Name: Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Scopri un protocollo di imaging 3D a risoluzione di singola cellula per organoidi intatti. Questo metto rapido di tre giorni utilizza clearing ottico e microscopia confocale per mappare la struttura cellulare complessa.

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Siamo molto grati per il supporto tecnico del Centro di Oncologia Pediatrica Princess M'xima e dell'Istituto Hubrecht e di zeiss per il supporto e le collaborazioni di imaging. Tutte le immagini sono state eseguite presso il centro di imaging Princess M'xima. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Centro di Oncologia Pediatrica Princess M'xima. JFD è stata sostenuta da una borsa di studio Marie Curie Global e da una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO). L'ACR è stata sostenuta da una sovvenzione iniziale del Consiglio europeo (CER).

L'uso di organoidi derivati dai topi è conforme agli standard normativi ed è stato approvato dal Walter and Eliza Hall Institute (WEHI) Animal Ethics Committee. Tutti i campioni di organoidi umani sono stati recuperati dalle biobanche attraverso la tecnologia organoide Hubrecht (HUB, www.hub4organoids.nl). Le autorizzazioni sono state ottenute dal Comitato etico medico di UMC Utrecht (METC UMCU) su richiesta dell'HUB al fine di garantire il rispetto della legge olandese sulla ricerca medica che coinvolge i soggetti umani e il consenso informato è stato ottenuto dai donatori quando appropriato.
1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Per preparare la paraformaldeide (PFA) del 4% (w/v), riscaldare 400 mL di salina tamponata di fosfato (PBS) a poco meno di 60 gradi centigradi in un bagno d'acqua. Aggiungere 20 g di polvere di PFA e sciogliere con un agitatore.<ol>
<li>Successivamente, aggiungere alcune gocce di 10 M NaOH. Lasciar raffreddare sul ghiaccio e aggiungere qualche goccia di 10 M HCl per regolare il pH a 7.4. Con il PBS a 500 mL e l'aliquot (negozio a -20 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi). NOTA: Non riscaldare al di sopra dei 60 gradi centigradi per evitare la degradazione del PFA. Tempo di preparazione : 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare pbS con Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), aggiungere 1 mL di Tween-20 a 1 L di PBS (negozio a 4 gradi centigradi per un massimo di 4 settimane). NOTA: Tempo di preparazione : 10 min.</li>
	<li>Per preparare 100 mL di acido etilenediatetraacetico (EDTA) 0,5 ML, aggiungere 18,6 g di EDTA e 2,5 g di NaOH a 80 mL di dH2O. Regolare il pH a 8 con 1 M NaOH e riempire a 100 mL con dH2O.</li>
	<li>Per preparare 500 mL di 1 M Tris, sciogliere 60,55 g di Tris con 42 mL di concentrato (36-38%) HCl in 300 mL di dH2O. Regolare il pH a 8 e riempire a 500 mL.</li>
	<li>Per preparare il buffer di lavaggio organoide (OWB), aggiungere 1 mL di Triton X-100, 2 mL del 10% (w/v) SDS e 2 g di albumina di siero bovino (BSA) a 1 L di PBS (negozio a 4 gradi centigradi fino a 2 settimane). NOTA: Tempo di preparazione : 10 min.</li>
	<li>Per realizzare 220 mL di FUnGI, mescolare 110 mL di glicerolo con 20 mL di dH2O, 2,2 mL di buffer Tris (1 M, pH 8.0) e 440 lL di EDTA (0,5 M). Aggiungere 50 g di fruttosio e mescolare a temperatura ambiente (RT) al buio fino a dissoluzione. Quando è chiaro, aggiungere 49 g di fruttosio e mescolare fino a dissoluzione. Quindi aggiungere 33,1 g di urea e mescolare fino a dissoluzione (conservare a 4 gradi centigradi al buio). NOTA: Non riscaldare come fruttosio caramella a temperature più elevate. FUnGI è costituito da 50% (v/v) glicerolo, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM tris base, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fruttosio e 2,5 M urea. Tempo di preparazione : 1 giorno.</li>
	<li>Per preparare il PBS-BSA (1% w/v), sciogliere 1 g di BSA in 100 mL di PBS (conservare a 4 gradi centigradi fino a 2 settimane). NOTA: Tempo di preparazione : 10 min.</li>
</ol>2. Recupero organoide
NOTA: I seguenti passaggi si applicano agli organoidi coltivati in estratto di membrana seminterrato (BME) che sono stati coltivati in una piastra di 24 pongimi con una dimensione di 100-500 m .
