Combinazione di dispositivi fluidici con microscopia e citometria di flusso per studiare il trasporto microbico nei mezzi porosi attraverso le scale spaziali

Studiare il trasporto di batteri nei sistemi porosi è importante per quanto riguarda la contaminazione, la diffusione delle malattie e la bioremediazione. Per questi esperimenti in modelli matematici che operano a singola cellula, sono necessari la popolazione e il livello della comunità microbica. Qui presentiamo strumenti per studiare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici e microscopia, nonché dispositivi più grandi in combinazione con citometria a flusso.

La combinazione di dispositivi microfluidici con microscopia e citometria di flusso offre una gamma di possibilità per studiare fenomeni di trasporto batterico su diverse scale spaziali. Al fine di esplorare completamente questo protocollo, si consiglia di avere precedenti esperienze in microscopia, elaborazione di immagini di base, progettazione di dispositivi microfluidici e citometria del flusso di masterizzazione. Questo video descrive due metodi per studiare il trasporto batterico su diverse scale spaziali.

Il primo metodo, basato su dispositivi microfluidici, si basa sulla microscopia per contare le singole cellule. Questo sistema può essere utilizzato per studiare il trasporto batterico attraverso più scale spaziali dal poro all'intera scala del sistema poroso. Il secondo metodo, utilizzando dispositivi fluidici più grandi accoppiati a un distributore automatizzato e a una citometria di flusso, può essere utilizzato per studiare il fenomeno del trasporto batterico su larga scala di interi sistemi porosi.

Tali metodi possono anche essere utilizzati in studi a colonne su scala di laboratorio, nonché in piccole indagini sul campo. Per iniziare, progettare la geometria porosa desiderata che consiste in una matrice di cerchi. In base alla geometria scelta, preparare uno stampo utilizzando la fotolitografia SU-8 standard.

Preparare 50 grammi di PDMS aggiungendo il 90% di elastomero al 10% dell'agente polimerizzante al 90% di elastomero in peso in un contenitore monouso pulito e mescolare i due reagenti con uno strumento pulito. Applicare un vuoto di 100 millibar per 30 minuti per rimuovere l'aria disciolta e le bolle. Posizionare lo stampo in una piastra di Petri e versare il PDMS sullo stampo all'altezza desiderata tra i due e i cinque millimetri.

Coprire la piastra di Petri con un coperchio e tenerla a 60 gradi Celsius per almeno quattro ore. Successivamente, lasciare raffreddare il dispositivo microfluidico a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, rimuovere con cura la porzione desiderata di PDMS con un bisturi.

Sigillare temporaneamente la parte inferiore del canale PDMS con nastro adesivo. Con un punzonatore da 0,5 millimetri di diametro, perforare i canali per creare un'ingresso e una presa. Rimuovere il nastro dal canale PDMS e posizionare il canale con il lato poroso rivolto verso l'alto.

Trattare lo scivolo di vetro e le superfici PDMS con plasma per circa 45 secondi ciascuno a temperatura ambiente. Posizionare il canale PDMS pretrattato sullo scivolo di vetro pretrattato e riscaldare a 100 gradi Celsius per 30 minuti su una piastra calda, quindi rimuovere il dispositivo microfluidico dalla piastra calda e raffreddarlo a temperatura ambiente. Applicare il vuoto per 30 minuti per rimuovere l'aria dal PDMS.

Per produrre la base contenente il vano poro, utilizzare la micro fresatura ad alta precisione per rimuovere 0,5 millimetri dallo strato PMMA di base e fresare una scanalatura delle dimensioni di 1,1 per 1,1 millimetri per un O-ring in gomma. Praticare due fori filettati per un ingresso e una presa nella parte superiore del dispositivo fluido e 12 fori per le viti. Questo funge da coperchio del dispositivo fluido.

Dopo aver pulito il dispositivo fluido, avvitare la base e il coperchio insieme utilizzando i 12 fori filettati. Rimuovere il microfluidico dal vuoto e posizionarlo sullo stadio del microscopio. Utilizzare la pompa della siringa per saturarla con un tampone di motilità.

Utilizzando la microscopia Brightfield o il contrasto di fase, regola l'ingrandimento per visualizzare le singole cellule batteriche e concentrati sul centro del canale di osservazione. Passare le impostazioni del percorso della luce alla microscopia a fluorescenza. Regolare la messa a fuoco attraverso un offset e il tempo di esposizione della fotocamera per risolvere singole cellule batteriche.

In questo caso, 100 millisecondi. Quindi, inserire il tubo di ingresso in un tubo a due millilitri contenente la sospensione batterica. Invertire la direzione della pompa e iniziare a ritirare la sospensione a una portata di un microlitro al minuto.

Scansiona la sezione trasversale dell'intero canale di osservazione, registrando un'immagine ogni minuto. Importare immagini in una piattaforma software desiderata. Registrare lo sfondo come media delle prime immagini quando non sono state registrate particelle.

Sottrarre lo sfondo da ogni immagine per rimuovere il rumore della fotocamera e l'aberrazione ottica. Ritagliare le immagini in un'area di interesse. Identificare un valore di soglia uguale all'intensità del pixel di fluorescenza cellulare in modo che i valori superiori alla soglia includano cellule batteriche.

