente al tubo campionato in un cappuccio, agitare vigorosamente per omogeneare e incubare RT per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere il cloroformio (reagente di isolamento RNA di 200 mL/1 mL) ad ogni tubo in un cappuccio, agitare vigorosamente per 15 s, e incubare a RT per 5 min. Centrifugare l'omogeneità a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Trasferire il supernatante in un nuovo tubo privo di RNase e scartare il pellet. Aggiungere 0,7 volume di isopropanolo al supernatante, invertire delicatamente più volte e incubare la miscela a RT per 10 min.</li>
		<li>Far precipitare il pellet di RNA per centrifugazione a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Scartare il supernatante, lavare il pellet con il 70% di etanolo e asciugare all'aria il pellet in un cappuccio. Sciogliere l'RNA nell'acqua trattata in pircarbonato dietil (DEPC) incubando in un bagno d'acqua di 65 gradi centigradi per 10-20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi del nord del livello di mRNA GFP nelle foglie infiltrate<ol>
<li>Preparare un 1,2% di formaldeide denaturazione gel agarose in 1x tampone da corsa MOPS.</li>
		<li>Mescolare l'RNA 1:1 con la tintura per il carico di RNA e la denaturazione per incubazione a 65 gradi centigradi per 10 min, raffreddare immediatamente i campioni denaturati sul ghiaccio per 1 min.</li>
		<li>Caricare i campioni sul gel ed elettroforese a 100 V per 50 min fino a quando l'RNA è ben separato.</li>
		<li>Risciacquare il gel nel tampone di citrato saline-sodio (SSC) per rimuovere la formaldeide e trasferire il gel nella membrana di nylon mediante trasferimento capillare nel buffer 20x SSC durante la notte. Immergere la membrana in 2x SSC e fissare l'RNA alla membrana esponendo la membrana umida al collegamento uv cross.</li>
		<li>Aggiungere la quantità appropriata di buffer di ibridazione (10 mL per 100 cm2 membrana; Tabella dei materiali) in un tubo di ibridazione e agitare a 60 gradi centigradi in un forno di ibridazione.</li>
		<li>Mettere la membrana nel tubo di ibridazione e incubare per 60 min a 60 gradi centigradi. Diluire una sonda di DNA con etichetta 5'DIG (concentrazione finale, 50 ng/mL) nella soluzione di ibridazione contenente buffer di ibridazione preriscaldato.</li>
		<li>Eliminare il buffer di preiibridazione e sostituirlo immediatamente con una soluzione di ibridazione preriscaldata contenente la sonda con etichetta DIG. Incubare la macchia con sonda a 60 gradi durante la notte, con agitazione delicata.</li>
		<li>Dopo l'ibridazione, lavare la membrana due volte in tamponi di rigore crescente a 60 gradi centigradi per 20 min ciascuno. Pulire delicatamente la membrana per rimuovere il buffer di lavaggio supplementare e aggiungere reagenti come suggerito nel kit di ibridazione e rilevamento chemiluminescente (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Rileva i segnali ibridati mediante reazione chemiluminescente combinata con il sistema di imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di difesa chiave impiegato dalle piante per combattere agenti patogeni virali, batterici, oomycete e fungini. A loro volta, questi microbi hanno sviluppato proteine soppressori silenziamento per contrastare il silenziamento antivirale, e questi RSS interferiscono con diversi passaggi del percorso di silenziamento dell'RNA22,23. Sono stati sviluppati diversi saggi di screening per identificare gli RSS10</...