<ol><li>Aspirare il mezzo di coltura e lavare 1x con PBS ghiacciato. Evitare di interrompere la matrice 3D.</li>
	<li>Mettere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 1 mL di soluzione di recupero celle ghiacciate (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo. Incubate 30-60 min a 4 gradi centigradi su uno shaker orizzontale (40 rpm). NOTA: le goccioline a matrice 3D devono essere completamente dissolte.</li>
	<li>Rivestire una punta di pipetta da 1 mL con BSA immergendo l'1% PBS-BSA e pipettando su e giù 2x. Questo rivestimento impedirà agli organoidi di attaccarsi alla punta. Per rivestire il lato interno di un tubo conico da 15 mL, riempire con 5 mL dell'1% PBS-BSA, invertire 2x e scartare il PBS-BSA. NOTA: Questo rivestimento è necessario per tutti i materiali di consumo in plastica fino alla fissazione (punto 3.3).</li>
	<li>Utilizzando una punta rivestita, risuondere delicatamente il contenuto del pozzo 5x e trasferire gli organoidi su tubi rivestiti da 15 mL. Gli organoidi di pozzi diversi con la stessa identità possono essere uniti nello stesso tubo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di ghiaccio-freddo 1% PBS-BSA per ogni coltura bene per risciacquare e raccogliere tutti gli organoidi.</li>
	<li>Aggiungere PBS freddo a 10 mL e girare verso il basso per 3 min a 70 x g e 4 gradi centigradi per ottenere un pellet stretto senza uno strato visibile di matrice 3D. Rimuovere con attenzione il supernatant.</li>
</ol>3. Fissaggio e blocco
<ol><li>Rispendere con cura gli organoidi in 1 mL di PFA ghiacciato utilizzando una punta rivestita di 1 mL.</li>
	<li>Fissare a 4 gradi centigradi per 45 minuti. Rispendere delicatamente gli organoidi a metà del tempo di fissazione utilizzando una punta rivestita di 1 mL per garantire una fissazione uniforme tra tutti gli organoidi.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di PBT ghiacciato al tubo, mescolare delicatamente invertendo il tubo, incubare per 10 min e girare verso il basso a 70 x g, entrambi a 4 gradi centigradi. NOTA: Da questo passaggio in poi il rivestimento delle punte non è generalmente necessario in quanto la maggior parte dei tipi di organoidi non si attaccano alla punta dopo la fissazione. Tuttavia, alcuni organoidi possono richiedere plastica rivestita anche dopo la fissazione.</li>
	<li>Bloccare gli organoidi riempendo il pellet in OWB ghiacciato (almeno 200 L di OWB per pozzo) e trasferire gli organoidi su una piastra di sospensione a 24 gradi. NOTA: Gli organoidi di un grande pellet possono essere suddivisi su più pozzetti per eseguire diverse colorazione.</li>
	<li>Incubare a 4 gradi centigradi per almeno 15 minuti.</li>
</ol>4. Immunolabeling
<ol><li>Pipette 200 L di OWB in un pozzo vuoto per servire bene come riferimento. NOTA: L'immunoetichetta può essere eseguita anche in piastre da 48 o 96 pozzetti per ridurre l'uso degli anticorpi. Tuttavia, l'utente deve essere consapevole che sia la colorazione e le prestazioni di lavaggio potrebbero essere ridotte a causa del volume più piccolo.</li>
	<li>Lasciare che gli organoidi si stabiliscano nella parte inferiore della piastra. NOTA: Questo può essere controllato utilizzando uno stereomicroscopio ed è reso più facile utilizzando uno sfondo scuro.</li>
	<li>Inclinare la piastra di 45 gradi e rimuovere l'OWB lasciando gli organoidi in 200 L di OWB (utilizzare bene il riferimento per stimare 200 L).</li>
	<li>Aggiungere 200 L di OWB con anticorpi primari 2x concentrati (ad esempio, E-cadherin [1:400] e Ki67 [1:200] per i risultati nella Figura 1; cheratina 5 [1:500], cheratina 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], e Ki67 [1:200] per i risultati in Figura 2) e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi, mentre leggermente a dondolo / agitazione (40 rpm su shaker orizzontale).</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere 1 mL di OWB.</li>
	<li>Lasciare che gli organoidi si stabiliscano sul fondo della piastra per 3 minuti. Rimuovere l'OWB lasciando 200 L nella piastra. Aggiungere 1 mL di OWB e lavare 2 h con lieve dondolo / agitazione.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.6 altre due volte.</li>
	<li>Lasciare che gli organoidi si stabiliscano sul fondo della piastra per 3 minuti. Rimuovere l'OWB lasciando 200 L nel pozzo.</li>
	<li>Aggiungere 200 L di OWB con anticorpi secondari, anticorpi coniugati e coloranti 2x concentrati (ad esempio, DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] per i risultati nella figura 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], coniglio-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] per i risultati nella Figura 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] per i risultati nella Figura 3) e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi mentre leggermente a dondolo / agitazione.</li>
	<li>Il giorno successivo, ripetere i passaggi 4.5-4.7.</li>
	<li>Trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 mL e girare verso il basso a 70 x g per 3 min.</li>
</ol>5. Sgombero ottico degli organoidi
<ol><li>Rimuovere il più possibile l'OWB pipettando senza interrompere gli organoidi.</li>
	<li>Aggiungere FUnGI (almeno 50 L, RT) utilizzando una punta da 200 L con l'estremità tagliata e riesferare delicatamente per prevenire la formazione di bolle. Incubare a RT per 20 min. NOTA: la compensazione ottica di FUnGI può causare un minore restringimento del tessuto. Questo non influenzerà la morfologia generale degli organoidi monostrati e multistrato; tuttavia, gli organoidi monostrati a forma sferica con grandi lumen possono collassare. Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi (per almeno 1 settimana) o a -20 gradi centigradi (per almeno 6 mesi).</li>
</ol>6. Preparazione dello scivolo per l'imaging confocale
<ol><li>Preparare una siringa da 10 mL con un sigillante in silicone(Tabella dei Materiali). Fissare una punta da 200 L e tagliare l'estremità per consentire un leggero flusso del silicone viscoso dopo aver premuto la siringa. Utilizzare la siringa per disegnare un rettangolo di 1 cm x 2 cm al centro di una diapositiva.</li>
	<li>Tagliare l'estremità di una punta da 200 L e trasferire gli organoidi in FUnGI al centro del rettangolo.</li>
	<li>Posizionare un coperture sulla parte superiore. Per ridurre al minimo le bolle d'aria intrappolate, posizionare prima il lato sinistro del cosopermento, quindi abbassare lentamente il costolo da sinistra a destra fino a quando non c'è aria intrappolata e quindi rilasciare il cosopermento. NOTA: i distanziatori di dimensioni simili agli organoidi possono essere utilizzati per evitare che vengano danneggiati.</li>