Usa l'elaborazione delle immagini per sottrarre il valore di soglia da ogni immagine. Binarizzare l'immagine risultante in modo che le cellule batteriche prendano un valore pari a uno, mentre lo sfondo assume un valore pari a zero. Rimuovere i cluster di pixel con un'area più piccola della dimensione minima delle celle batteriche in pixel.

Sommare l'immagine binarizzata per ottenere il numero totale di pixel dei cluster rimanenti. Dividere il numero di pixel per la dimensione media di una cella batterica in pixel per ottenere una stima del numero di celle. Trasforma i conteggi in concentrazione in particelle per millilitro.

Per identificare la concentrazione della sospensione batterica iniettata, iniettare la sospensione batterica nel canale di osservazione di un dispositivo microfluidico pulito con una siringa. Registrare l'immagine e calcolare la concentrazione batterica influente come mostrato in precedenza. Visualizzare le curve di svolta normalizzando la concentrazione batterica degli effluenti C con la concentrazione batterica influente C0 e tracciando C su C0 rispetto al tempo.

Al fine di analizzare le velocità e le traiettorie locali dei batteri trasportati attraverso la matrice porosa, spostare lo stadio del microscopio in una regione di interesse e regolare la messa a fuoco al centro del dispositivo microfluidico. Impostare la configurazione ottica sulla microscopia a contrasto di fase o a fluorescenza. Registra immagini time-lapse e un tempo di esposizione abbastanza breve da catturare lo spostamento batterico.

In questo caso, 50 millisecondi. Registrare le immagini in un lasso di tempo sufficiente, ad esempio tre minuti. Per rimuovere il rumore da ogni immagine, sottrarre lo sfondo, che è la media della somma di tutte le immagini registrate.

Determinare il modulo del gradiente numerico e normalizzarlo in base al valore massimo. Trovare e registrare coordinate batteriche e il tempo di acquisizione dell'immagine in un file a tre colonne. Eseguire l'analisi del tracciamento delle particelle per elaborare i dati registrati e calcolare le traiettorie.

Per ottenere profili di deposizione, registrare un'immagine composita dell'intero canale poroso prima, cioè lo sfondo, e dopo l'iniezione della sospensione batterica attraverso il dispositivo microfluidico. Rimuovere lo sfondo dalle immagini registrate dopo l'iniezione batterica. Calcola il profilo di deposizione D come la somma del segnale di fluorescenza batterica lungo sezioni trasversali di lunghezza x del canale poroso.

Visualizzare il profilo di deposizione come segnale di fluorescenza locale rispetto alla lunghezza del canale poroso. Per impostare il distributore automatico, posizionare il distributore robotico vicino al dispositivo fluido. Collegare il distributore robotico al computer che esegue BCNC e identificare la porta com corretta.

In BCNC, fare clic sul pulsante Home per riportare il distributore robotico nella posizione di casa. Collegare la pompa peristaltica con l'ingresso utilizzando tubi di diametro interno lunghi 50 centimetri, diametro interno di un millimetro e il deflusso con il distributore automatico utilizzando lo stesso tubo. Pompare il mezzo di coltivazione attraverso il dispositivo fluido.

Si noti l'arrivo del mezzo al tubo di uscita fissato al distributore robotico e posizionare una piastra da 96 potte che raccoglierà il deflusso. Allo stesso tempo, attivare il distributore robotico e iniettare la sospensione batterica attraverso il dispositivo fluido PMMA a una portata di 0,2 millilitri al minuto. Iniettare sospensioni batteriche equivalenti a diversi volumi di pori.

Ad esempio, 30 volte il volume del dispositivo fluido. Dopo l'iniezione, passare al mezzo di coltivazione sterile fino alla fine dell'esperimento. Una volta completata una piastra da 96 pozzetti, coprire la piastra e conservare a quattro gradi Celsius fino all'analisi della citometria del flusso.

Analizzare i campioni con citometria del flusso e visualizzare le curve di svolta normalizzando la concentrazione batterica degli effluenti C con la concentrazione batterica influente C0 e tracciando C su C0 rispetto al tempo. In questo studio, utilizzando pseudomonas putida KT2440 sia mobili che non mobili, sono stati eseguiti esperimenti sequenziali in dispositivi microfluidici PDMS con una serie casuale di pilastri. Qui vengono mostrate curve rivoluzionarie normalizzate alla concentrazione di cellule iniettate, così come traiettorie batteriche sulla scala dei pori.

Sono stati eseguiti anche esperimenti con dispositivi fluidici su larga scala fresati dal PMMA. Pseudomonas putida KT2440, motile e non mobile, sono stati iniettati in una matrice porosa regolarmente distanziata. Sorprendentemente, in un ambiente poroso privo di biofilm, Pseudomonas putida KT2440, mobile e non mobile, ha mostrato un comportamento di trasporto marcatamente diverso basato su curve rivoluzionarie.

In una matrice porosa colonizzata per 48 ore con una complessa comunità di biofilm a flusso, queste differenze nelle curve rivoluzionarie tra pseudomonas putida KT2440 eterogenee e non motili sono scomparse. Utilizziamo questo sistema per studiare il trasporto batterico nei corsi d'acqua, ma questi strumenti possono essere facilmente adattati per studiare i fenomeni di trasporto batterico in altri sistemi ingegnerizzati e ambientali. Il trasporto batterico attraverso mezzi porosi idratati incapsula i processi su più scale spaziali.

La metodologia qui presentata consente di collegare lo spostamento locale dei batteri sulla scala dei pori al trasporto microscopico su tutto il mezzo poroso.