Negli ultimi due decenni, l'accelerazione nel sequenziamento del genoma dei microrganismi che causano le malattie delle piante ha portato ad un divario di conoscenza sempre crescente tra le informazioni di sequenza e le funzioni biologiche delle proteine codificate1. Tra le molecole rivelate dai progetti di sequenziamento ci sono molecole echeggianti che sopprimono l'immunità innata e facilitano la colonizzazione dell'ospite; questi fattori sono secreti da patogeni vegetali distruttivi, tra cui batteri, nematodi e microbi filamentosi. Per rispondere a queste minacce, le piante ospiti hanno sviluppato nuovi recettori che riconoscono questi effetti, consentendo il ripristino della risposta immunitaria. Pertanto, gli esetritori sono soggetti a varie pressioni selettive, che portano alla diversificazione dei repertori degli efreattori tra le linee patogene2. Negli ultimi anni, gli effetti putativi da agenti patogeni vegetali hanno dimostrato di interrompere l'immunità innata delle piante impedendo i processi cellulari dell'ospite a beneficio dei microbi in una varietà di modi, tra cui la disregolazione delle vie di segnalazione, la trascrizione, il trasporto intracellulare, la stabilità del citoscheletro, il traffico di vescicoli e la messa a tacere dell'RNA3,4,5. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli effetti patogeni, in particolare quelli provenienti da patogeni filamentosi, sono rimasti enigmatici.
Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di inattivazione genica mediato dall'omologia che viene conservato tra gli eucarioti. Il processo è innescato da un lungo RNA a doppio filamento (dsRNA) e si rivolge all'RNA omologato a filamento singolo (ssRNA) in modo specifico della sequenza e manipola un'ampia gamma di processi biologici, compresa la difesa antivirale6. Per superare le risposte immunitarie innate dell'ospite, alcuni virus si sono evoluti per compensare il silenziamento dell'RNA, inclusa la capacità di replicarsi all'interno di compartimenti intracellulari o fuggire dal segnale riorganizzato del silenziamento. Tuttavia, la strategia più generale con cui i virus proteggono i loro genomi dalla perdita dipendente dal silenziamento dell'RNA della funzione genica è codificare proteine specifiche che sopprimono il silenziamento dell'RNA7,8. Diversi approcci meccanicistici sono stati stabiliti per vagliare e caratterizzare i soppressori virali del silenziamento dell'RNA (VSR), tra cui la co-infiltrazione delle colture di Agrobacterium tumefaciens, piante transgeniche che esprimono soppressori putativi, innesto e coltura cellulare9,10,11,12,13.
Ognuno di questi saggi ha vantaggi e svantaggi, e identifica VSR in modo proprio. Uno degli approcci più comuni si basa sulla co-infiltrazione delle singole colture A. tmuefaciens che ospitano la potenziale proteina virale e un gene reporter (tipicamente proteina fluorescente verde [GFP]) sulle piante di Nicotiana benthamiana 16c che esprimono costituitamente GFP sotto il controllo del virus del mosaico del caulfiore 35Sr. In assenza di un soppressore attivo del silenziamento virale, la GFP viene identificata come esogena dalle cellule ospiti e viene silenziata entro 3 giorni dopo l'infiltrazione (dpi). Al contrario, se la proteina virale possiede un'attività di soppressione, il livello di espressione della GFP rimane costante oltre i 3,9 dpi9. Questo saggio di co-infiltrazione è semplice e veloce; tuttavia, non è né altamente stabile né sensibile. Ciò nonostante, il saggio ha identificato numerosi VSR con diverse sequenze proteiche e strutture in molti virus dell'RNA7,8.
Recentemente, diverse proteine eftraenti che possono inibire l'attività di silenziamento dell'RNA cellulare sono state caratterizzate da patogeni batterici, oomycete e piante fungine14,15,16. Questi risultati implicano che la soppressione del silenziamento dell'RNA è una strategia comune per facilitare l'infezione che viene utilizzata dagli agenti patogeni nella maggior parte dei regni. In teoria, molti, se non tutti, degli effetti potrebbero codificare soppressori del silenziamento dell'RNA (RSS); ad oggi, tuttavia, solo alcuni sono stati individuati, principalmente a causa della carenza della strategia di screening affidabile e generale. Inoltre, i soppressori del silenziamento dell'RNA non sono stati studiati nella stragrande maggioranza degli agenti patogeni delle piante17.
In questa relazione, presentiamo un protocollo ottimizzato e generale per identificare gli effetti patogeni delle piante che possono sopprimere il silenziamento dell'RNA locale e sistemico utilizzando il saggio di agroinfiltrazione. L'obiettivo principale di questo studio era quello di enfatizzare gli aspetti chiave del protocollo e descrivere i passaggi in dettaglio, fornendo così un saggio di screening che è adatto a quasi tutti gli effetti degli agenti patogeni vegetali.