	<li>Applicare delicatamente la pressione su tutti i bordi del cosepevolmento per attaccarlo saldamente al sigillante in silicone. La diapositiva è ora pronta per l'imaging. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e il campione può essere conservato a 4 gradi centigradi (per almeno 1 settimana) o a -20 gradi centigradi (per almeno 6 mesi).</li>
</ol>7. Acquisizione ed elaborazione delle immagini
<ol><li>Utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (Tabella dei Materiali), immagini lo scivolo con un'immersione multi-immersione 25x o un'immersione ad olio 40x obiettivo per l'imaging confocale.<ol>
<li>Utilizzare le seguenti impostazioni di acquisizione per l'obiettivo 25x: frame della modalità di scansione, dimensione fotogramma 1024 x 1024, dimensione voxel 332 nm x 332 nm x 1,2 m, pixel dwell time <2 s, scansione bidirezionale, numero medio 1, profondità di bit 8. Per ridurre la fotobleaching, utilizzare una bassa potenza laser (<5% in generale, <10% per la colorazione debole).</li>
		<li>Utilizzare la modalità stack z per definire i limiti inferiore e superiore e impostare la dimensione del passo z su ottimale. Quando si imaging grandi strutture organoidi o più organoidi insieme, utilizzare la modalità di affiancamento con 10% sovrapposizione e indicare l'area di interesse. NOTA: con queste impostazioni, la dimensione dei dati per un organoide tipico con un diametro di <300 m è <1 GB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i set di dati di scansione dei riquadri, unire i file di imaging nel software accompagnati dal microscopio (Tabella dei materiali). Nella sezione di lavorazione, selezionare Cucitura come metodo, scegliere Nuovo output in Parametri e selezionare il file da unire. Premere Applica per avviare la cucitura.</li>
	<li>Ottenere una rappresentazione 3D dell'immagine nella scheda Vista 3D del software di imaging (Tabella dei materiali) e successivamente ottimizzare le proprietà di luminosità, contrasto e rendering 3D. Esportare le istantanee RGB dei risultati come file TIFF.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo presentato un protocollo dettagliato per l'imaging 3D di organoidi intatti con risoluzione a una singola cellula. Per eseguire correttamente questo protocollo, è necessario eseguire alcuni passaggi critici. In questa sezione vengono evidenziati questi passaggi e viene fornito la risoluzione dei problemi.
Il primo passo critico è la rimozione della matrice 3D. La maggior parte degli organoidi vengono propagati in vitro con l'uso di matrici che imitano l'ambiente extracellulare in vivo per migliorare la formazione di strutture 3D ben polarizzate. La fissazione e la successiva colorazione all'interno della matrice 3D è possibile, ma può essere svantaggiosa per la penetrazione di anticorpi o può generare un segnale di fondo elevato (dati non mostrati). La rimozione efficiente delle matrici può essere influenzata dal tipo di matrice, dalla quantità e dalle dimensioni degli organoidi e dalla tatura prolungata. Pertanto, l'ottimizzazione può essere necessaria per diverse condizioni di coltura. Per gli organoidi colturati in Matrigel o BME, un passo di 30/60 min nella soluzione di recupero delle cellule ghiacciate è sufficiente a sciogliere la matrice senza danneggiare gli organoidi. Inoltre, la rimozione della matrice 3D di supporto potrebbe comportare la perdita di strutture native e l'interruzione dei contatti organoidi con altri tipi di cellule, ad esempio quando gli organoidi sono co-culturati con fibroblasti o cellule immunitarie. Inoltre, la fissazione ottimale dell'organoide è fondamentale per preservare l'architettura dei tessuti 3D, l'antigenicità proteica e ridurre al minimo l'autofluorescenza. Fissaggio per 45 min con 4% PFA a 4 gradi centigradi è normalmente sufficiente per l'etichettatura di una vasta gamma di organoidi e antigeni. Tuttavia, un passo di fissazione più lungo, fino a 4 h, è in genere più appropriato per gli organoidi che esprimono proteine fluorescenti reporter, ma richiederà l'ottimizzazione per diversi fluorofori. I tempi di fissazione inferiori a 20 min sono insufficienti per etichettare correttamente L'actina utilizzando sonde phalloidin. Un altro problema comune è la perdita di organoidi durante il protocollo. È quindi importante (i) rivestire con cura le punte e i tubi delle tubazioni con l'1% di BSA-PBS come descritto durante la manipolazione di organoidi non fissi per evitare che si attacchino alla plastica, (ii) utilizzare piastre a bassa aderenza o sospensione per evitare che il campione si attacchi alla piastra e (iii) lasciare abbastanza tempo per gli organoidi di depositarsi nella parte inferiore della piastra prima di rimuovere attentamente i tamponi. Pipettatura viscosa FUnGI può introdurre bolle. La gestione del campione eliminato a RT riduce la viscosità e migliora la facilità d'uso, riducendo così al minimo la perdita di organoidi. Mentre la maggior parte degli organoidi sono facili da maneggiare, gli organoidi cistici con un lume allargato hanno un'alta tendenza a collassare quando si fissa con il 4% di PFA o quando vengono eliminati con FUnGI. Questo effetto può essere ridotto, ma non completamente impedito, utilizzando un diverso fissativo (ad esempio, formalina o PFA-glutaraldeide). Tuttavia, ciò potrebbe potenzialmente avere un impatto sull'autofluorescenza, sulla penetrazione degli anticorpi e sulla disponibilità di epitopi. Quando gli organoidi cistici appaiono piegati dopo la pulizia, si consiglia di saltare la fase di compensazione e l'immagine con la microscopia multi-fotone, che è meno ostacolata dalla dispersione della luce. Infine, ottenere l'intera struttura 3D degli organoidi può essere impegnativo e richiede una distanza minima tra coverslip e organoide. Inoltre, quando gli organoidi hanno spazio per muoversi nel loro agente di montaggio, questo può causare spostamenti X e Y durante la registrazione dei dati in profondità z. L'uso di un sigillante in silicone inferiore durante la preparazione del foglio può risolvere il montaggio non ottimale tra coverslip e scivolo al microscopio. Tuttavia, troppo poco silicone può portare alla compressione organoide e la perdita della loro struttura 3D intrinseca. FUnGI migliora la maneggevolezza per il montaggio dello scivolo e la stabilità degli organoidi durante l'imaging, grazie alla sua maggiore viscosità.
Anche se questo protocollo può essere utilizzato per un'ampia gamma di applicazioni per studiare in profondità il contenuto cellulare e l'architettura 3D di organoidi intatti, alcune limitazioni dovrebbero essere considerate. Questa metodologia è piuttosto bassa e richiede molto tempo. Infatti, gli utenti dovrebbero tenere a mente che l'imaging di grandi organoidi intatti in 3D richiede sia l'affiancamento che l'acquisizione di campioni in , portando a tempi di acquisizione prolungati. È possibile ottenere immagini più veloci utilizzando risorse al microscopio, tra cui scanner del disco risonante o rotante, o tramite la tecnologia del microscopioa foglio di luce 26. Un'altra considerazione è che i marcatori possono essere espressi eterogeneamente tra diversi organoidi dello stesso campione. Pertanto, più organoidi dovrebbero essere acquisiti per catturare meglio questa eterogeneità organoide nella cultura. Infine, mentre la procedura di laboratorio umide completa è semplice, la post-elaborazione dei dati richiede competenze nel software di analisi delle immagini per la visualizzazione e la quantificazione 3D, nonché statistiche per il mining di tutte le informazioni presenti nel set di dati.
Nell'ultimo decennio, il campo dell'imaging di volume è notevolmente avanzato, sia grazie allo sviluppo di una vasta gamma di agenti di compensazione ottica sia ai miglioramenti nella microscopia e nelle tecnologiecomputazionali 27,,30,31. Mentre in passato la maggior parte degli studi si è concentrata sull'imaging di grandi volumi di organi o tumori associati, più recentemente sono stati sviluppati metodi per tessuti più piccoli e più fragili, comprese le strutture organoidi,36,37,38. Recentemente abbiamo pubblicato un metodo semplice e veloce per l'imaging di organoidi interi di varie origine, dimensioni e forma a livello di singola cella per il successivo rendering 3D e l'analisidelle immagini 26, che abbiamo presentato qui con alcuni miglioramenti (ad esempio, FUnGI, montaggio in silicone) e accompagnati da un protocollo video. Questo metodo è superiore all'imaging convenzionale basato su sezione 2D nella decifrazione della morfologia cellulare complessa e dell'architettura dei tessuti (Figura 2) e facile da implementare nei laboratori con un microscopio confocale. Con lievi adattamenti al protocollo, i campioni possono essere resi compatibili con, confocale super-risoluzione, multi-fotone e imaging foglio di luce, che rende questo protocollo ampiamente applicabile e fornisce agli utenti un potente strumento per comprendere meglio la complessità multidimensionale che può essere modellata con organoidi.

Il progresso di nuovi metodi di coltura, come la tecnologia organoide, ha permesso la coltura degli organi in un piatto1. Gli organoidi crescono in strutture tridimensionali (3D) che ricopriono il loro tessuto di origine mentre conservano tratti fenotipici e funzionali. Gli organoidi sono ora strumentali per affrontare le questioni biologichefondamentali 2, modellare le malattie tra cuiil cancro 3e sviluppare strategie di trattamentopersonalizzate 4,5,6,7. Dal momento che il primo protocollo per la generazione di organoidi derivati da cellule staminali adulte intestinali8, la tecnologia organoide si è estesa per includere una vasta gamma di tessuti sani e cancerosi derivati da organi tra cui prostata9, cervello10, fegato11,12, stomaco13, seno14,15, endometrio16, ghiandola salivare17, papino del gusto 18 ,19, e renale20.19
Lo sviluppo degli organoidi è concordato con l'aumento di nuove tecniche di microscopia volumetrica in grado di visualizzare l'architettura dell'intero tessuto di montaggio in 3D21,,22,23,24. L'imaging 3D è superiore all'imaging tradizionale della sezione dei tessuti 2D nella visualizzazione della complessa organizzazione di campioni biologici. Le informazioni 3D si rivelano essenziali per comprendere la composizione cellulare, la forma delle cellule, le decisioni sul destino delle cellule e le interazioni cellulare-cellula di campioni biologici intatti. Le tecniche di sessazione ottica non distruttiva, come la microscopia a scansione laser confocale o multi-fotone (CLSM e MLSM) e la microscopia a fluorescenza dei fogli di luce (LSFM), ora consentono la visualizzazione combinata di dettagli fini, nonché l'architettura generale dei tessuti, all'interno di un singolo esemplare biologico. Questo potente approccio di imaging offre l'opportunità di studiare la complessità strutturale che può essere modellata con organoidi25 e mappare la distribuzione spaziale, l'identità fenotipica e lo stato cellulare di tutte le singole cellule che compongono queste strutture 3D.