<table><tbody><tr><td>Acido 2-Morpholinoetansolfonic (MES)</td><td>Biofroxx</td><td>1086GR500</td><td>Tampone</td></tr><tr><td>2xTaq Master Mix</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P112-AA</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) acido propansolfonico (MOPS)</td><td>Amresco</td><td>0264C507-1KG</td><td>MOPS Tampone</td></tr><tr><td>Acetosiringone (AS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Induzione di Agrobacterium</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td>LB</td></tr><tr><td>medio Agarosio</td><td>Biofroxx</td><td>1110GR100</td><td>Elettroforesi</td></tr><tr><td>Amersham Hybond -N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303 B</td><td>Nothern blot</td></tr><tr><td>Amersham Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>Amersham Imager 600</td><td>Image</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>LB medium</td></tr><tr><td>Bacto Estrazione</td> <td>del lievitoBD Biosciences</td><td>212750</td><td>LB media</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Nikon</td><td>D5100</td><td>Fotografia</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Sistema di imaging</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulo di rilevamento chemiluminescente componente dei kit dafa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td>Rilevamento della luminescenza</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Amresco</td><td>0230-100G</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>ClonExpress II Kit di clonazione in un solo passaggio</td><td>Vazyme Biotech</td><td>C112-01</td><td>Legatura</td></tr><tr><td>DIG Easy Hyb</td><td>Sigma-Aldrich 11603558001</td><td></td><td>Tampone di ibridazione</td></tr><tr><td>Kit di minipreparazione del plasmide</td><td>Easypure TransGen Biotech</td><td>EM101-02</td><td>Estrazione del plasmide</td></tr><tr><td>EasyPure Kit di estrazione rapida su gel</td><td>TransGen Biotech</td><td>EG101-02</td><td>Estrazione su gel</td></tr><tr><td>EDTA sale disodico diidrato</td><td>Amresco/VWR</td><td>0105-1KG</td><td>MOPS Alimentatore per elettroforesi tampone</td></tr><tr><td></td><td>LiuYi</td><td>DYY6D</td><td>Elettroforesi dell'acido nucleico.</td></tr><tr><td>FastDigest EcoRV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0304</td><td>Gel di digestione vettoriale</td></tr><tr><td>Sistema di immagini</td><td>Tanon</td><td>Tanon3500</td><td>Immagine</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Amresco</td><td>0304-5G</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>Kanamicina Solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1914</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>LR Clonasi II</td><td>enzima Invitrogen</td><td>11791020</td><td>reazione LR</td></tr><tr><td>Membrana assorbente alla nitrocellulosa 0,45 um</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td>Kit</td></tr><tr><td>di etichettatura del dna primario casuale della biotina settentrionale NORTH2south</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075</td><td>Etichettatura della biotina</td></tr><tr><td>PCR Termociclatori</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Muschio di torba</td><td>PINDSTRUP</td><td>Oro scuro + argilla</td><td></td></tr><tr><td>Piante Peters Fertilizzante idrosolubile</td><td>ICE</td><td>Peter Fertilizzante professionale 20-20-20</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polimerasi</td><td>Vazyme Biotech</td><td>P505-d1</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>219549005</td><td>Antibiotici</td></tr><tr><td>RNA Gel Caricamento Colorante (2X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>RNA Gel Caricamento Colorante</td></tr><tr><td>Acetato di sodio Idrato</td><td>Amresco / VWR</td><td>0530-1KG</td><td>MOPS Buffer</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Amresco</td><td>0241-10KG</td><td>LB medio</td></tr><tr><td>Citrato trisodico</td><td>Amresco</td><td>0101-1KG</td><td>SSC Tampone</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Reagente di isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>Analytik Jena UVP</td><td>B-100AP</td><td>Osservazione</td></tr><tr><td>UVP Hybrilinker Forno</td><td>Analytik Jena</td><td>OV2000</td><td>Northern</td></tr></tbody></table>

screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'rna da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Il silenziamento dell'RNA è un meccanismo di regolazione genica evolutivamente conservato e specifico della sequenza negli eucarioti. Diversi patogeni delle piante hanno sviluppato proteine con la capacità di inibire il percorso di silenziamento dell'RNA vegetale ospite. A differenza delle proteine degli efmarcatori di virus, solo diverse proteine degli effetti secreti hanno mostrato la capacità di sopprimere il silenziamento dell'RNA nei patogeni batterici, oomycete e fungini, e le funzioni molecolari della maggior parte degli effetti rimangono in gran parte sconosciute. Qui, descriviamo in dettaglio una versione leggermente modificata del saggio di co-infiltrazione che potrebbe servire come metodo generale per osservare il silenziamento dell'RNA e per caratterizzare le proteine efsiate secrete dagli agenti patogeni delle piante. I passi chiave dell'approccio sono la scelta delle foglie sane e completamente sviluppate, l'adattamento della coltura batterica alla densità ottica appropriata (OD) a 600 nm e l'osservazione della fluorescenza delle proteine fluorescenti verdi (GFP) al momento ottimale sull'infiltrato per evitare di omettere effettori con debole attività di soppressione. Questo protocollo migliorato contribuirà a uno screening rapido, accurato ed approfondito dei soppressori per il silenziamento dell'RNA e servirà come un ottimo punto di partenza per studiare le funzioni molecolari di queste proteine.

In precedenza, descriviamo la procedura passo-passo per un migliore saggio di screening per valutare l'attività RSS degli efpelletori P. sojae RxLR. Complessivamente, l'esperimento richiede 5-6 settimane. Successivamente, gli RSS identificati dal saggio possono essere ulteriormente caratterizzati in termini di funzione e meccanismo molecolare. Come esempio del nostro approccio, abbiamo usato il P. sojae RxLR effecto Phytorphhsor di silenziamento dell'RNA 1 (PSR1), che vi...

Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell'RNA negli agenti patogeni delle piante.

Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come schermare i soppressori silenziatori dell'RNA secreti dagli agenti patogeni delle piante. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di fornire un saggio di screening rapido, accurato ed esteso per l'identificazione dei soppressori di silenziamento dell'RNA. Preparare miscele di terreno invaso composte per il 50% da muschio di torba, 30% perlite e 20% vermiculite e autoclave a 120 gradi Celsius per 20 minuti.Immergere le miscele di terreno autoclavato con la soluzione di fertilizzante vegetale a un grammo per litro e sottoconfezionarle in vasi più piccoli conservati in un vassoio più grande. Seminare uno o due semi di Nicotiana bethamiana 16c sulla superficie del suolo di ogni pentola. Coprire il vassoio con una cupola di plastica e lasciare germogliare i semi.Posizionare il vassoio sotto camere di crescita leggere e a temperatura controllata con una temperatura da 23 a 25 gradi Celsius, umidità relativa dal 50 al 60% e un fotoperiodo di una lunga giornata. Dopo tre o quattro giorni, i semi germinano. Togliere la cupola di plastica e lasciare che le piantine crescano nelle stesse condizioni utilizzate per la fase di germinazione.Ogni due o tre giorni, aggiungere una quantità appropriata di acqua mantenendo il terreno umido ma non in ammollo. Ogni 10 giorni, aggiungi fertilizzante per promuovere un'ulteriore crescita. Mantenere nicotiana bethamiana 16c piante in condizioni normali fino a quando le piante hanno almeno cinque foglie vere completamente sviluppate senza ascellare visibile o boccioli di fiori e le foglie hanno un aspetto verde sano.Usa piante Nicotiana bethamiana 16c di 10-14 giorni per saggi di silenziamento sistemico dell'RNA e foglie da tre a quattro settimane di Nicotiana bethamiana 16c per i test di silenziamento dell'RNA locale. Utilizzare una punta per raccogliere una colonia positiva dalla piastra LB e inoculare le cellule in un tubo di vetro contenente cinque millilitri di mezzo LB integrati con 50 microgrammi per millilitro Kanamicina e 50 microgrammi per millilitro Rifampicin. Far crescere le cellule a 30 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min per 24-48 ore.Trasferire 100 microlitri della coltura in cinque millilitri di mezzo LB integrati con gli stessi antibiotici, MES da 10 millimolare a pH 5,6 e 20 micromolare AS. Far crescere i batteri a 30 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min per 16-20 ore. Centrifugare le cellule a 4.000 volte g per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in due millilitri di tampone di cloruro di magnesio millimolare.Ripetere il lavaggio per garantire la completa rimozione degli antibiotici. Determinare la densità della coltura di Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nanometri. Regolare la coltura cellulare con tampone di cloruro di magnesio millimolare da 10 millimolare a un OD 600 da 1,5 a 2,0.Aggiungere 10 MES millimolare a pH 5.6 e 150 micromolare AS alla coltura finale della sospensione e incubare le cellule a temperatura ambiente per almeno tre ore senza tremare. Mescolare volumi uguali di una coltura di Agrobacterium contenente proteine fluorescenti verdi 35S con una coltura di Agrobacterium contenente soppressore del virus del mosaico di cetrioli 35S 2b, effettore putativo o vettore vuoto. Utilizzando una siringa senza ago millilitro, infiltrarsi con cura e lentamente nelle sospensioni miste di Agrobacterium sui lati abaxiali delle foglie di Nicotiana bethamiana 16c.Rimuovere la sospensione batterica rimanente dalle foglie con salviette dei tessuti molli e cerchiare i margini delle macchie infiltrate con una penna marcatore. Da tre a quattro giorni dopo l'infiltrazione, usa una lampada ultravioletta a onde lunghe per rilevare visivamente la fluorescenza GFP nelle macchie infiltrate di foglie. Due settimane dopo l'infiltrazione, utilizzare la lampada per rilevare le foglie appena coltivate dell'intera pianta per il silenziamento sistemico dell'RNA.Per isolare l'RNA totale dal tessuto fogliare a quattro o sette giorni dopo l'infiltrazione, raccogliere i tessuti fogliari dalle macchie infiltrate di Nicotiana bethamiana 16c in un mortaio. Mettere l'azoto liquido nella malta e macinare il tessuto in una polvere fine con un'asta di macinazione e trasferire la polvere in un tubo sterile a due millilitri. Aggiungere immediatamente il reagente di isolamento dell'RNA al volume di un millilitro per 100 milligrammi di tessuto al tubo campione in una cappa, vortice vigorosamente per omogeneizzare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Aggiungere cloroformio al volume di 200 microlitri per un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA a ciascun tubo della cappa, agitare vigorosamente per 15 secondi e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare l'omogeneato a 12.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo privo di RNasi e scartare il pellet.Aggiungere 0,7 volume di isopropanolo al supernatante, invertire delicatamente più volte e incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti. Precipitare il pellet di RNA per centrifugazione a 12.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante.Lavare il pellet con il 70% di etanolo e asciugare ad aria il pellet in una cappa. Sciogliere l'RNA in acqua trattata con pirocarbonato dietile incubando in un bagno d'acqua di 65 gradi Celsius per 10-20 minuti. Per eseguire l'analisi northern blot dei livelli di RNA messaggero GFP, preparare un gel di agarosio denaturante dell'1,2% in tampone di funzionamento 1X MOPS.Mescolare l'RNA uno a uno con colorante di carico dell'RNA e denaturare l'RNA per incubazione a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Raffreddare immediatamente i campioni denaturati sul ghiaccio per un minuto. Con una pipetta, caricare i campioni nei pozzi del gel e dell'elettroforesco a 100 volt per 50 minuti fino a quando l'RNA non è ben separato.Risciacquare il gel in tampone di citrato di sodio salino 20X per rimuovere la formaldeide. Eseguire il trasferimento capillare durante la notte impostando un tampone di citrato di sodio salino 20X, uno strato di carta assorbente, due strati di carta Whatman bagnata, uno strato di gel, uno strato di membrana di nylon, due strati di carta Whatman bagnata, due strati di carta Whatman asciutta, una lastra di vetro e un peso. Al mattino, l'RNA nel gel viene trasferito alla membrana di nylon.Immergere la membrana in citrato di sodio salino 2X e fissare l'RNA alla membrana esponendo la membrana bagnata al reticolo UV. Procedere secondo il manoscritto. Foglie completamente sviluppate di piante Nicotiana bethamiana 16c di tre o quattro settimane sono state co-infiltrate in cerotti con miscele agrobatteriche che trasportavano 35S GFP.A quattro giorni dalla post-infiltrazione, la fluorescenza GFP dell'area infiltrata è stata immagine sotto la luce naturale e la luce UV a onde lunghe. Northern blot ha rivelato che l'RNA messaggero GFP si è accumulato più in alto nelle foglie esprimendo 35S GFP più 35S CMV2b o 35S GFP più 35S PSR1 che nelle foglie che esprimono 35S GFP più EV. Il saggio di agroinfiltrazione è stato eseguito per valutare la diffusione del segnale silenziante nelle foglie delle piantine Nicotiana bethamiana 16c di due settimane. A 14 giorni dopo l'infiltrazione, più del 98% dell'EV non presentava alcuna segnalazione ovvia della GFP nelle foglie sistemiche.Mentre sia CMV2b che PSR1 inibivano efficacemente la diffusione sistemica del segnale silenziatore. La fluorescenza della GFP è stata osservata in circa l'80% delle piante co-infiltrate e nel restante 20% delle piante infiltrate con solo poche vene rosse è apparso nelle foglie appena emerse. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per identificare nuovi soppressori silenziatori di RNA secreti da molti patogeni vegetali.La combinazione di piante e L'OD corretto è la cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura. Seguendo questa procedura, la caratterizzazione funzionale del soppressore di silenziamento dell'RNA può essere eseguita per esplorare il meccanismo di come questi soppressori prevengono il silenziamento dell'RNA host e qual è l'output. Si prega di indossare gli occhiali di sicurezza quando ci si infiltra nelle piante e si indossano anche i guanti in lattice durante tutte le fasi dell'esperimento.