Recentemente abbiamo pubblicato un protocollo dettagliato per l'imaging 3D ad alta risoluzione di organoidi fissi e cancellati26. Questo protocollo è specificamente progettato e ottimizzato per l'elaborazione di strutture organoide delicate, a differenza delle metodologie per grandi tessuti intatti come DISCO27,28, CUBIC29,30,31e CLARITY32,33. Come tale, questo metodo è generalmente applicabile a una vasta gamma di organoidi diversi per origine, dimensione e forma e contenuto cellulare. Inoltre, rispetto ad altri protocolli di imaging volumetrico che spesso richiedono molto tempo e fatica, il nostro protocollo è poco presente e può essere completato entro 3 giorni. Abbiamo applicato il nostro protocollo di imaging 3D per visualizzare l'architettura e la composizione cellulare dei sistemi organoidi di recente sviluppo derivati da vari tessuti, tra cui le vieaeree umane 34, rene20,fegato 11e organoidi del cancro al senoumano 15. In combinazione con il tracciamento del lignaggio fluorescente multicolore, questo metodo è stato utilizzato anche per rivelare la biopotenza delle cellule basali negli organoidi mammari del topo14.
Qui, affiniamo il protocollo introducendo l'agente di compensazione non-xic FUnGI35. La compensazione FUnGI si ottiene in un'unica fase di incubazione, è più facile da montare a causa della sua viscosità e conserva meglio la fluorescenza durante lo stoccaggio. Inoltre, introduciamo il sodio solfato di dodecile (SDS) nel buffer di lavaggio per migliorare le colorazione nucleare e un metodo di montaggio basato sul silicone per una facile preparazione del vetrato prima della microscopia. Nella Figura 1 vengono forniti una panoramica grafica del protocollo (Figura 1A) e esempi di organoidi con immagini 3D (Figura 1B-D). In breve, gli organoidi vengono recuperati dalla loro matrice 3D, fissa e immunoelicata, otticamente cancellata, immagine con microscopia confocale e quindi renderizzate in 3D con software di visualizzazione.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 2 ml Eppendorf</td><td></td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero cellulare</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Software per microscopio confocale ZEN</td><td>Zeiss</td><td>ZEN nero/blu</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass #1.5 24x60mm</td><td>Menzel-Glazer</td><td>G418-15</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass #1.5 48x60mm</td><td>ProSciTech</td><td>G425-4860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td>diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Dissezione Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo 12,7 mm 6,35 m</td><td>Scotch 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Focus Clear</td><td>CelExplorer</td><td>FC-101</td><td></td></tr><tr><td>Fruttosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Boom</td><td>76050771.0500</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento graduato</td><td>Samco</td><td>222-15</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orizzontale</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>Ajax Firechem.</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10M soluzione madre, corrosivo</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio Superfrost</td><td>ThermoFisher</td><td>10143352</td><td>bordo rettificato, 90 gradi 26 mm~76 mm</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina pericolosa Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td>diluizione 1:100-200</td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>ThermoFisher</td><td>13-1900</td><td>diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>BD Biosciences Diluizione</td><td>B56</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Cheratina 5</td><td>BioLegend</td><td></td><td>905501 diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Cheratina 8/18</td><td>DSHB (Università dell'Iowa)</td><td></td> <td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>MRP2</td><td>Abcam</td><td>ab3373</td><td>diluizione 1:50</td></tr><tr><td>IgG di ratto secondaria (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21208</td><td>diluizione 1:500</td></tr><tr><td>IgG secondarie di topo (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>Diluizione di ThermoFisher</td><td>A-31570</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG secondarie di coniglio (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31572</td><td>diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Sigillante siliconico</td><td>Griffon</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil solfato</td><td>ThermoFisher</td><td>28312</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio (NaOH) Merck</td><td>Millipore</td><td>567530</td><td>10 M soluzione madre, corrosiva</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari in sospensione</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 pozzetti</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>11486631</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Basso Punto di Fusione (LMP) Agarosio</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Workstation</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

La tecnologia organoide, la tativa 3D in vitro del tessuto in miniatura, ha aperto una nuova finestra sperimentale per i processi cellulari che governano lo sviluppo e la funzione degli organi e lamalattia. La microscopia a fluorescenza ha svolto un ruolo importante nel caratterizzare la loro composizione cellulare in dettaglio e dimostrare la loro somiglianza con il tessuto da cui provengono. In questo articolo, presentiamo un protocollo completo per l'imaging 3D ad alta risoluzione di interi organoidi su etichettatura immunofluorescente. Questo metodo è ampiamente applicabile per l'imaging di organoidi diversi per origine, dimensione e forma. Finora abbiamo applicato il metodo agli organoidi delle vie aeree, del colon, dei reni e del fegato derivati dal tessuto umano sano, così come agli organoidi del tumore al seno umano e agli organoidi della ghiandola mammaria del topo. Usiamo un agente di compensazione ottica, FUnGI, che consente l'acquisizione di interi organoidi 3D con la possibilità di quantificazione di marcatori a singola cellula. Questo protocollo di tre giorni dalla raccolta degli organoidi all'analisi delle immagini è ottimizzato per l'imaging 3D utilizzando la microscopia confocale.