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Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica...

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

Fonte: Shi, J., et al. Screening e identificazione dei soppressori silenzianti dell'RNA da effettori secreti di patogeni vegetali. J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra un saggio di coinfiltrazione per identificare proteine effettrici patogene che sopprimono il silenziamento dell'RNA in Nicotiana benthamiana 16c. Un reporter fluorescente e un gene candidato effettore vengono introdotti nelle foglie delle piante tramite Agrobacterium. Normalmente, il silenziamento dell'RNA degrada i...

Test di coinfiltrazione per lo screening degli effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale

Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l'uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell'identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.

VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato "ubiquitome" schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

La quantificazione della crescita dei patogeni è un potente strumento per caratterizzare varie risposte immunitarie di Arabidopsis thaliana (di seguito: Arabidopsis). Il metodo qui descritto presenta un saggio di infiltrazione a siringa ottimizzato per quantificare il pv di Pseudomonas syringae. maculicola ES4326 crescita nelle foglie adulte di Arabidopsis.

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Una pipeline bioinformatica, vale a dire miRDeep-P2 (miRDP2 in breve), con criteri di miRNA vegetale aggiornati e un algoritmo revisionato, potrebbe analizzare in modo accurato ed efficiente i trascrittimi di microRNA nelle piante, in particolare per le specie con genomi complessi e di grandi dimensioni.

Una pipeline di bioinformatica per analizzare in modo accurato ed efficiente i trascrittomi di microRNA nelle piante

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Questo metodo dimostra l'uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall'estratto totale di RNA.

RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali

Qui, introduciamo un metodo dettagliato di ammollo dell'interferenza dell'RNA in Bursaphelenchus xylophilus per facilitare lo studio delle funzioni geniche.

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Descriviamo un metodo semplice ma altamente riproducibile per isolare l'RNA extracellulare dalla superficie fogliare e dall'apoplasto delle piante di Arabidopsis.

Una guida passo passo all'isolamento e all'analisi della superficie fogliare e dell'RNA apoplastico utilizzando le rosette di Arabidopsis

Scopri un metodo di screening rapido per identificare i soppressori del silenziamento dell'RNA nei patogeni vegetali usando Nicotiana benthamiana. Questa tecnica migliora l'efficienza e l'accuratezza degli screening.

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