L'imaging degli organoidi in 3D consente la visualizzazione dell'architettura, della composizione cellulare e dei processi intracellulari in grande dettaglio. La tecnica presentata è poco osificante e può presumibilmente essere applicata a una vasta gamma di sistemi organoidi derivati da vari organi o specie ospitanti.
La forza dell'imaging 3D rispetto all'imaging 2D è illustrata da immagini di organoidi della ghiandola mammaria del topo che sono stati generati utilizzando i metodipubblicati di recente 14. Lo strato centrale di questi organoidi è costituito da cellule luminali A forma di colonna K8/K18 e lo strato esterno contiene cellule basali G5-postive allungate (Figura 2A), che ricapitola la morfologia della ghiandola mammaria in vivo. Questa organizzazione polarizzata è difficile da apprezzare da una sezione ottica 2D dello stesso organoide (Figura 2B, pannello centrale). Un altro esempio di struttura complessa che è impossibile da interpretare senza informazioni 3D è la rete di canaliculi MRP2-positivi che facilitano la raccolta del liquido biliare degli organoidi del fegato umano11 (Figura 2B). Questo esemplifica come il nostro metodo consente la visualizzazione delle caratteristiche strutturali essenziali degli organoidi. Inoltre, la qualità e la risoluzione ottenute consentono la segmentazione semiautomatica e l'analisi delle immagini. Pertanto, i numeri di cellulare totali e la presenza di marcatori possono essere quantificati in specifici sottotipi cellulari in organoidi interi. Lo illustriamo segmentando i nuclei di un intero organoide contenente 140 cellule, di cui 3 celle mostrano un'elevata positività per il marcatore del ciclo cellulare Ki67 (Figura 2C). Il canale DAPI viene selezionato come canale sorgente e i segmenti vengono generati in base a un passo di soglia dell'intensità e a un diametro della sfera di 10 m. Gli oggetti toccanti vengono divisi per regione che crescono dai punti di inizializzazione. Infine, viene applicato un filtro di dimensioni di 10 voxel per rimuovere piccoli segmenti indotti dal rumore. Per ogni segmento che rappresenta un nucleo, l'intensità media del canale Ki67 viene quindi esportata per la stampa.
Recentemente abbiamo sviluppato l'agente di compensazione ottica FUnGI35, che ora abbiamo integrato in questo protocollo per affinare la trasparenza degli organoidi. FUnGI è facile da usare, in quanto la compensazione è prontamente ottenuta da una singola fase di incubazione dopo la colorazione immunofluorescente. Un ulteriore vantaggio dell'agente è la sua viscosità, che rende più facile la gestione del campione durante il montaggio del flusso. I campioni fluorescenti in FUnGI conservano la loro fluorescenza anche se conservati per più mesi a -20 gradi centigradi. Dimostriamo che FUnGI supera gli organoidi non chiariti e il fruttosio-glicerolo nella qualità del segnale fluorescente in profondità nell'organoide (Figura 3A,B) e che gli organoidi cancellati da FunGI hanno un'intensità di fluorescenza complessiva migliorata rispetto agli organoidi non chiariti (Figura 3C).
In sintesi, descriviamo una tecnica di imaging 3D non deducibile e riproducibile per l'acquisizione di dati volumetrici di organoidi immunoelettici. Questo protocollo può essere facilmente utilizzato per immagini di una varietà di organoidi tra cui quelli di origine sia del topo che dell'uomo, da modelli sani e di malattia. La semplice preparazione del campione può essere adattata per facilitare microscopi fluorescenti confocali, multifocali e fogli di luce per ottenere la risoluzione cellulare a subcellulare di interi organoidi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig1.jpg"> Figura 1: panoramica schematica del protocollo di imaging 3D ad alta risoluzione. Gli organoidi vengono recuperati dalla loro matrice 3D. La fissazione e il blocco vengono eseguiti prima dell'immunoetichettazione con anticorpi e coloranti. La compensazione ottica viene ottenuta in un unico passaggio utilizzando l'agente di compensazione FUnGI. Il rendering 3D delle immagini può essere eseguito utilizzando un software di imaging. (A) Panoramica schematica della procedura. (B) Cancellata l'immagine confocale 3D di un organoide colonico umano immunoi labeled for F-actin and E-cadherin (E-cad) (25x oil objective). Barra della scala di 40 m. (C) Cancellato l'immagine confocale 3D con montata intera. Barra della scala di 20 m. (D) Sezione ottica ingrandita di un organoide colonico umano immunoimatichettato per F-actin, E-cadherin (E-cad) e Ki67 (obiettivo olio 25x). Barra della scala di 5 m. Questa cifra è stata modificata da Dekkers et al.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig2.jpg"> Figura 2: L'imaging volumetrico visualizza un'architettura 3D complessa. Immagini confocali che rappresentano set di dati 3D (pannello sinistro), sezioni ottiche 2D (pannello centrale) e aree 3D di un'area ingrandita (pannello destro). (A) Un organoide derivato da una singola cellula basale della ghiandola mammaria del topo che illustra l'organizzazione 3D di cellule basali mammifero allungate che circondano cellule luminali o etichettate per K8/18, K5 e F-actin (compensazione del fruttosio-glicerolo; obiettivo dell'olio 25x). Le barre di scala rappresentano 55 m (pannello sinistro) e 40 m (pannelli centrale e destro). (B) Un organoide del fegato fetale umano con una complessa rete 3D di canaliculi positivi MRP2, etichettati per DAPI, MRP2 e F-actin (compensazione del fruttosio-glicerolo; obiettivo dell'olio 40x). Le barre di scala rappresentano 25 m (pannello sinistro) e 8 m (pannelli centrale e destro). (C) Immagine confocale 3D intera montata di un organoide epatico fetale umano etichettato con DAPI e Ki67 (pannello sinistro) e un'immagine segmentata sul canale DAPI utilizzando un software di imaging (pannello centrale). Barra della scala di 15 m. Grafico tracciato che rappresenta l'intensità media Ki67 in tutte le celle (segmentate DAPI) dell'intero organoide (140 celle) (pannello destro). Questa cifra è stata modificata da Dekkers et al.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig3.jpg"> Figura 3: compensazione ottica degli organoidi con FUnGI. (A) Immagini rappresentative di organoidi colonici umani etichettati con F-actin (verde) e DAPI (grigio) e immagini senza compensazione, cancellate con fruttosio-glicerolo o cancellate con FUnGI (obiettivo olio 25x). Pannello sinistro: rendering 3D dell'organoide. Pannello destro: sezione ottica dell'organoide a 150 m di profondità. Per la condizione "nessuna compensazione" la luminosità dell'immagine doveva essere aumentata rispetto alle condizioni "fructose-glicerrol" e "FUnGI" per visualizzare l'organoide. Barra della scala di 50 m. (B) Adattamento di regressione non lineare che mostra la diminuzione dell'intensità DAPI con l'aumento della profondità di z per diversi metodi di compensazione ottica. I valori rappresentano intensità delle singole cellule rilevate dalla segmentazione DAPI e sono normalizzati all'intensità DAPI media dei primi 50 m dell'organoide. Per evitare di sottovalutare l'attenuazione causata da cellule più luminose sui bordi più profondi e sulle strutture in erba, sono state analizzate solo le regioni centrali degli organoidi. (C) Tre organoidi per condizione di dimensioni e profondità simili verso il coverslip sono stati illustrati utilizzando impostazioni al microscopio identiche. I set di dati 3D completi sono stati segmentati a singola cella sul segnale DAPI per il confronto. Grafico a barre che mostra l'intensità media daPI con diversi metodi di compensazione su set di dati segmentati completi. I dati sono raffigurati come ± SD. I valori sono intensità di &gt;3800 singole celle rilevate dalla segmentazione DAPI. p &lt; 0.0001, test Kruskal-Wallis con test post-hoc a confronto multiplo di Dunn a due lati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Il nostro protocollo può essere utilizzato per visualizzare la complessità strutturale degli organoidi, consentendo la mappatura dell'identità, del solfato e della distribuzione in queste strutture 3D con la risoluzione a cella singola. Il nostro rapido protocollo di tre giorni è completamente ottimizzato per organoidi di varia origine e utilizza una semplice preparazione del campione, che include una fase di compensazione ottica non tossica e un metodo di montaggio a base di silicio. Sebbene il nostro protocollo sia semplice, alcuni di essi sono passaggi critici come la gestione organizzata o la preparazione delle diapositive, possono essere spiegati meglio attraverso la dimostrazione visiva che attraverso il testo.Per recuperare organoidi da 100 a 500 micrometri di diametro coltivati in estratto di membrana basale in 24 piastre di pozzo, lavare ogni saldatura da raccogliere con PBS senza interrompere le matrici 3D e posizionare la piastra sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di soluzione di recupero ghiacciato ad ogni pozzo e posizionare la piastra su uno shaker orizzontale a quattro gradi Celsius per 30-60 minuti. Immergere una pipetta millilitro in una soluzione 1%BSA in soluzione PBS e pipettare su e giù due volte per rivestire ogni punta con BSA.Successivamente, aggiungere cinque millilitri di 1%PBS BSA a un tubo da 15 millilitri per condizione e invertire il tubo da due a tre volte prima di scartare la soluzione, per rivestire l'interno del tubo. Per raccogliere gli organoidi, utilizzare una punta rivestita per sospendere delicatamente il contenuto del pozzo da cinque a 10 volte e estrarre tutti gli organoidi da ogni condizione in un singolo tubo rivestito da 15 millilitri. Risciacquare ogni bene con un millilitro di ghiaccio freddo 1%PBS BSA per assicurarsi che tutti gli organoidi siano stati raccolti e trasferire i lavaggi nei tubi appropriati.Portare il volume finale in ogni tubo fino a 10 millilitri con PBS freddo e sedimentare gli organoidi mediante centrifugazione per ottenere una tavolozza stretta senza uno strato visibile di matrice 3D. Per fissare gli organoidi, utilizzare una punta di pipetta rivestita da un millilitro per sospendere attentamente ogni pellet in un millilitro di para formaldeide ghiacciata e fissare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Sospendere delicatamente gli organoidi a metà del tempo di fissazione.Dopo 45 minuti, aggiungere 10 millilitri di PBS ghiacciato più 20 per ogni tubo e mescolare delicatamente per inversione, prima di posizionare i tubi a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Per bloccare gli organoidi, al termine dell'incubazione, far girare i campioni e sospendere di nuovo i pellet in almeno 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide ghiacciato per pozzo da placcare. Quindi trasferire gli organoidi in singoli pozzi di una piastra di sospensione da 24 pozzali per un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius.Per l'immunoetichettatura aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide in un pozzo di riferimento vuoto e lasciare che gli organoidi si sistemino sul fondo della piastra. Una volta sistemati gli organoidi, inclinare la piastra con un angolo di 45 gradi per consentire la rimozione di tutti i microlitri tranne gli ultimi 200 del tampone di lavaggio. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide contenente gli anticorpi primari di interesse e posizionare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius con lieve dondolo e scuotimento a 40 giri al minuto.La mattina successiva, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio organoide ad ogni pozzo e lasciare che gli organoidi si sistemino sul fondo della piastra per tre minuti. Quando gli organoidi si sono sistemati, rimuovere tutti tranne gli ultimi 200 microlitri da ogni pozzo e lavare gli organoidi con tre lavaggi di due ore con un millilitro di tampone di lavaggio organoide fresco e lieve dondolo e agitazione per lavaggio. Dopo il terzo lavaggio, lasciare depositare gli organoidi nella parte inferiore della piastra per tre minuti prima di rimuovere tutti tranne gli ultimi 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide da ogni pozzo.Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio organoide contenente gli anticorpi secondari appropriati per ogni pozzo per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius con lievi dondolo e scuotimento. La mattina seguente, lavare gli organoidi con tre lavaggi di due ore in un millilitro di tampone di lavaggio organoide fresco per lavaggio, come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 millilitri per pozzo e raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione.Per la pulizia ottica degli organoidi, rimuovere il maggior buffer di lavaggio possibile da ciascun tubo, senza interrompere gli organoidi, e utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri modificata per aggiungere almeno 50 microlitri di FUnGI a ciascun pellet. Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente gli organoidi possono essere conservati fino a una settimana a quattro gradi Celsius o per un massimo di sei mesi a meno 20 gradi Celsius. Per preparare diapositive per l'imaging organoide mediante microscopia confocale, riempire una siringa da 10 millilitri con un sigillante siliconico e attaccare una punta di pipetta da 200 microlitri modificata alla siringa.Utilizzare la siringa per disegnare un rettangolo di uno per due centimetri nel mezzo di una diapositiva e utilizzare una seconda punta di pipetta da 200 microliter modificata per posizionare gli organoidi cancellati al centro del rettangolo. Per posizionare un coperchio scivolare sugli organoidi, posizionare prima il lato sinistro del coperchio, prima di abbassare lentamente il coperchio da sinistra a destra fino a quando non c'è aria intrappolata. Quindi applicare delicatamente la pressione su tutti i bordi del coperchio scivolare per attaccarlo saldamente al sigillante in silicone.Per immaginare gli organoidi, posizionare lo scivolo sullo stadio di un microscopio a scansione laser confocale e selezionare un obiettivo multi immersione 25 X per l'imaging confocale. Impostare il microscopio sulle impostazioni di acquisizione appropriate, selezionando una bassa potenza laser per ridurre lo sbiancamento delle foto. Utilizzate la modalità Z stack per definire i limiti superiori dell'estremità inferiore e impostate la dimensione del passo Z su ottimale.Quando si imagingno strutture organoidi di grandi dimensioni o più organoidi insieme, utilizzare la modalità di piastrellatura con una sovrapposizione del 10% e indicare l'area di interesse. Una volta impostati tutti i parametri, ottenere una rappresentazione di rendering 3D dell'imaging nel software di imaging e ottimizzare le proprietà di luminosità, contrasto e rendering 3D. Quindi esportare istantanee RGB dei risultati come file TIFF.La forza dell'imaging 3D rispetto all'imaging 2D è illustrata da queste immagini di organoidi della ghiandola mammaria del topo che sono stati generati come dimostrato. Lo strato centrale di questi organoidi rappresentativi è costituito da cellule luminali positive K8/K18 di forma colonnare, e lo strato esterno contiene cellule di basilico positive K5 allungate, che ricapitolano la morfologia della ghiandola mammaria in vivo. Questa organizzazione polarizzata è difficile da apprezzare da una sezione ottica 2D dello stesso organoide.Un altro esempio di struttura complessa che è impossibile da interpretare senza informazioni 3D è la rete di canaliculi positivi MRP2 che facilitano la raccolta del fluido biliare degli organoidi epatici umani. Inoltre, la qualità e la risoluzione ottenute consentono la segmentazione semi-automatizzata e l'analisi delle immagini. Pertanto, il numero totale di cellule e la presenza di marcatori possono essere quantificati in specifici sottotipi cellulari in interi organoidi.Segmentando i nuclei di un intero organoide contenente 140 cellule, è possibile identificare tre cellule che mostrano un'alta positività per il marcatore del ciclo cellulare Ki67. L'agente di compensazione ottica, FUnGI, supera le prestazioni non chiare e la compensazione fruttosio-glicerolo nella qualità del segnale fluorescente in profondità all'interno di un organoide. Con gli organoidi cancellati FUnGI che dimostrano un'intensità di fluorescenza complessiva migliorata rispetto agli organoidi non chiari.Si noti che qualsiasi BME avanzi nel campione può comportare una ridotta penetrazione degli anticorpi e può portare a un elevato segnale di fondo. Inoltre, gli organoidi cistica non dovrebbero essere cancellati otticamente se collassano. Con lievi adattamenti al protocollo, i campioni possono essere utilizzati con microscopia confocale, multifocale e foglio luminoso ad alta risoluzione.

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